Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.
Method Article
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Protein LoBind tüpü, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | Hücre lizisi için |
| Protein LoBind tüpü, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | ChIP ve kütüphane hazırlığı için |
| DNA LoBind tüpü, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | ChIP ve kütüphane hazırlığı için |
| 8 şeritli PCR tüpü | BIO-BIK | 3247-00 | ChIP ve kütüphane hazırlığı için |
| SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Sabitleme için hücre tozu yapmak için kullanışlı kriyojenik öğütücü |
| Metal mermi | TOKKEN | SK-100-DLC10 | SK Mill |
| 2 mL paslanmaz çelik boru | aksesuarı TOKKEN | TK-AM5-SUS | Hücre için bir seçenek lizis |
| 2 mL paslanmaz çelik boru tutucu | TOKKEN | SK-100-TL | Hücre lizisi için bir seçenek |
| %16 formaldehit (w/h), metanol içermez | Pierce | 28906 | Hücreleri sabitlemek için. Kullanmadan önce% 1 çözelti hazırlayın. |
| Glisin | Nacalai Tesque | 17109-35 | 2,5 M stok |
| hazırlayın D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | Lizat ve saflaştırılmış DNA'yı yıkamak için |
| HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | Lizis tamponu için 1. 1 M, pH 7.5 stoğu hazırlayın. |
| 5 M NaCl, moleküler biyoloji sınıfı | Nacalai Tesque | 06900-14 | Lizis tamponu 1, Lizis tamponu 2, ChIP Elüsyon Tamponu ve Tris-EDTA-NaCl Tamponu |
| 0.5 M EDTA, moleküler biyoloji sınıfı | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | Lizis tamponu 1, Lizis tamponu 2, ChIP Elüsyon Tamponu ve Tris-EDTA-NaCl Tamponu |
| için Gliserol | Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd. | 072-04945 | Lizis tamponu için 1 |
| NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | Lizis tamponu için 1 |
| Triton X-100, moleküler biyoloji sınıfı | Nacalai Tesque | 12967-32 | Lizis tamponu için 1 |
| Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | Lizis tamponu için 2, ChIP Elüsyon Tamponu ve Tris-EDTA-NaCl Tamponu. 1 M, pH 8.0 stoğu hazırlayın. |
| 0.1 M EGTA pH nötr | Nacalai Tesque | 08947-35 | Lizis Tamponu 2 için |
| Proteaz inhibitörü kokteyli (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | Protein RIPA tamponunun bozulmasını engellemek |
| Thermo Fisher Scientific | 89900 | Hücre lizisi ve yıkama için | |
| milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonikatör tüpü. Odaklanmış ultrasonicator |
| Aksesuarı Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 veya E220 | DNA'yı ChIP-Seq |
| UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | için ChIP Elüsyon Tamponu |
| RNase A | için Nacalai Tesque | 30141-14 | DNA'yı lizat |
| Proteinaz K, rekombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001'den saflaştırmak için | DNA'yı lizat |
| Etanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | % 70 çözelti yapın |
| Sigma-Aldrich | F1804'te | üretilen monoklonal anti-FLAG M2 antikoru | İlgilenilen hücrelerde eksprese edilen kromatini saflaştırmak için |
| Dynabead M-280 Koyun Anti-Fare IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | Bu, anti-FLAG IP ve anti-H3K4me3 IP |
| Anti-tri-metil histon H3 (K4), fare monoklonal antikoru | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | ChIP analizi için çalışan diğer herhangi bir antikor |
| çalışacaktır 10x Bloke Edici Reaktif | Sigma-Aldrich | 11096176001 | Afinite saflaştırması sırasında bloke etmek için |
| Denhardt' s çözeltisi | Nacalai Tesque | 10727-74 | Afinite saflaştırması sırasında bloke etmek için |
| Glikojen (5 mg / ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | DNA'yı lizattan saflaştırmak için |
| Qubit 2.0 Florometre | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | İzole DNA'nın miktar tayini için |
| Qubit dsDNA HS Test Kiti | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | İzole DNA'nın miktar tayini için |
| 0,5 mL tüp | Axygen | 10011-830 | Qubit |
| Fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | Lizattan DNA'yı saflaştırmak için |
| AMPure XP boncukları | Beckman Coulter | A63881 | Kütüphane hazırlığı için SPRI manyetik boncuklar |
| Metal buz rafı | Funakoshi | IR-1 | Hücre lizatını donmuş |
| tutmak içinÖrnek Soğutucu | New England Biolabs | T7771S | Hücreleri minimum hasarla düzeltmeye yardımcı olur |
| 2100 Biyoanalizör | Agilent Technologies | G2939BA | İzole edilmiş DNA parçalarının kalitesini kontrol etmek için. Başka bir parça analizörü kullanılabilir. |
| Biyoanalizör 2100 Uzman Yazılım | Agilent Technologies | G2946CA | Biyoanalizör Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti ile birlikte verilir |
| Agilent Technologies | 5067-4626 | İzole edilmiş DNA parçalarının kalitesini kontrol etmek için | |
| KAPA LTP Kütüphane Hazırlama | Kiti Roche | 07961898001 | 10x KAPA Uç Onarım Tamponu, KAPA Uç Onarım Enzim Karışımı, KAPA A-Kuyruk Tamponu, KAPA A-Kuyruk Enzimi, KAPA Ligasyon Tamponu, KAPA DNA Ligaz ve PEG / NaCl çözeltisi |
| NEXTflex DNA Barkodları | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adaptörü. DNA Barkod Adaptörleri ve Primer Mix ile birlikte verilir. |
| KAPA Gerçek Zamanlı Kütüphane Amplifikasyon Kiti | Roche | 07959028001 | 2x KAPA HiFi HS gerçek zamanlı PCR Master Mix, PCR Primer Mix ve Floresan Standartları ile birlikte verilir |
| 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | . Ek olarak, bu enzim KAPA Gerçek Zamanlı Kütüphane Amplifikasyon Kiti |
| Tamponu için gerekli olabilir EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, DNA |
| 386 kuyulu qPCR plakasının | Gerçek zamanlı PCR için | Thermo Fisher Scientific | 4309849 |
| QuantStudio 7 Flex Gerçek Zamanlı PCR Sistemi | DNA'yı ölçmek için | Thermo Fisher Scientific | 4485701 |
| MicroAmp Optik Yapışkan Film | Gerçek zamanlı PCR | Thermo Fisher Scientific | 4311971 |
| MicroAmp Şeffaf Yapışkan Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | Plaka sızdırmazlığı için |
| Son onarım ana karışımı | 1.4 ve mikro; L 10x KAPA Uç Onarım Tamponu, 1 & L KAPA Uç Onarım Enzim Karışımı ve 1.6 & mikro; L of H2O | ||
| A-taling ana karışımı | 1 & birleştirin; L KAPA A-Kuyruk Tamponu, 0.6 & KAPA A-kuyruk enziminin L'si ve 8.4 & mikro; L H < sub > 2 < / sub >O | ||
| Ligasyon tampon karışımı | Kombine 2 & mikro; L KAPA ligasyon tamponu ve 6 &mikro; L of H2O | ||
| Gerçek zamanlı PCR ana karışımı | Combine 5 & L 2x KAPA HiFi HS gerçek zamanlı PCR Master Mix, 0.35 & L PCR Primer Karışımı (10 & mikro; İleri astar AATGATACGGCACCACCGAG ve ters astar CAAGCAGAAGACGGCATACGAG'ın her biri M) ve 3.15 &mikro; L H2O | ||
| PCR ana karışımı | 10 ve mikroyu birleştirin; L 2x KAPA HiFi Hazır Karışım, 0.9 & L PCR Primer Karışımı ve 0.6 & mikro; L of H2O | ||
| Bütünleştirici Genomik Görüntüleyici | Geniş Enstitüsü | IGV_2.3.88 | Dizileme verilerini görselleştirmek için genom tarayıcısı |
| DNA olgionükleotid: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | promotör bölgesini amplifiye etmek için bir primer | |
| : 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | promotör bölgesini amplifiye etmek için bir astar | |
| GADPH promotör bölgesine karşılık gelen DNA'yı ölçmek için | |||
| Termal Döngüleyici Zar | Takara | TP870 | GADPH promotör bölgesine karşılık gelen DNA'yı ölçmek için |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission