Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

10.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58299

⸱

8 Ekim 2018

 ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital

Bu makalede

Özet

Burada, içinde bir yetişkin zebra balığı kendi doğal patojen Mycobacterium marinumkullanarak bir iletişim kuralı modeli insan tüberküloz için mevcut. Ayıklanan DNA ve RNA gelen virüslü zebra balığı iç organlarının balıklar ve ana bilgisayarın bağışıklık yanıtı qPCR ile toplam Mikobakteriyel yükler ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Özet

Mycobacterium tüberküloz Şu anda en ölümcül insan patojen 1.7 milyon ölüm ve 10.4 milyon enfeksiyonları her yıl neden olduğunu. Maruz kalma bu bakteri steril bir enfeksiyondan aktif olarak devam eden bir ölümcül hastalık arasında değişen insanlarda geniş hastalığı spektrum neden olur. Asemptomatik, ama bir fulminan hastalık yeniden etkinleştirmek için potansiyele sahip latent tüberküloz, en yaygın biçimidir. Yetişkin zebra balığı ve onun doğal patojen Mycobacterium marinum son zamanlarda Tüberküloz hastalığı geniş spektrumu çalışmaya uygun bir model olduğu kanıtlanmıştır. Önemlisi, spontan gecikme süresi ve yeniden etkinleştirme gibi edinilmiş bağışıklık yanıtı Mikobakteriyel Enfeksiyon bağlamında bu modelde okudu. Bu makalede, biz yetişkin zebra balığı, nükleik asitler Mikobakteriyel yükler ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı kantitatif PCR ile ölçüm için çıkarım için iç organları koleksiyonu deneysel enfeksiyon için yöntemleri açıklanmaktadır. All-in-house-geliştirilmiş, M. marinum -belirli qPCR tahlil DNA olmayan bölme, Uyuyan veya son zamanlarda ölü mikobakteriler Ayrıca algılarken geleneksel kaplama yöntemleri daha duyarlıdır. DNA ve RNA aynı birey ayıklanır, hastalıklı devlet ve ev sahibi ve patojen gen ekspresyonu arasındaki ilişkileri incelemek mümkündür. Tüberküloz için yetişkin zebra balığı modeli böylece konak-patojen etkileşimleri çalışmaya son derece uygun, memeli vivo içinde sistemi olarak kendini göstermektedir.

Giriş

Zebra balığı (Danio rerio) yaygın olarak kullanılan bir hayvan model Biyomedikal araştırma ve ortak omurgalı biyoloji için kabul edilen bir modeldir. Zebra balığı birçok insan hastalıkları modelleme araştırma alanlarına uyarlanmış ve enfeksiyon ve birçok bakteriyel 3 ve viral enfeksiyonlar4 immünolojik araştırmalar kanser1 ve kalp hastalığı2 arasında değişen bozuklukları , 5. Ayrıca, zebra balığı embriyolar rahim gelişimi gelişim biyolojisi6 ve toksikoloji7,8' popüler bir model zebra balığı yaptı.

Araştırma, enfeksiyon biyolojisi, dahil olmak üzere birçok alanda optik şeffaf zebra balığı larva yaygın olarak kullanılır. İlkel makrofajlar algılanan9olduklarında ilk bağışıklık hücreleri 24 saat sonrası döllenme (hpf), içinde görüntülenir. Nötrofil yaklaşık 33 hpf10görünmesini sonraki bağışıklık hücreleri vardır. Zebra balığı larva böylece enfeksiyon erken dönemlerinde ve yokluğunda edinilmiş bağışıklık hücreleri11, doğuştan gelen bağışıklık rolü eğitim için uygulanabilir. Ancak, onun tamamen işlevsel edinilmiş bağışıklık sistemi ile yetişkin zebra balığı ek karmaşıklığı enfeksiyon deneyler için bir katmanı sağlar. T hücreleri çevresinde fertilizasyon123 gün sonrası ve B hücreleri fonksiyonel antikor üretmek mümkün 4 hafta sonrası döllenme13tarafından tespit edilebilir. Yetişkin zebra balığı memeli doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sisteminin ana karşılıkları vardır. Balık immune systems ve insanlar arasındaki temel farklılıklar olduğu gibi lenfoid doku anatomisi antikor isotypes de bulunur. İnsanlar beş15var ise sadece üç antikor sınıflar14, zebra balığı vardır. Kemik iliği ve lenf düğümleri yokluğunda, Birincil lenfoid organlar olarak balık böbrek ve timus16 ve dalak, böbrek ve bağırsak ikincil lenfoid organlara17olarak hizmet vermektedir. Hücreleri, doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık tam onun cephanelik ile bu farklılıklara rağmen yetişkin zebra balığı bir son derece uygun, kullanımı kolay, memeli konak-patojen etkileşim çalışmaları için modeldir.

Zebra balığı son zamanlarda tüberküloz18,19,20,21,22çalışmaya uygun bir model olarak kurulmuştur. Tüberküloz Mycobacterium tüberküloztarafından neden olduğu hava bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü göre tüberküloz1.7 milyon ölümler 2016 yılında neden oldu ve bir tek patojen dünya çapında23tarafından ölüm önde gelen nedenidir. Fareler24,25, tavşan26 ve insan dışı primatlar27 sınırlamaları her yüz ama tüberküloz araştırmasında en iyi bilinen hayvan modelleri vardır. M. tuberculosis enfeksiyonu insan dışı primat modelin insan hastalık en çok benzeyen, ancak bu modeli kullanan ciddi Etik kaygılar nedeniyle sınırlıdır. Diğer hayvan modellerinde M. tüberküloz hastalığı patoloji etkileyen ana bilgisayar-özgüllük tarafından engel. Tüberküloz modelleme içinde en büyük sorunu insan hastalığında enfeksiyon ve hastalık sonuçları geniş yelpazede olmalı: tüberküloz dokunulmazlık gizli, aktif ve yeniden etkinleştirilen enfeksiyona28 sterilize arasında değişen çok heterojen bir hastalık olduğunu , hangi çoğaltmak ve deneysel model zor olabilir.

Mycobacterium marinum M. tuberculosis ile % 85 amino asit kimlik29~ 3.000 orthologous proteinler ile yakın akrabası olduğunu. M. marinum doğal olarak granülom, tüberküloz, kendi iç organları19,30işaretlerinden üreten zebra balığı bozar. Tüberküloz araştırmalarında kullanılan hayvan modellerin aksine zebra balığı birçok yavrular üretir, yalnızca sınırlı bir alan için ve önemlisi, neurophysiologically az gelişmiş omurgalı tüberküloz modelin kullanılabilir olduğunu. Ayrıca, M. marinum enfeksiyon latent enfeksiyon, aktif hastalık veya hatta sterilizasyon Mikobakteriyel Enfeksiyon yakından spektrum hastalığı sonucu insan tüberküloz19, taklit eden yetişkin zebra balığı neden olur 31 , 32. burada, M. marinum karın boşluğuna enjekte ve Mikobakteriyel yükler ve zebra balığı bağışıklık yanıtlarını ölçmek için kantitatif PCR kullanarak yetişkin zebra balığı deneysel tüberküloz modeli için yöntemleri tarif doku örnekleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm zebra balığı deneylerin hayvan deney kurulu Finlandiya (ESAVI/8245/04.10.07/2015) tarafından onaylanmıştır. Yöntemleri Yasası (497/2013) ve Finlandiya bilimsel veya eğitim amacıyla kullanılan hayvanların korunması hükümet Kararnamesi (564/2013) göre gerçekleştirilir.

1. kültür, Mycobacterium marinum

Not: Mycobacterium marinum bir patojen yüzeysel enfeksiyon insanlarda neden yeteneğine olduğundan, bu bakteri ile çalışmaya başlamadan önce biohazard atık bertaraf ve kişisel güvenliği yerel yönergeleri öğrenin.

  1. Kültür M. marinum 7 H 10 üzerinde plaka en az 5 gün için OADC (oleik asit, albümin, dekstroz, katalaz) zenginleştirme ve % 0,5 v/v gliserol 29 ° c, % 10 ile desteklenmiştir. M. marinum kültürler taze bakteri dondurucudan alarak her iki hafta ve her hafta yeni bir tabağa aktarma korumak.
    Not: M. marinum sucul türler bulaşmasını doğal balık patojen ve zebra balığı stokları bakteri ile kontamine değil için önlemler almak önemlidir. Virüslü zebra balığı ve bakteri ile kontamine öğeleri yetiştirme tesislerinden ayrı tutulması gerek.
  2. Steril 1 µL aşılama döngü aseptik bir loopful M. marinum bakteri kütlesinin 7 H 9 10 mL içeren bir hücre kültür şişesi aktarmak için kullanmak % 10 ADC (albumin, dekstroz, katalaz) zenginleştirme, %0,2 v/v polysorbate 80 ve %0,2 v/v ile orta gliserol. Kültür yaklaşık bir OD600 (optik yoğunluk) 0.7 sallayarak olmadan karanlıkta 29 ° C'de 3-4 gündür. Kap gevşek bırakın veya bir filtre kapağı gazlar yeterli alışverişi için izin vermek için kullanın.
    Not: Polysorbate 80 toplama bakterilerin önlemek için orta olarak eklenir. Buna ek olarak, ışığa maruz kalma fenotipik değişiklikler bakteri kolonileri (Örneğin, beyaz sarı renk değişiklikleri) yol açar. Bunu önlemek için kültürler karanlıkta bırakın.
  3. OD600değeri ile spektrofotometre ölçmek. 0,07 – 0,09, OD600 sıvı kültür sulandırmak ve sallayarak olmadan karanlıkta 29 ° C'de 2 gün boyunca kültür devam edin. Kap gevşek bırakın.
    Not: Bu iki gün boyunca, yaklaşık 0,5 karşılık gelen erken bir log fazı için bir OD600bakteriyel süspansiyon ulaşacak.

2. yetişkin zebra balığı bulaşmasını için hazırlanması bakteriyel çözüm

  1. Bakteriyel süspansiyon büyük bir steril küvet veya bir 15 mL tüp aktarmak ve en büyük kümeleri yerleşmek izin vermek 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta yerleştirin.
  2. En iyi 5 – 7 mL süspansiyon temiz bir tüp veya bir küvet aktarmak ve OD600ölçmek. Bu üst aşama süspansiyon enfeksiyonlar için kullanın.
  3. M. marinum kültürünün 1 mL taze tüp ve 10.000 x gde 3 dk santrifüj içine toplamak. Süpernatant kaldırmak ve pelet 1 mL steril 1 x PBS resuspend.
  4. Seyreltik steril 1 kullanarak istenen bakteriyel toplama ulaşmak için PBS 0.3 mg/mL fenol kırmızı bir izleyici olarak x. Seyreltilmiş süspansiyon üç aliquots bölün.
    Not: CFU (koloni oluşturan birimler) vs önceden belirlenmiş bir OD600 kullanın / µL eğrisi seyreltme tahmin etmek için gerekli içinde 5 µL enjeksiyon cilt34aranan bakteri sayısını bulmak için. OD600 ve bakteriyel süspansiyon konsantrasyon arasındaki ilişkiyi gerçek enfeksiyon deneyler başlamadan önce doğrulanması gerekiyor. Bu doğrulama veri toplamak için iki hafta saklıdır.
  5. 1 mL şırınga kullanarak, yavaş yavaş çekme yoluyla 27 G süspansiyon iğne 3 x. Her aliquot için kullanmadan önce bu adımı gerçekleştirin.
    Not: aynı bakteriyel çözüm daha 2 h için kullanmayın.

3. deneysel mayi enjeksiyon ile M. marinum enfeksiyon

  1. Parafilm film bir parça üzerine bakteriyel seyreltilmiş çözeltinin 5 µL damlacık pipette ve damlacık 30 G insülin iğne çek.
  2. 5-8 ay kullanın-eski vahşi tipli balık ve deney için rag1−/−hu1999 mutant balık. Tank su %0.02 3-aminobenzoic asit etil ester (pH 7,0) ile yetişkin zebra balığı anestezi. Balık ventral tarafta bir yarık nemli bir köpük plastik üzerinde içine konumlandırın.
    Not: bez-/- mutant balık somatik rekombinasyon geçmesi ve fonksiyonel T ve B hücreleri üretmek mümkün değildir.
  3. İğne pelvik yüzgeçleri arasında enjekte bir yaklaşık 45 derecelik açıyla. Yukarı doğru tüm açılış karın boşluğu içinde gözlemlemek için iğne açılış tutun. Yavaş yavaş bakteriyel süspansiyon enjekte ve iğne dikkatli bir şekilde çıkarın.
    Not: kırmızı izleyici enjeksiyon üzerine balık dışarı sızması durumunda, deneyden balık hariç.
  4. Hemen sonra enjeksiyon, balık taze tank su ile bir kurtarma tankı içine aktarın.
  5. 7H 10 bakteriyel uzaklaştırılmış örnekleri almak her 15dk kullanımda aliquot bakteriyel üzerinden tabaklar ve bakteri 29 ° C'de 5 gün kuluçkaya ve enfeksiyon doz plakaları kolonileri sayarak doğrulayın.
  6. Balık iyi olmak düzenli olarak kontrol edin ve herhangi bir balık üzerinde %0,02 ile enfeksiyon belirtileri olan ötenazi 3-aminobenzoic asit etil ester (pH 7,0) konsantrasyon.
    Not: Yaklaşık olarak, Yetişkin zebra balığı % 7'si ile 34 ± 15 CFU enfekte ve zebra balığı % 30'u 709 CFU 2029 ± ile enfekte belirtiler tarafından 8 hafta19sahip olmuş olacak. Semptomlar anormal yüzme, dokunmatik, nefes nefese, ödem veya gözlemlenebilir boşa yanıt eksikliği yer alabilir.
  7. Zebra balığı ortak standartlar35göre korumak.

4. iç organları topluluğu

  1. 3-aminobenzoic asit etil ester (üzerinde %0,02 konsantrasyon, pH 7,0) su tankı içinde aşırı dozda ile zebra balığı ötenazi.
  2. Bir PIN posterior branchiostegal ışınları ve başka kuyruk platformu üzerine balık çakmak için aracılığıyla ekleyin.
  3. Bütün karın boşluğu neşterle açmak ve iç organların küçük kaşık ve keskin uçlu cımbız kullanarak toplama. Yürekten başlayıp kuyruk bir blok tüm iç organlar ayırmak için doğru omurga boyunca çalışın.
    Not: tüm böbrek doku sırt boyunca kaşıkla kazıma toplamak emin olun.
  4. Son olarak, cımbız gut lağım yanındaki bağlantısını kesin ve organları altı 2.8 mm seramik boncuklar ile 1,5 mL homojenizasyon tüp içine aktarmak için kullanın. Hemen kuru-örnek dondurmak için buza koyun. Örnek-80 ° homojenize oluncaya kadar C saklanır.
  5. % 70 etanol bireyler arasındaki aletlerimle durulayın.

5. homojenizasyon ve RNA bir organ blok çıkarma.

Not: Yöntem Stanford Üniversitesi iletişim kuralları36değiştirilir.

  1. Guanidin thiocyanate-fenol çözüm nükleik asit çıkarma (Tablo reçetesi) için kullanılan bir toplam hacmi 1500 µL. için üst kısmında örnek eklemek örnek en fazla toplam hacminin % 10 kapsar emin olun.
    Dikkat: Beklenen hasat doku 100 µL. guanidin thiocyanate-fenol çözüm toksik içerir ve rahatsız edici maddeler ve birleşimler ve koruyucu giysiler, nitril eldiven ve bir duman mahallede çalışma gerektirir birimdir. Bu zehirli gazlar oluşumuna neden olur gibi çamaşır suyu ile birleştirmek değil. Malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) kullanmadan önce okuyun.
  2. Boncuk atan homogenizer 3 kez 40 için kullanarak örnekleri homojenize 3200 devirde s. Serin buz 30 s döngüleri arasında. Homojenize örnekleri 9 min için bir su banyosunda solüsyon içeren temizleyicide.
  3. 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnekler santrifüj kapasitesi ve temizlenen homogenate 1000 µL taze microcentrifuge tüp içine taşıyın.
  4. Kloroform 200 µL eklemek, hemen 15 vortexing tarafından mix s ve oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
    Dikkat: Kloroform bir toksik ve tahriş edici bileşik Eğer inhale, yuttu ya da cilt veya gözlerle temas. Bir duman mahallede iş ve kişisel koruma için gerekli güvenlik donanımları kullanabilirsiniz. Malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) kullanmadan önce okuyun.
  5. 12.000 x g 4 ° C'de sulu ve organik aşamaları ayırmak için 15 dakika, santrifüj kapasitesi.
  6. Dikkatle, üst aşaması 500 µL RNA kirletici önlemek için taze bir tüp aktarın. Çıkarın ve sulu faz (~ 100 µL) geri kalanını atmak ve interfaz ve Organik faz 4 ° C'de DNA ekstraksiyon için saklayın.
    Not: Üst aşama RNA içerir.
  7. 2-propanol 500 µL ve hemen vortexing tarafından RNA çökelti 15 s. Incubate için oda sıcaklığında 10 dakika karıştırın.
  8. 12.000 x g 4 ° C'de RNA cips için 10 dk de santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipetting tarafından kaldırın.
  9. % 75 etanol ve girdap 10 için 1 mL ekleyin s.
    Not: Burada protokol duraklatılmış ve örnekleri gecede 4 ° C'de muhafaza
  10. 4 ° C'de 5 min için 7.500 x g , santrifüj Süpernatant pipetting tarafından kaldırın.
  11. 5.9-5.10 yıkama adımları yineleyin. Süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın pipetting tarafından ve izin Pelet kuruması duman mahallede.
  12. RNA Pelet 500 µL nükleaz ücretsiz su içinde dağıtılması ve buz üzerinde örnekleri tutmak. Konsantrasyonları microvolume Spektrofotometre ile veya eşdeğer ekipman ile ölçmek. RNA-80 ° C'de depolayın

6. ortak ayıklanan zebra balığı ve Mikobakteriyel DNA saflaştırılması

  1. Guanidin thiocyanate (son konsantrasyonu 4 M), 118.2 g sodyum sitrat 3.68 g çözülerek tekrar ayıklama arabellek (Larabida) hazırlamak (son konsantrasyonu 50 mM) ve 30.29 g Tris ücretsiz Bankası (son konsantrasyonu 1 M) 120 mL su (Bu Mayıs nükleaz ücretsiz'çalışma gecede karıştırma gerektirir). Su nükleaz içermeyen bir son toplam hacmi 250 mL ve filtre çözümü sterilize etmek için ekleyin.
    Not: Bu arabellek oda sıcaklığında 6 aya kadar muhafaza edilebilir. Hidroklorik asit ve hidrojen siyanür gibi zehirli gazlar üretmek için tepki olarak Larabida çamaşır suyu ile birleştirmek değil.
  2. Interphase ve örnek Organik faz Mikobakteriyel DNA ayıklamak için kullanın. Larabida 500 μL her tüp için ekleyin. Oda sıcaklığında INVERSION tarafından kapsamlı bir şekilde 10 dakika karıştırın.
  3. 12.000 x g için oda sıcaklığında 30 dk de tüpler santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir şekilde yeni bir tüp için DNA içeren üst sulu faz 500 µL aktarın.
  4. 2-propanol 400 μL ekleyin. Ters çevirme tarafından mix ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
  5. Örnekleri, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi DNA içeren bir Pelet bu noktada görünür olmalıdır. Dikkatli bir şekilde süpernatant pipetting tarafından çıkarın.
  6. % 70 etanol 800 μL ekleyin. Pelet INVERSION tarafından yıkayın. Genomik DNA kolayca yıkar değil girdap örnekleri bu noktada, yap.
  7. Örnekleri, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant pipetting tarafından kaldırın. Etanol yıkama (adım 6,6 ve 6.7) yineleyin.
  8. Etanol pipetting tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın. 5-10 dk. dağıtılması için 200 μL nükleaz ücretsiz su Pelet örnekleri kurumasına izin verin.
  9. DNA konsantrasyonları microvolume Spektrofotometre ile veya eşdeğer ekipman ile ölçmek. DNA 4 ° C'de veya uzun süreli depolama için-20 ° C'de muhafaza edilebilir.

7. kantitatif PCR Mikobakteriyel yükler ölçmek için

  1. QPCR reaksiyon karışımları ile no-ROX (carboxy-X-rodamine) M. marinum iç kopya etmek rondela (ITS) arasında 16S-23S ITS MMITS1 astar (Tablo 1) ile üretici yönergelerine göre karşı hazırlamak. Reaksiyon mix pipette ve çoğaltmaları 96-şey tabakta qPCR için uygun olarak dilutions örnek. Bilinen bir miktar bakterilerin DNA Standart seyreltme dizi her vadede içerir.
    Not: Beklenen M. marinum yük balık başına 1.000.000 CFU 4 TEFE, 0 CFU aralığı. QPCR tahlil da diğer qPCR kitleri ile gerçekleştirilir ama tavlama sıcaklığı astar için yeniden en iyi duruma getirilmiş olmalı.
  2. Optik şeffaf bir film ile plaka mühür ve 2.000 x g 4 ° C'de 2 min için plaka santrifüj kapasitesi
  3. Tablo 2' de gösterilen qPCR programını çalıştırın.
  4. Standart eğri kullanarak, tüm balık bakteriler sayısını hesaplayın.

8. DNaz tedavi RNA örnekleri

  1. Herhangi bir olası kalan iz genomik DNA RNA kaldırmak için yürütmek DNaz ben tedavi. RNA örnekleri buz çözme.
    Not: yalnızca RNase free ekipman ve çözümleri kullanın ve çalışma yüzeyi ve Pipetler ile çalışmaya başlamadan önce RNases (Malzeme tablo) ortadan kaldırarak bir dekontaminasyon reaktif emin olun. Uzun kollu önlük ve örneklerini korumak için eldiven giymek.
  2. 10 μL hazırlamak DNaz ben buz üretici yönergelerine göre reaksiyon karışımları. En fazla 1 μg RNA'ın da dahil olmak üzere, 10 DNaz arabellek x 1 μL ve RNA'ın 8 μL örnek DNaz karışım 1 μL.
  3. Yavaşça reaksiyonlar (vortexing) mix ve 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
  4. Isı-inactivation önce 50 mm EDTA 1 µL 10 µL örnekleri ekleyin. EDTA eklenmezse, RNA ısıtıldığında kimyasal bozulması geçirecek.
  5. 10 dk 65 ° c ısı-ı. DNaz devam doğrudan cDNA sentezi için devre dışı bırakın veya-80 ° C'de DNaz tedavi RNA saklamak için kuluçkaya

9. cDNA sentezi

  1. Tüm reaktifler ve buz üzerinde örnekleri tutmak ve üreticinin yönergelerine göre reaksiyon karışımları hazırlamak. 5 μL tepki karışımı için Ters transkripsiyon Master Mix 1 μL dahil, 3 μL nükleaz ücretsiz su ve 1 μL DNaz tedavi RNA.
  2. Karışımı yavaşça ters transkripsiyon reaksiyonlar ve kısaca Tüp, gerekirse spin.
  3. Örnekleri bir PCR makine ve Tablo 3' te gösterilen programı kullanın.
  4. CDNA nükleaz ücretsiz su qPCR 2.5 ng/μL, maksimum konsantrasyon için gerekirse sulandırmak. cDNA-20 ° C'de depolanan

10. ölçüm zebra balığı gen ekspresyonu kantitatif PCR ile

  1. QPCR ana karışımı buz üreticinin yönergelerine uygun olarak hazırlamak ve ışıktan korumak. Tablo 1' de tanıtılan astar kullanın.
    Not: kapaðý indüksiyon her gen için hesaplamak için Ayrıca bir havuza alınan temel örnek 6 sağlıklı zebra balığı çıkarılan ifadeden ölçün.
  2. Her örnek çoğaltır hazırlamak ve qPCR plaka üzerine reaksiyon karışımları pipette. Optik şeffaf bir film ile plaka mühür ve plaka 2000 x g 4 ° C'de 2 min için de çalışma başlamadan önce santrifüj kapasitesi.
  3. QPCR çalıştırmak kullanılan astar çift bağlı olarak tavlama sıcaklığı ile Tablo 4 gösterilen program (Tablo 1).
  4. Bir ev tutma gene (loopern437) ile karşılaştırıldığında gen ifade oranı denklemi kullanarak ΔCt yöntemi ile analiz:
    figure-protocol-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Doğal balık patojen Mycobacterium marinum zebra balığı iç organların bozar ve histolojik olarak görünür granülomlar19ile sistemik enfeksiyon oluşturur. Yetişkin zebra balığı mayi bir iğne ile M. marinum ile enfekte. DNA ve RNA ayıklanır ve Mikobakteriyel yük nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) DNA'yı kullanarak şablon olarak ölçülür. Yöntemin Şekil 1' de gösterilen.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada deneysel olarak enfekte yetişkin zebra balığı dokulardan çıkarılan DNA Mikobakteriyel yükler ölçmek için qPCR tabanlı bir uygulama açıklar. Bu uygulama astar 16S-23S rRNA iç kopya etmek spacer sıra40tasarlanmış temel alır. Toplam Mikobakteriyel yükü bir balık örnek olarak kültürlü mikobakteriler bilinen bir dizi arasından çıkarılan ve o bir bakteri genomunu bir kopyasını herhangi bir zamanda sayarsak DNA hazırlanan standart bir eğri kullanarak tahmin edilmektedir. Yaklaşık 100 M. marinu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Fin Kültür Vakfı (H.L. tarafından), Tampere tüberküloz Vakfı (H.L., L.-M.V., M.M.H., milletvekili), Finlandiyalı Anti-tüberküloz Derneği (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., temeli desteklenen M.M.H., milletvekili), Sigrid Jusélius Vakfı (milletvekili), Emil Aaltonen Vakfı (M.M.H.), Jane ve fotograf Erkko Vakfı (milletvekili) ve Finlandiya Akademisi (milletvekili). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo ve Jenna Ilomäki teknik yardım kabul vardır. Yazarlar Tampere zebra balığı Laboratuvar Hizmetleri için kabul.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Mycobacterium marinumAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuATCC 927
Middlebrock 7H10 agarBD, Thermo Fisher Scientific11799042
Middlebrock OADC zenginleştirmeBD, Thermo Fisher Scientific11718173
Middlebrock 7H9 ortaBD, Thermo Fisher Scientific11753473
Middlebrock ADC zenginleştirmeBD, Thermo Fisher Scientific11718173
Tween 80Sigma-AldrichP1754
GliserolSigma-AldrichG5516-500ML
GENESYS20 SpektrofotometreThermo Fisher Scientific
Fosfat tamponlu tuzlu su tabletleri (PBS)Sigma-AldrichP4417-50TAB
Fenol kırmızısıSigma-AldrichP3532
27 G iğneHenke Sass Wolf4710004020
1 mL şırıngaHenke Sass Wolf4010.200V0
Omnican 100 30 G insülin iğnesiBraun9151133
3-aminobenzoik asit etil ester (pH 7.0)Sigma-AldrichA5040
1.5 mL homojenizasyon tüpüQiagen13119-1000
2,8 mm seramik boncuklarQiagen13114-325
Etanol, ETAX AaAltia
2-propanolSigma-Aldrich278475
KloroformVWR22711.290
Guanidin tiyosiyanatSigma-AldrichG9277FW 118,2 g/mol
Sodyum sitratSigma-Aldrich1613859FW 294.1 g/mol
Tris (serbest baz)Sigma-AldrichTRIS-ROFW 121.14 g/mol
TRI reaktifiMoleküler Araştırma MerkeziTR118Guanidin tiyosiyanat-fenol çözeltisi
PowerLyzer24 homojenizatörQiagen
Sonicator m08Finnsonic
Nanodrop 2000Termo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master MixBiolineBIO-98005
qPCR 96 kuyucuklu plakaBioRadHSP9601
Optik olarak şeffaf filmBioRadMSB1001
C1000 CFX96 gerçek zamanlı sistemli termal döngüleyiciBioRad
RNase AWAYThermo Fisher Scientific10666421dekontaminasyon reaktifi RNazları ortadan kaldırır
DNaz IThermo Fisher ScientificEN0525
Ters Transkripsiyon Ana KarışımFluidigm100-6298
SsoFast Eva Green ana karışımBioRad172-5211

Kaynaklar

  1. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80(2015).
  2. Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
  3. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  4. Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
  5. Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
  6. Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis--heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
  7. Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
  8. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  9. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  10. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  11. Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703(2017).
  12. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  13. Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
  14. Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
  15. Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
  16. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
  17. Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  18. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190(2014).
  19. Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
  20. Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
  21. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  22. Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
  23. World Health Organization. WHO Global tuberculosis report 2017. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  24. Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
  25. Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
  26. Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
  27. Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
  28. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
  29. Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
  30. Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
  31. Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196(2016).
  32. Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  33. Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
  34. Madigan, M., Martinko, J. Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
  35. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish:a practical approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
  36. Anonymous Stanford University Protocols. , Available from: http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html (2018).
  37. Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091(2014).
  38. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190(2014).
  39. Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
  40. Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
  41. Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
  42. Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
  43. Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
  44. Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
  45. Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75(2018).
  46. Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
  47. Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tüberküloz Modeliİntraperitonal EnjeksiyonKantitatif PCRNükleik Asit EkstraksiyonuKonak İmmün YanıtıBakteriyel Yük ÖlçümüAdaptif İmmüniteLatent Enfeksiyon
Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.