Yöntem makalesi

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

DOI:

10.3791/58298

⸱

23 Ocak 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetik yönetmelik gen ifadesinde merkezi rol oynar. Histon değişiklik 1960'larda keşfetti, fizyolojik ve patolojik fonksiyonları kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Gerçekten de, yeni nesil derin sıralama ve kromatin immunoprecipitation (ChIP) belirli histon değişiklik antikorlar ile bizim görünümü epigenetik Yönetmeliğin genom arasında devrim yarattı. Diğer taraftan, dokular genellikle farklı hücre türleri oluşur ve onların karmaşık karışımı belirli bir hücreye epigenome soruşturma için analitik sorunlar teşkil etmektedir. Biz son zamanlarda kromatin seçici arıtma tagged çekirdek histon proteinleri hücre tarafından dayanmaktadır tandem kromatin immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq), hücre türüne özgü kromatin devlet bir genom geniş şekilde yönelik olarak geliştirilen faiz, ChIP-Seq. tarafından takip türleri Bu iletişim kuralının amacı tChIP-devamı en iyi uygulamalar giriştir Bu teknik için çeşitli histon modifikasyonları ve model organizmalar doku özel epigenome soruşturma çok yönlü bir araç sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan dokuları farklı hücre türleri oluşur. Gen düzenlemesi her hücrede hücre türü tanımlar. Kromatin değişiklikler - DNA metilasyonu ve histon değişikliği - gen ekspresyonu hücre tipi özgüllük altında yatan. Bu nedenle, her hücre tipi epigenetik yönetmelikle ölçülmesi istenen ancak teknik bir mücadele vardı.

Tandem kromatin immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) belirli bir hücreye epigenetik araştırmak için son zamanlarda geliştirilen (resim 1)1yapıldı. TChIP içinde bir hücre türüne özgü organizatörü epitope öğesini çekirdek histon protein H2B ifade edilir. Malzeme çeşitli hücre türlerinin bir karışımını başlar, ancak bu özellik chromatins ilgi, hücrelerden yalıtım sağlar. Aşağıdaki ChIP-Seq — kromatin arınma yolu ile bir değişikliğin histon işareti ve yeni nesil derin sıralama, izole DNA — bir genom geniş şekilde hedeflenen hücre tipi epigenetik durumunu izleyebilirsiniz.

Bu tekniği kullanarak, biz son zamanlarda araştırdık histon H3 protein lizin 4 (H3K4me3), nöron özel trimethylation işaretleri. Bu çalışmada, geliştirdiğimiz bir çakma fare hangi C-ölümcül içinde bayrak öğesini H2B protein Cre-aracılı rekombinasyon (Rosa26CAG floxed-pA H2B-bayrak) ifade edildi. Cre-endoplasmic retikulum (ER) gen CamK2a Düzenleyicinin kontrolü altında sahip bir fare ile geçiş tarafından elde edilen fare çizgi üzerine tamoxifen enjeksiyon (Camk2aH2B-bayrak)1aktif nöron H2B-bayrak indüklenen. Kurulan fare çizgi beyinden başlayarak, biz tChIP-Seq anti-H3K4me3 antikor ile gerçekleştirilen. Bu yana H3K4me3 işaretleri çoğunlukla organizatörü bölgelere karşılık, özellikle nöronlar1' ifade mRNA'ların yüzlerce keşfetmek olabilir.

Burada, doku diseksiyon adımlarına Kütüphane inşaat ()Şekil 1)kapsayan bir tipik tChIP-Seq yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı son tChIP-Seq performansını ve diğer hücre tipleri ve histon değişiklikler bu yöntemin uygulama gelecek için bizim en iyi uygulamaları paylaşmak için hedeftir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm yöntemleri RIKEN (H27-EP071) Emanet bölümü tarafından onaylanmış ve ilgili kurallar ve düzenlemeler yapılmıştır.

1. doku diseksiyon

  1. Küçük parçalar halinde faiz dokuların teşrih (yaklaşık < 3 mm2) güzel bahar makas kullanarak.
    Not: Daha büyük doku parçaları dondurmak için daha uzun sürer ve daha küçük parçalar arabellek, ikisi de sonuçları etkileyebilecek daha büyük birimleri üzerinde taşıyacak.
  2. Sıvı azot ile dolu bir temiz kapsayıcı disseke doku parçaları ekleyin ve onların 2 mL tüpler (tüp başına 1 adet) içine sıvı azot ile dolu toplamak.
    Not: Tüpler hidrofilik yüzey ile bu adım için tavsiye edilir.
  3. -80 ° c > 5 dakika kalan sıvı azot buharlaşır için aç kapaklı tüpler yerleştirin.
    Not: kapağı kapatıldıktan sonra doku parçaları-80 ° C'de kullanmadan önce bir ay depolanabilir.

2. hücre fiksasyon

Not: Biz bu adımı için kullanışlı bir kriyojenik değirmeni kullanılır. Alternatif bir aparat kullanılabilir.

  1. Yer 2 mL-protein düşük bağlayıcı tüpler bir metal buz raf üzerinde doku örnekleri içeren sıvı azot soğutulmuş.
  2. Metal bir kurşun bir 1,5 mL tüp ve chill sıvı azot ile yerleştirin. Metal buz rafa yerleştirin.
  3. 2 mL tüp açın ve prechilled metal mermi tüpün içine yerleştirin. Kapağı kapatın, kullanışlı bir kriyojenik değirmeni tüp yuvasına 2 mL tüpler ayarla ve hemen 1 dk. için sıvı azot içinde birleştirilmiş tüp sahibinin daldırma.
  4. Donmuş tüp sahibi kullanışlı kriyojenik değirmeni dış kaset yerleştirin ve şiddetle çalkalanır 60 kez için 30 s.
  5. Boru tutucu sökmeye metal kurşunu çıkarıp yer 2 mL-tüp bir örneği soğutucu-20 ° C'de prechilled
  6. Örnek bir sonraki adımda sabitleştirici dondurulması önlemek 15 dakika-20 ° C'de soğutucu yerleştirin.
  7. Tezgah için örnek soğutucu getirmek, tüp kapağını açın ve hemen 900 µL % 1 formaldehit içine damla. Birkaç kez pipetting sonra süspansiyon yeni 2 mL tüp 900 µL % 1 formaldehit ve 10 dk 23 ° C'de ayarla bir kuluçka nazik döndürme için düzeltme içeren transfer.
    Dikkat: Formaldehit zehirli ve zararlı olduğunu.
  8. Fiksasyon reaksiyonu durdurmak için 2.5 M glisin 100 µL her tüp ve santrifüj 3000 x g 4 ° C'de 5 dakika için ekleyin Süpernatant atmak.
  9. Buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS), santrifüj, 3000 x g 4 ° C'de 5 min için 1 mL ekleyin ve süpernatant atın. Bu iki kez (Toplam 3 yıkar) tekrarlayın.
    Not: Flash donmuş sıvı nitrojen tarafından ve saklı-80 ° C'de sabit örnekleri olabilir
  10. Lizis arabellek 1 500 µL ekleyin (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (pH 8.0), % 10 w/v gliserol, % 0,5 w/v NP-40, % 0,25 w/v Triton X-100 ve 0.1 x proteaz inhibitörü kokteyl) için Pelet, damlalıklı birkaç kez ve Döndür'ün 4 ° C'de 10 dakika
    Not: Lizis arabellek 1 filtre ve kullanımdan önce 4 ° C'de depolanan gerekir.
  11. 3000 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  12. Lizis tampon 2 1 mL ekleyin (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA ve proteaz inhibitörü kokteyl x 0.1) için Pelet, girdap ve Döndür'ün 4 ° C'de 10 dakika
    Not: Lizis arabellek 2 filtre ve kullanımdan önce 4 ° C'de depolanan gerekir.
  13. 3000 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  14. Radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabelleği 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile 800 µL için Pelet ekleyin ve Pelet pipetting tarafından resuspend.
  15. 3000 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  16. RIPA arabelleği 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile 500 µL ekleyin.
  17. 3000 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  18. 1 mL 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile RIPA tampon ekleyin. Hemen bir sonraki adıma geçin.

3. Kromatin yamultma

  1. Lysate bir sonicator tüp aktarmak ve tüp üzerinde bir ultrasonicator yerleştirin.
  2. Kromatin aşağıdaki ayarlarla kesme: sıcaklık: 4 ° C; tepe olay gücü: 175 W; görev faktörü: % 10; devir/seri çekim: 200; ve Saat: 2400 s.
  3. Örnek bir 1,5 mL-protein düşük bağlama tüp ve santrifüj 20.000 x g 4 ° C'de, 5 min için transfer
  4. Süpernatant yeni bir protein düşük bağlama tüp içine toplamak.
    Not: Örnek olabilir flaş donmuş sıvı azot ve-80 ° C'de depolanan

4. kalite kontrol DNA (ters çapraz)

  1. Mix 20 µL, lysate ve 180 µL çip elüsyon arabelleği (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) ve % 1 w/v Sodyum Lauryl Sülfat (SDS)) bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüp. Örnek bir termal cycler açık termal cycler kapaklı 6 h 65 ° C'de kuluçkaya. Aşırı denatürasyon önlemek için termal cycler aç ağzını tut.
    Not: ChIP elüsyon arabellek filtre ve kullanımdan önce oda sıcaklığında saklanan gerekir. Bu kuluçka gece için genişletilebilir.
  2. 10 mg/ml RNase 1 µL eklemek bir, girdap ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
  3. 15 mg/ml 6.5 µL eklemek İndinavir K, girdap ve 60 dk 55 ° C'de kuluçkaya.
  4. Bir DNA düşük bağlama tüp için tepki aktarmak, 5 mg/mL glikojen ve girdap 4 µL ekleyin. Daha sonra fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) ve 5 min için santrifüj 200 µL 18.000 x g oda sıcaklığında de ekleyin.
  5. Süpernatant yeni bir DNA düşük bağlama tüp aktarın. Tris-EDTA-NaCl arabelleği 200 µL ekleyin (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) ve 200 mM NaCl) kalan fenol/kloroform/izoamil alkol çözümü ve santrifüj 18.000 x g oda sıcaklığında, 5 min için. Süpernatant toplamak ve ilk süpernatant ile karıştırın.
  6. Buz gibi soğuk etanol 900 µL ekleyin ve 1 h-20 ° C'de için kuluçkaya
    Not: Bu kuluçka 4 - 6 için s uzatılabilir.
  7. 18.000 x g 4 ° C'de de 30 dk santrifüj
  8. Süpernatant atmak. Pelet ve 18.000 x g 4 ° C'de de 30 dk santrifüj buz gibi % 75 etanol 1 mL ekleyin (Toplam iki yıkar) bu adımı yineleyin.
  9. İyice süpernatant atın ve oda sıcaklığında 1 dakika kuruması.
  10. Tris-EDTA (TE) arabelleği 50 µL ekleyin ve DNA bu 30 dakika oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçka tarafından çözülür. Vortexing veya pipetting kaçının. Bu DNA'yı "giriş" olarak tutmak ve gerekirse Kütüphane hazırlık için kullanabilirsiniz.
  11. DNA toplama bir yer üreticinin yönerge göre ölçü ( tablo malzemelerigörmek) ve boyut dağılımı ile bir mikrosıvısal Elektroforez makine kontrol edin (bkz: Şekil gösterilen temsilcisi verileri 2A). kullanım 10 ng veya daha az DNA bu tahlil için.
    Not: 100-500 baz çifti (bp) parçaları % 50 veya daha fazla DNA'ın yukarı yapmak gerekir.

5. benzeşme arıtma Anti-bayrak antikor tarafından

Not: nöron tChIP-Seq için 8 fareler dokulardan beyin genellikle tChIP-Seq bir örneği için 2 hazırlamak için kullanılan ng tandem bağışıklık-arıtma tarafından saf DNA'ın (bkz. Adım 7.1). Bizim ellerde 0.1 ng sağlanan DNA hala yüksek kaliteli DNA kitaplıkları için ChIP-Seq (Kadota, yayınlanmamış). Böylece, teorik olarak, tek bir fare nöron tChIP-Seq. gerçekleştirmek için yeterli olabilir Gerekli miktar faiz doku ve hücre türü için optimize edilmelidir. İmumuno-arıtma deney negatif kontrol için beyin dokusu lysate herhangi bir H2B-bayrak ifade olmadan fare üzerinden hazırlanan ve kullanılan.

  1. Koyun Anti-fare immünoglobulin G (IgG) bir protein düşük bağlama tüp içine Birleşik manyetik boncuklar 200 µL pipet.
  2. Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve netlik süpernatant 1 dakika bekleyin. Süpernatant atmak, buz gibi PBS ve girdap 1 mL ekleyin. (Toplam iki yıkar) bu adımı yineleyin.
  3. 1 mg/mL Anti-bayrak antikor 20 µL ekleyin ve 4 ° C'de 5 h için döndürün
    Not: Bu kuluçka gece için genişletilebilir.
  4. Adım 5.2 takip boncuk yıkayın. Boncuk 15 mL tüp içine yerleştirin.
  5. Boncuk RIPA arabellek 1110 µL içinde resuspend ve 10 engelleme reaktif, 180 Denhardt'ın çözüm x 50 µL, proteaz inhibitörü kokteyl x 100 10 µL ve adım 3'te hazırlanan lysate 6.8 mL x 900 µL ekleyin. Bu karışımı 5 protein düşük bağlayıcı tüpler içine bölünmüş. 4 ° C'de 6 h için döndürme
    Not: Bu kuluçka gece için genişletilebilir.
  6. Tüp manyetik stand üzerine yerleştirin ve netlik süpernatant 1 dakika bekleyin. Süpernatant atmak, RIPA arabellek 1 mL ekleyin ve karışımı yavaşça. Bu adım 5 kez tekrarlayın (Toplam 6 yıkar). Tüm boncuklar bir tek protein düşük bağlama tüpüne havuz.
  7. ChIP elüsyon arabelleği 200 µL ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında döndürün. DNA'ın kalite kontrol edin (bkz. Şekil 2B ve Cgösterilen temsilcisi veriler) 4.11. adımda açıklandığı gibi. Hemen bir sonraki adıma geçin.

6. benzeşme arıtma Anti-H3K4me3 antikor ve ters çapraz

Not: Adımları (6.1-6.4)-meli var olmak kılınmak önce adım 5,7 aşağıdaki boncuk hazırlık.

  1. Manyetik boncuklar 2 mL-protein düşük bağlama tüp içine koyun Anti-fare IgG için Birleşik 40 µL pipet.
  2. Tüp manyetik stand üzerine yerleştirin ve netlik süpernatant 1 dakika bekleyin. Süpernatant atmak, buz gibi PBS 1 mL ekleyin ve karışımı yavaşça. (Toplam iki yıkar) bu adımı yineleyin.
  3. 1 mg/mL anti-H3K4me3 antikor 4 µL ekleyin ve 4 ° C'de 6 h için döndürün
  4. Adım 6.2 takip boncuk yıkayın. Boncuk 2 mL-protein düşük bağlama tüp içine yerleştirin.
  5. Boncuk RIPA arabellek 1558 µL içinde resuspend ve reaktif, 50 Denhardt'ın çözüm x 40 µL, 2 µL proteaz inhibitörü kokteyl x 100 ve üzerinde adım 5.7 hazırlanan eluate 200 µL engelleme x 10 200 µL ekleyin. Gecede 4 ° C'de döndürmek
    Not: SDS çip elüsyon arabelleğinde 10 kereden daha fazla bu kuluçka düşürülmüştü.
  6. Tüp manyetik stand üzerine yerleştirin ve netlik süpernatant 1 dakika bekleyin. Süpernatant atmak, RIPA arabellek 1 mL ekleyin ve karışımı yavaşça. 4 kez bu işlemi tekrarlayın (Toplam 5 yıkar). Son yıkama sonra boncuklar bir DNA düşük bağlama tüp içine aktarmak ve süpernatant atın.
  7. ChIP elüsyon arabelleği 200 µL ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında döndürün. Eluate yeni bir DNA düşük bindingTube aktarın.
    Not: Eluate-80 ° C'de saklanabilir
  8. Adım 4 DNA'ın decrosslinking için izleyin. Saf DNA TE arabellek 20 µL içinde resuspend.
  9. DNA'ın kalite kontrol edin (bkz. Şekil 2Bolarak gösterilen temsilcisi veriler) 4.11. adımda açıklandığı gibi. (isteğe bağlı) Kantitatif PCR ile zenginleştirme analiz gerçekleştirmek2daha önce açıklandığı gibi. Panolarında veya büyük zenginleştirme gözlenen.

7. Kütüphane İnşaat

  1. Her girdi ve çip DNA örneği için DNA mikrosıvısal Elektroforez makine için yazılım smear analiz işlevini kullanarak 100-500-bp bölgedeki oranı hesaplar. 2'yi edinmek için gerekli numune hacmi tahmin ng 100-500 BP DNA. 20 ng DNA 100-500-bp aralığında "giriş" örnek olarak kullanın.
  2. DNA örnekleri 8-şerit PCR tüpler içine pipet ve DNA hacmi 10 µL, orantılı olarak ölçek-up aşarsa, toplam hacim 10 µL. için (isteğe bağlı) getirmek için H2O aşağıdaki bitiş-onarım tepki ve boyut seçimi ekleyin.
  3. Son onarım ana karışım hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek). Son onarım ana mix 4 µL DNA'yı ekleyin ve 20 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
  4. 10 mm Tris-Cl, pH 8,5 36 µL ekleyin ve tersinir immobilizasyon (SPRI) manyetik boncuklar faz ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya 0.6 x Ses (30 µL) katı.
  5. Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatant temiz hale gelinceye kadar bekleyin.
  6. Yeni bir tüp süpernatant transfer 1.2 x (60 µL) hacimleri SPRI manyetik boncuklar eklemek ve oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya.
  7. Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatant temiz hale gelinceye kadar bekleyin.
  8. Boncuk 200 µL % 80 ile iki kez yıkayın alkol, tüp mıknatıs hala üzerinde tutarak.
  9. Kısa bir süre kalan alkol alt toplamak ve geri üzerinde mıknatıs yerleştirmek için tüp santrifüj kapasitesi. Artık alkol iyice kaldır.
  10. Tüp kapak alkol buharlaşır izin vermek 1-2 min için açık bırakın.
  11. Kapağı kapatın ve tüp buz üzerinde tutun.
    Not: Şimdi boyutu seçili DNA 100-500 BP boncukları üzerinde almış. Çift boyut seçimi hakkında daha fazla bilgi (www.beckman.com) üreticinin Web sitesinde bulunabilir.
  12. A-takip ana hazırla ( Tablo malzemelerigörmek) karıştırın.
  13. Boncuk (Kimden adım 7,10) A-takip ana mix 10 µL ile resuspend ve 30 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
  14. 1.8 x birim (18 µL) Polietilen glikol (PEG) eklemek / NaCl çözüm ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  15. DNA arındırmak için 7.7-7,11 adımları izleyin.
  16. Tüp ligasyonu arabellek karışım hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek).
  17. Tüp ligasyonu arabellek Mix (Kimden adım 7,14) boncuk üzerine 8 µL pipet, 1 µM bağdaştırıcısının 1 µL eklemek ve boncuk resuspend. 5 µM bağdaştırıcısının 1 µL giriş örneği için kullanmak. Çoğullama için her örnek için farklı bağdaştırıcıları kullanmayı düşünün.
  18. DNA ligaz 1 µL ekleyin ve 20 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
  19. Boncuk resuspend ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya 1.0 x birim (10 µL) PEG/NaCl çözeltisi ekleyin.
  20. DNA arındırmak için 7.7-7.10 adımları izleyin.
  21. 10 mm Tris-Cl, pH 8,5 tüp içine 25 µL pipet ve boncuk resuspend.
  22. 1.0 x (25 µL) hacmi PEG/NaCl çözüm ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  23. DNA arındırmak için 7.7-7.10 adımları izleyin.
  24. 10 mm Tris-Cl, pH 8,5 tüp içine 11 µL pipet ve boncuk resuspend.
  25. Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatant temiz hale gelinceye kadar bekleyin.
  26. Süpernatant yeni 8-şerit PCR tüp içine toplamak.
  27. Gerçek zamanlı PCR ana karışım hazırlamak (malzeme Ayrıntılar için bakınız).
  28. Gerçek zamanlı PCR ana Mix 384-şey kantitatif PCR (qPCR) plaka 8,5 µL pipet ve bağdaştırıcının 1,5 µL DNA'dan (adım 7.26) tane ekleyin.
  29. Boş Wells floresan her standart 10 µL pipet.
  30. Aşağıdaki programı ile gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek: (98 ° C 45 için s) 1 döngüsü, x (98 ° C 15 s, 30 60 ° C s, 30 72 ° C s) x 20 döngüleri, ve (72 ° C 60 s) x 1 döngüsü.
  31. PCR döngüleri floresan Standart 2 floresan yoğunluğu ulaşmak için gereken sayısını belirleyin.
  32. PCR ana hazırla ( Tablo malzemelerigörmek) karıştırın.
  33. 11,5 µL PCR ana karışımı içine (Kimden adım 7.26) kalan bağdaştırıcısı bakmaksızın DNA pipet ve PCR adım 7.31 belirlenen PCR çevrimleri ile adım 7,30 içinde belirtildiği şekilde gerçekleştirin.
  34. 1.0 x (20 µL) hacmi PEG/NaCl çözüm ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  35. DNA arındırmak için 7.7-7.10 adımları izleyin.
  36. 10 mm Tris-Cl, pH 8,5 tüp içine 20 µL pipet ve boncuk resuspend.
  37. Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatant temiz hale gelinceye kadar bekleyin.
  38. Süpernatant yeni 1,5 mL-DNA düşük bağlama tüp içine toplamak.
  39. Kütüphanede kalitesini kontrol edin (bkz: 2E ve F rakamgösterilen temsilcisi veri) 4.11 adımda açıklandığı gibi. Kütüphane DNA örneği 1 µL kullanın. (isteğe bağlı) 2daha önce açıklandığı gibi qPCR tarafından zenginleştirme çözümlemesi gerçekleştirin. Panolarında veya büyük zenginleştirme gözlenen.

8. sıralama

  1. Yeni nesil sekanslama kitaplıklarda sıra (bkz: Şekil 3' te gösterilen temsilcisi veri).
    Not: Veri analizi için yeterli sıra derinliği organizma3genom boyutuna bağlı olarak değişir. İnsan ve fare, biz tavsiye almak en az 20-40 milyon tek taraflı kenar defa okundu. Çoğullama okuma verimini göre uygun maliyetli olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, tandem arıtma kromatin ve DNA Kütüphane hazırlık yeni nesil sıralayıcılar için doku diseksiyon, fiksasyon, hücre lizis tarif. İşlemler sırasında bir birden çok adımı (resim 2), başarılı sıralama anahtarıdır DNA kalitesini test edebilirsiniz. Bir tek nucleosome genellikle 147 bp DNA 4tarafından çevrili beri yamultulmuş DNA o boyutundan daha kısa olmamalıdır. Hemen ultrasonication sonra DNA izole ve bir mikrosıvısal Elektroforez ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim iletişim kuralı H2B bayrak öğesini ifade tamoxifen enjeksiyonu ile indüklenen olduğu fare beynin nöronlar için optimize edildi. H2B ifade, başlangıç doku malzeme ve doku miktarı için kullanılan Rehberleri başarılı tChIP-devamı çok önemli parametreleridir Böylece, bu faktörlerin optimizasyonu ilgi her hücre türü için düşünülmelidir.

Bu protokol için kullanılan yordamlar arasında önemli bir adım 100-500 bp5kromatin uzunluğunu elde etmek için kesme DNA'sı. Genel olar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Iwasaki laboratuvar şekilde alt alta yazılmalıdır eleştirel okuma için tüm üyeleri teşekkür ediyoruz. Bu eser kısmen yenilikçi alanları (#26113005); S.N. ve JP17H05679 sı için bilimsel araştırma için bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir Genç bilim adamları için bir Grant-in-Aid (A) sı için (JP17H04998) Milli Eğitim Bakanlığı, bilim, spor ve kültür Japonya (MEXT); ve Pioneering "Hücresel evrim" ve tüm RIKEN proje "Hastalığı ve Epigenome" RIKEN üzerinden (için S.N. ve sı) projeleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Protein LoBind tüpü, 2 mLEppendorfNo.  0030108132Hücre lizisi için
Protein LoBind tüpü, 1.5 mLEppendorfNo.  0030108116ChIP ve kütüphane hazırlığı için
DNA LoBind tüpü, 1.5 mLEppendorfNo.  0030108051ChIP ve kütüphane hazırlığı için
8 şeritli PCR tüpüBIO-BIK3247-00ChIP ve kütüphane hazırlığı için
SK MillTOKKENSK-200Sabitleme için hücre tozu yapmak için kullanışlı kriyojenik öğütücü
Metal mermiTOKKENSK-100-DLC10SK Mill
2 mL paslanmaz çelik boruaksesuarı TOKKENTK-AM5-SUSHücre için bir seçenek lizis
2 mL paslanmaz çelik boru tutucuTOKKENSK-100-TLHücre lizisi için bir seçenek
%16 formaldehit (w/h), metanol içermezPierce28906Hücreleri sabitlemek için. Kullanmadan önce% 1 çözelti hazırlayın.
GlisinNacalai Tesque17109-352,5 M stok
hazırlayın D-PBS (-)(1x)Nacalai Tesque14249-24Lizat ve saflaştırılmış DNA'yı yıkamak için
HEPESNacalai Tesque02443-05Lizis tamponu için 1. 1 M, pH 7.5 stoğu hazırlayın.
5 M NaCl, moleküler biyoloji sınıfıNacalai Tesque06900-14Lizis tamponu 1, Lizis tamponu 2, ChIP Elüsyon Tamponu ve Tris-EDTA-NaCl Tamponu
0.5 M EDTA, moleküler biyoloji sınıfıWako Pure Chemical Industries, Ltd.311-90075Lizis tamponu 1, Lizis tamponu 2, ChIP Elüsyon Tamponu ve Tris-EDTA-NaCl Tamponu
için GliserolWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd.072-04945Lizis tamponu için 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75Lizis tamponu için 1
Triton X-100, moleküler biyoloji sınıfıNacalai Tesque12967-32Lizis tamponu için 1
TrisNacalai Tesque35406-91Lizis tamponu için 2, ChIP Elüsyon Tamponu ve Tris-EDTA-NaCl Tamponu. 1 M, pH 8.0 stoğu hazırlayın.
0.1 M EGTA pH nötrNacalai Tesque08947-35Lizis Tamponu 2 için
Proteaz inhibitörü kokteyli (100x)Nacalai Tesque25955-24Protein RIPA tamponunun bozulmasını engellemek
Thermo Fisher Scientific89900Hücre lizisi ve yıkama için
milliTUBE 1 mL AFA FiberCovaris520130Sonikatör tüpü. Odaklanmış ultrasonicator
Aksesuarı Focused-ultrasonicatorCovarisS220 veya E220DNA'yı ChIP-Seq
UltraPure 10% SDSThermo Fisher Scientific15553-027için ChIP Elüsyon Tamponu
RNase Aiçin Nacalai Tesque30141-14DNA'yı lizat
Proteinaz K, rekombinant, PCR GradeSigma-Aldrich3115887001'den saflaştırmak içinDNA'yı lizat
EtanolWako Pure Chemical Industries, Ltd.054-07225% 70 çözelti yapın
Sigma-AldrichF1804'teüretilen monoklonal anti-FLAG M2 antikoruİlgilenilen hücrelerde eksprese edilen kromatini saflaştırmak için
Dynabead M-280 Koyun Anti-Fare IgGThermo Fisher Scientific11201DBu, anti-FLAG IP ve anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-metil histon H3 (K4), fare monoklonal antikoruWako Pure Chemical Industries, Ltd.301-34811ChIP analizi için çalışan diğer herhangi bir antikor
çalışacaktır 10x Bloke Edici ReaktifSigma-Aldrich11096176001Afinite saflaştırması sırasında bloke etmek için
Denhardt' s çözeltisiNacalai Tesque10727-74Afinite saflaştırması sırasında bloke etmek için
Glikojen (5 mg / ml)Thermo Fisher ScientificAM9510DNA'yı lizattan saflaştırmak için
Qubit 2.0 FlorometreThermo Fisher ScientificQ32866İzole DNA'nın miktar tayini için
Qubit dsDNA HS Test KitiThermo Fisher ScientificQ32851İzole DNA'nın miktar tayini için
0,5 mL tüpAxygen10011-830Qubit
Fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1)Nacalai Tesque25970-56Lizattan DNA'yı saflaştırmak için
AMPure XP boncuklarıBeckman CoulterA63881Kütüphane hazırlığı için SPRI manyetik boncuklar
Metal buz rafıFunakoshiIR-1Hücre lizatını donmuş
tutmak içinÖrnek SoğutucuNew England BiolabsT7771SHücreleri minimum hasarla düzeltmeye yardımcı olur
2100 BiyoanalizörAgilent TechnologiesG2939BAİzole edilmiş DNA parçalarının kalitesini kontrol etmek için. Başka bir parça analizörü kullanılabilir.
Biyoanalizör 2100 Uzman YazılımAgilent TechnologiesG2946CABiyoanalizör Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti ile birlikte verilir
Agilent Technologies5067-4626İzole edilmiş DNA parçalarının kalitesini kontrol etmek için
KAPA LTP Kütüphane HazırlamaKiti Roche0796189800110x KAPA Uç Onarım Tamponu, KAPA Uç Onarım Enzim Karışımı, KAPA A-Kuyruk Tamponu, KAPA A-Kuyruk Enzimi, KAPA Ligasyon Tamponu, KAPA DNA Ligaz ve PEG / NaCl çözeltisi
NEXTflex DNA BarkodlarıBIOO ScientificNOVA-514101Adaptörü. DNA Barkod Adaptörleri ve Primer Mix ile birlikte verilir.
KAPA Gerçek Zamanlı Kütüphane Amplifikasyon KitiRoche079590280012x KAPA HiFi HS gerçek zamanlı PCR Master Mix, PCR Primer Mix ve Floresan Standartları ile birlikte verilir
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKM2602. Ek olarak, bu enzim KAPA Gerçek Zamanlı Kütüphane Amplifikasyon Kiti
Tamponu için gerekli olabilir EBQiagen1908610 mM Tris-Cl, DNA
386 kuyulu qPCR plakasınınGerçek zamanlı PCR içinThermo Fisher Scientific4309849
QuantStudio 7 Flex Gerçek Zamanlı PCR SistemiDNA'yı ölçmek içinThermo Fisher Scientific4485701
MicroAmp Optik Yapışkan FilmGerçek zamanlı PCRThermo Fisher Scientific4311971
MicroAmp Şeffaf Yapışkan FilmThermo Fisher Scientific4306311Plaka sızdırmazlığı için
Son onarım ana karışımı1.4 ve mikro; L 10x KAPA Uç Onarım Tamponu, 1 & L KAPA Uç Onarım Enzim Karışımı ve 1.6 & mikro; L of H2O
A-taling ana karışımı1 & birleştirin; L KAPA A-Kuyruk Tamponu, 0.6 & KAPA A-kuyruk enziminin L'si ve 8.4 & mikro; L H < sub > 2 < / sub >O
Ligasyon tampon karışımıKombine 2 & mikro; L KAPA ligasyon tamponu ve 6 &mikro; L of H2O
Gerçek zamanlı PCR ana karışımıCombine 5 & L 2x KAPA HiFi HS gerçek zamanlı PCR Master Mix, 0.35 & L PCR Primer Karışımı (10 & mikro; İleri astar AATGATACGGCACCACCGAG ve ters astar CAAGCAGAAGACGGCATACGAG'ın her biri M) ve 3.15 &mikro; L H2O
PCR ana karışımı10 ve mikroyu birleştirin; L 2x KAPA HiFi Hazır Karışım, 0.9 & L PCR Primer Karışımı ve 0.6 & mikro; L of H2O
Bütünleştirici Genomik GörüntüleyiciGeniş EnstitüsüIGV_2.3.88Dizileme verilerini görselleştirmek için genom tarayıcısı
DNA olgionükleotid: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′Eurofins Genomicspromotör bölgesini amplifiye etmek için bir primer
: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′Eurofins Genomicspromotör bölgesini amplifiye etmek için bir astar
GADPH promotör bölgesine karşılık gelen DNA'yı ölçmek için
Termal Döngüleyici ZarTakaraTP870GADPH promotör bölgesine karşılık gelen DNA'yı ölçmek için
için için yeterli boyuta sindirmek 'den saflaştırmak için.Fare , için kullanılabilir. ile miktar tayini için ile birlikte verilir Kütüphane hazırlığı için Kütüphane hazırlığı için elüsyonu için pH 8.5 için GAPDH DNA olgionükleotidinin GAPDH SYBR Premix Ex Taq Takara RR420L'nin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).
  2. Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).
  3. Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
  4. Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).
  5. Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
  6. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  7. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149(2016).
  10. Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).
  11. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kromatin mm nopresipitasyonHiston ModifikasyonuDoku DiseksiyonuKriyojenik tmeFormaldehit FiksasyonuSonikasyon KromatiniAfinite Safla t rma

İlgili makaleler