Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Epididimal Protein sentezi ve salgı Analizi

8.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58308

⸱

25 Ağustos 2018

 ,  ,  ,  , 
1Priority Research Centre for Reproductive Science, School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Hunter Medical Research Institute, 3Department of Physiology, Turku Center for Disease Modeling, Institute of Biomedicine, University of Turku, 4School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle

Bu makalede

Özet

Burada, proteinler parafin gömülü fare epididimal bölümlerde yer tespiti ve bu bir ölümsüzleştirdi epididimal hücre hattı (mECap18) iletişim kuralları göstermek için dynamin ayirt lokalizasyonu raporu. Ayrıca izolasyon epididimal sıvı ve şartına hücre medya salgı proteinlerin protokollerde açıklar.

Özet

Memeli epididim biri herhangi bir endokrin bezinin en karmaşık intraluminal sıvıların sonrası testis olgunlaşma ve sperm hücreleri depolanmasını desteklemek üzere oluşturur. Bu karmaşıklık kombine salgı ve dinsel etkinliği astar epitel hücreleri nedeniyle ortaya çıkar. Burada, biz dynamin (DNM) mechanoenzymes modeli protein ailesi de odaklanarak epididimal protein sentezi ve salgı analizi için teknikler tarif; Çift yönlü membran kaçakçılığı olayları düzenleyen potansiyeline sahip büyük GTPases. Protein ifade epididimal doku çalışma için biz hedef proteinlerin parafin gömülü bölümlerde ve bu proteinler kayma dağılımını izleyen tespiti ayirt etiketleme için sağlam metodoloji tarif ayirt mikroskobu. Ayrıca izolasyon ve veziküller, sperm hücrelerinin olgunlaşması ile hücreler arası iletişim katılmaya epididimal lümen içine salgılanan epididymosomes olarak bilinen gibi ya karakterizasyonu için en iyi duruma getirilmiş metodoloji açıklar. Tamamlayıcı bir yaklaşım, ayrıca bir fare SV40 ölümsüzleştirilmiş kaput epididimal epitel (mECap18) hücre kültürünü hedef proteinlerin ayirt algılama açıklar. Ayrıca, biz mECap18 hücre satırı yardımcı programı ile, düzenleme, epididimal salgı faaliyet keşfetmek için uygun vitro model olarak tartışıyorlar. Bu amaçla, biz mECap18 hücre kültürünü ve onların salgı protein profil etkileyen özelliği olan seçici farmakolojik inhibisyon rejimlerinin kullanımı için bakım gereksinimleri kodlamayla tanımlamak. Belgili tanımlık ikinci are kolayca şartına kültür orta, salgılanan proteinler trichloroacetic asit/aseton yağış ile konsantrasyon ve onların sonraki analiz SDS-sayfa ve immunoblotting üzerinden hasat ile değerlendirildi. Bu kombine Yöntemler sperm olgunlaşma ve/veya depolama fonksiyonel rollerinin belirlenmesi için bir başlangıç olarak alternatif epididimal protein hedeflerin analizleri için uygun olduğunu iddia.

Giriş

Sperm hücreleri tüm memeli türlerinin ileri aşamalı hareketliliği görüntülemek için ve bir yumurta sırasında uzun süreli düşüşünü epididim, çok özel bir bölge olabilir erkek ekstra testis kanal sistemi ile döllemek için potansiyel elde 7-14 gün (tür bağlı olarak) gezinmek için1. Baba tarafından kromatin aşırı yoğunlaşma ve testis içinde sperm cytodifferentiation eşlik eden sitoplazma çoğunluğu dökülme nedeniyle, onların sonraki fonksiyonel olgunlaşma sadece onların etkileşim tarafından tahrik edilmektedir epididimden microenvironment ile. Bu ortamın sırayla, astar epididimal soma salgı ve dinsel etkinliği tarafından oluşturulur ve olağanüstü bir parça-parça değişimi1düzeyini görüntüler. Böylece, protein sentezi ve salgı açısından en aktif kesimleri epididimlerden (yani, kaput ve corpus)2proksimal kısmında bulunan bunlar. Bu etkinlik sperm, fonksiyonel yetkinlik işaretlerinden görüntülemek için hücreleri ilk başlangıcı ile fonksiyonel profil aynalar (i.e., asit çözündürüldükten zona glikoproteinlerin için bağlama yeteneği ve ilerici hareket) aşağıdaki onların geçit ile kaput epididim3. Bu işlev öznitelikler sperm boşalma için hazırlık içinde sakin bir durumda neyin saklandıkları distal epididimal kesimi (Kauda), ulaştığı en yüksek düzeyleri ulaşmadan önce geliştirmeye devam. Oluşumu ve bu sperm depolama haznesi bakımından da yakından hangi Kauda güçlü dinsel etkinlik4,5tarafından hakimdir astar epitel bağlıdır. Bildirilen6,7,8anatomik farklılıklar olmasına rağmen işbölümü bölgeselleştirilmiş bu tür memeli türlerin çoğunluğu arasında paylaşılan epididim karakteristik gibi görünüyor kendi9,10da dahil olmak üzere bugüne kadar okudu. Nitekim, klinik bir bakış açısından, bu o epididimal disfonksiyon erkek faktör infertilite11böylece bu özel doku Yönetmeliği anlama önemini vurgulayarak, etiyolojisi için önemli bir katkı yapar bilinmektedir.

Bu nedenle anlayışımız epididimal Fizyoloji ve sperm olgunlaşma ve depolama bu doku içinde sıralı aşamalarını düzenleyen mekanizmalar tam olarak çözümlenmesi için kalmasını üzüntü vericidir. Katkıda bulunan faktörler arasında sınırlayıcı epididimal araştırma gelişmeler bu doku genel karmaşıklığı ve bilgi luminal onun microenvironment üzerinde yasal denetim mekanizmaları vardır. Anatomik olarak, biz ötesinde kaput, corpus ve kauda kesimleri ayrım, epididim daha da çeşitli bölgelere (Şekil 1A) ayrılmıştır, her septa12 tarafından ayrılmış ve gen/protein ayrı profilleri tarafından karakterize olduğunu biliyorum ifade13,14,15,16,17,18. Nitekim, ayrıntılı transkripsiyon epididim segmental gen ifadesinde profilleme temelinde, en çok 6 ve 9 ayrı epididimal bölgeleri fare ve sıçan modellerinde, sırasıyla19,20bildirilmiştir. Bu karmaşıklık muhtemelen epididimal soma, çok sayıda farklı hücre türleri oluşan bir pseudostratified epitel bileşimi yansıtır; her yolu uzunluğu boyunca kendi bereket, dağıtım ve salgı/dinsel faaliyetleri ile ilgili olarak farklı. Böylece, asıl farkla en bol epididimal hücre türü tüm epitel hücrelerinin % 80 yukarı oluşturan hücrelerdir. Buna göre asıl epididimal protein biyosentezi ve salgı5hacim için sorumlu hücrelerdir. Buna ek olarak, epididimal soma içinde ikinci en bol bulunan hücre türü olarak rütbe, Açik Hücre nüfus öncelikle luminal bileşenlerinin seçici emme ve bu microenvironment5asitleştirme katılmaktadırlar. Karmaşıklık başka bir katmanı ekleme, androjenler ve diğer lumicrine faktörler testis kökenli onların yolu konumlandırma bağlı olarak bu epididimal hücre türlerinin her biri üzerinde değişiklik kontrol uygulamayın.

Böyle karmaşıklığı tarafından uygulanan sınırlamaları rağmen epididimal fonksiyonu mekanik temeli çözme içine yapılması önemli yayılmakta devam. Bu çalışmalar için bir anahtar ilk anketler arasından seçilen bireysel proteinlerin ayrıntılı analizler ile tandem epididimal Proteom geniş ölçekli stoklar kurmak için gelişmiş kütle spektrometresi stratejileri uygulanması olmuştur. Mechanoenzymes fare modeli21DNM ailesinin son bizim karakterizasyonu bu yaklaşım örnektir. DNM ilk bizim ilgi exo - ve endocytotic süreçlerin kaplin içinde çift kendi eylem tarafından yakıt. Bu gözlemler üzerinde bina, biz DNM (DNM1 - DNM3) üç kurallı izoformlarının çok fare epididim ifade ve protein salgılanması ve emme21 düzenleyici rolleri yerine getirmek için uygun şekilde konumlandırılmış . Ayrıca, biz böylece tamamlayıcı, epididimal epitel21içinde gereksiz, aktivite karşı sahip oldukları öne açıkça onların hücresel ve alt hücresel yerelleştirme temelinde her DNM izoformu ayırt etmek başardık.

Burada, bu bilgi daha geniş uygulama alternatif epididimal proteinler karakterizasyonu bulmak ve böylece katkıda umut ile fare epididim ifadede DNM çalışma için istihdam deneysel yöntemi açıklamak bizim Erkek üreme sistemi önemli bu öğenin işlevini anlama. Özellikle, biz hedef proteinlerin epididimal bölümlerde parafin gömülü ve bu proteinler ayirt üzerinden kayma dağılımını izleyen tespiti ayirt etiketleme için sağlam metodoloji geliştirilmesi tarif mikroskobu. Biz daha fazla yalıtım ve epididymosomes karakterizasyonu için bizim son zamanlarda en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları22 belge; epididimal salgı profili temel unsurları teşkil ve sperm olgunlaşma23teşvik önemli bir rol tutmak için görünen küçük eksozom benzeri veziküller. Tamamlayıcı bir yaklaşım biz de bir ölümsüzleştirdi fare kaput epididimal epitel (mECap18) hücre kültürünü hedef proteinlerin ayirt algılama ve bu kaynak kullanımı ile düzenleme, epididimal keşfetmek için bir model olarak tarif salgı faaliyet içinde vitro.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan doku koleksiyonu içeren tüm deneysel prosedürler Newcastle Üniversitesi'nın hayvan bakım ve Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. ayirt parafin gömülü epididimal bölümlerini (Şekil 1 ve 2) boyama

  1. Hemen sonra ötenazi CO2 inhalasyon (İsviçre fareler, 8 hafta boyunca) ile yetişkin farelerin, dikkatle (cerrahi makas ve cımbız kullanarak) epididim teşrih bağ dokusu ve yağ örten ücretsiz ve Bouin'ın sabitleştirici bırakın Çözüm (> 10 kat birim/doku ağırlık) gecede fiksasyon için.
  2. Doku % 70 etanol ile 2 × değişiklik ile her gün 2 gün boyunca yıkama ve infiltrasyon ve parafin blok içine gömmek için hazırlık kademeli etanol (% 70, % 95 ve % 100) kurutmak.
  3. Parafin blok kalınlığı 4-6 µm ve mount ayirt boyama için hazırlık slaytlarda, bölüm.
  4. Bir duman başlık, epididimal parafin kesitler ksilen yeterli miktarda tamamen doku bölümü (3 × 5 dk her zaman) sokmak için slayt kavanoz ekleyerek dewax.
  5. Saf H2O seyreltilmiş kademeli etanol çözümlerinde daldırma tarafından doku bölümleri rehydrate (% 100 etanol 5 dk, 5 dk, % 90 etanol 1 dk, % 80'i etanol 1 dk, % 70 Etanol Etanol % 100 1 dk ve % 50 Etanol 1dk).
  6. Bir kez yeterli fosfat tamponlu tuz tamamen tüm doku bölümü sokmak için (PBS) ile 5 min için bir slayt kavanoz bölümlerde yıkayın (tüm sonraki yıkama için bu yönergeleri izleyin).
  7. Uygun antijen alma çözüm dikkatle boşaltmak (i.e., 10 mmol/L sodyum sitrat, 50 mmol/L Tris pH 10,5 veya alternatif antijen alma isn'ta bağlı olarak algılanabilmesi için antijen) bir slayt raf ve kaynar kadar mikrodalga. Bu çözüm içine slaytlar bırakın ve doku bölümlerde ısı kaynaklı antijen alma koşulları bireysel antikorlar (bkz. Tablo 1) için en iyi duruma getirilmiş tabi.
    Dikkat: emin olun slaytları tam antijen alma işlemi sırasında antijen alma çözümde daldırılır.
  8. Slayt konteyner mikrodalga ve serin oda sıcaklığına çıkarın.
  9. PBS ile slaytlar durulama ve doku bölümü sıvı keşfedilmeden slayt marker kalem izlemek için kullanın.
  10. Slaytlar (kapsayıcı temelini ıslatılmış bir doku tarafından oluşturulan) bir oksijen kapsayıcı yerleştirin ve engelleme çözümü uygulamak (% 3 BSA/PBS, daha önce filtre 0,45 µm filtreden) 37 ° C'de 1 h için
  11. Bir kez PBS ile slaytlar durulayın.
  12. Filtre uygulanan % 1'deneysel olarak en iyi duruma getirilmiş bir konsantrasyon için seyreltilmiş uygun birincil antikor ile bölümleri kuluçkaya BSA/PBS gecede 4 ° C'de (anti-DNM1, DNM2 ve DNM3 için 1:60 antikorlar; 1: 100 için anti-ATP6V1B1 antikor, malzemeler tablo bkz: antikor Ayrıntılar için).
    Not: ayırt etmek için non-spesifik antikor bağlama, belirli bu sıkı negatif eklemek gereklidir (i.e., ikincil antikor tek, birincil antikor peptid immunizing karşı preabsorbed) ve pozitif denetimleri24.
  13. Slaytları, oda sıcaklığında 30 dakika yerleştirerek ısıt.
  14. PBS ile slaytlar 3 × bir platformda sallayarak (60 rpm) 10 dakika yıkayın.
  15. %1 içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikor ile bölümleri kuluçkaya BSA/PBS için 1 h 37 ° C'de (0,45 µm filtreden filtre) (1: 400 seyreltme için tüm ikincil antikorlar, görmek Tablo reçetesi antikor Ayrıntılar için).
    Dikkat: slayt konteyner bu adımından itibaren karanlıkta bırakın. Çift etiketleme için ikincil antikorlar uyumlu birleşimini seçin (i.e., ikincil antikorlar gerekir yükseltilmiş oldu farklı türler).
  16. PBS ile slaytlar 3 × bir platformda sallayarak (60 rpm) 10 dakika yıkayın.
  17. Propidium iyodür (PI, 7.48 μmol/L) ya da 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) hücre çekirdeği etiketlemek için oda sıcaklığında 2 min için bölümlerle counterstain.
  18. PBS ile iki kez slaytlar bir platformda sallayarak (60 rpm) 5 dakika yıkayın.
  19. Mowiol 4-88 hazırlanan % 30 gliserol 0.2 mol/L Tris (pH 8,5) içinde bir çözümde % 10 bölümlerle mount ve %2.5 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-oktan.
  20. Tırnak vernik ile coverslip mühür ve gelecekteki gözlem için 4 ° C'de slaytları depolama.
    Dikkat: Bu görüntüleme slaytların sürede pratik olarak sonra aşırı floresan kaybı olmaması için hazırlık yapmak önerilir.

Epididymosomes fare kaput epididimlerden (Şekil 3) üzerinden 2 yalıtım

  1. Hemen yolu ile CO2 inhalasyon (İsviçre fareler 8 hafta boyunca) yetişkin fareler ötenazi sonra onların damarlara (37 ° C-kan kirlenme epididimal dokusunun en aza indirmek için önceden ısındı) PBS ile sıvı.
    Dikkat: kan plazması farklı nüfus epididymosomes25benzer büyüklükte olan exosomes içerir. Kan izni epididimal dokusundan etkinliğini erişilebilir ilk kesimi muayene ile son derece bozukluklarına epididimal segment bulunan proksimal kaput bölümüne (i.e., 1 Şekil1a bölge)
  2. Dikkatle yüzey için herhangi bir potansiyel azaltmak için epididimlerden örten yağ ve bağ dokusu ve durulama ücretsiz değiştirilmiş Biggers, Whitten ve Whittingham ile orta (BWW; pH 7.4, osmolalite 300 mmol/kg su26,27) incelemek kan kirlenme.
  3. Aşırı medyayı çıkarın, kaput epididim incelemek için epididimal doku leke (i.e., 2-5 içinde Şekil 1Abölgeleri) ve BWW orta içeren transfer taze Petri kabına (35 × 10 mm). Orta miktarda final kurtarma için yeterli olduğundan emin olun.
    Not: 6 kaput epididymides için eşit olarak bölünmüş ve sonra üstüne (bkz. Adım 2,9) 2 önceden hazırlanmış degradeler uygulanan ~ 900 µL bir iyileşme için izin vermek için orta 1.1 mL kullanmak için önerilir.
  4. Bir tıraş bıçağı ile kaput doku içine küçük kesiler bir dizi yapmak. Doku kıyma değil ve böylece aşırı sitozolik içeriği ile örnek kirletici önlemek. Hafif ajitasyon luminal içeriği serbest bırakmak 30 dk 37 ° C'de dokuyla içeren plaka kuluçkaya.
  5. Sonuç süspansiyon hücresel enkaz kaldırmak için 70 µm membran aracılığıyla filtre.
  6. Filtrate toplamak ve bu Art arda aralıklarla adımları 4 ° C'de hücresel enkaz ortadan kaldırmak için hızı artan tabi (i.e., 500 × g, 2.000 × g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min her; 17.000 × g 20 dk ve nihayet 17.000 × g ek bir 10 dk ya kadar hiçbir Pelet Santrifüjü sonra oluşturulur).
    Dikkat: Pelet rengini çok az kan kontaminasyon mevcut olduğundan emin olmak için ilk 500 × g Santrifüjü adımdan sonra değerlendirmek önemlidir. Herhangi bir örnek bu pelet pembe rengi görüntülediği atmak.
  7. Kesintili iodixanol gradyanlar (%40, % 20, % 10, % 5 katmanları oluşan) (%60 (w/v) sulu iodixanol oluşan) bir yoğunluk gradient orta sulandrarak 0,25 mol/L sukroz ve 10 mmol/L Tris (pH 7.5) bir çözüm ile hazırlayın.
  8. Bir ultracentrifuge tüp (11 × 35 mm), degradede 450 µL (Şekil 3) her kısmını hazırlamak. Degrade sonra her kesir uygulanması arabirimler epididimal sıvı örnek yükleme öncesinde her katmanı arasında başarıyla oluşturulur emin olmak için kontrol edin. Her degrade taze kullanım, günde ancak hazırlamak, epididimal luminal sıvı örnek 4 ° c için en fazla 2 saat yükleme öncesi korunmuş.
  9. Dikkatle (malzeme toplanan 3 epididymides caput karşılık) epididimal luminal sıvı süspansiyon, tek bir geçişin 450 µL ekleyin.
  10. Ultracentrifuge 160.000 × g 18 h için 4 ° C'de, degradeleri.
    Dikkat: Bu Santrifüjü çok yüksek hızda yapılır beri bütün ultracentrifuge tüpler eşleştirilmiş ve olmalı tam olarak dengeli. Tüpler kendi bütünlüğünü tehlikeye atabilecek görünür herhangi bir hasar ücretsiz olduklarından emin olmak için denetleyin.
  11. Yavaşça çıkarın 12 eşit kesirler (her 185 µL oluşan) en üst katmandan başlayarak ve degrade altına doğru ilerliyor. Her degrade varsa kurtarılan eşdeğer kesirler (en çok iki degradeler) havuz.
    Not: epididymosomes en çok kesirler 9-1122zenginleştirilmiş fare Şekil 4 ve tartışma bakın.
  12. Kurtarma ve kesirler 9-11, havuzu sonra 2 mL PBS ve ultracentrifuge örnekleri epididymosomes cips için 100.000 × g için 3 saat 4 ° C'de (13 × 56 mm tüp) adlı oranında seyreltin.
    Dikkat: epididymosome Pelet görmek zor olabilir bu yana, onlar rotor yerleştirilir ve epididymosome Pelet bekleyen konumunu belirtmek için tüp işaretlemek gibi tüpler yönünü kaydetti olun. Her tüpün yeterli hacim içerdiğinden emin olun (i.e., % 50'sini toplam kapasitesini aşan) tüp çökmesi riskini önlemek için.
  13. Dikkatle Aspire edin ve süpernatant epididymosome Pelet bozmadan.
  14. Epididymosome saflık (Şekil 4) değerlendirmek.
  15. Epididymosome Pelet aşağı akım uygulamaları göre istenen orta içine resuspend. Örneğin, BWW orta genellikle sperm hücreleri veya alternatif olarak uygun lizis arabellek epididimal Proteom SDS-sayfa yolu ile çözümlenmesi için hazırlık ile ortak kuluçka içeren deneyler için kullanılır.

3. ayirt Staining mECap18 hücre

  1. Steril coverslips hazırlanması (bir hücre kültür mahallede yapılacak)
    1. Coverslips (12 × 12 mm) % 70 etanol için 10 dk içinde ıslatın ve etanol lamba yukarıda yüksek sıcaklık altında kurutma tarafından dezenfekte.
    2. Coverslip 10 için serin s 12 iyi plakasına aktarmadan önce.
    3. Steril poli-L-lizin çözüm coverslip kapak ve oda sıcaklığında 10 dakika için yerleşmek için geçerlidir.
    4. Poli-L-lizin çözüm atmak ve coverslip steril H2O ile durulayın ya da uygun orta.
  2. Hazırlık mECap18 hücreleri
    1. 2 × 105 mECap18 hücrelerde her şey coverslips içeren 12 iyi plaka aliquots geçiş.
    2. MECap18 hücre Orta (%1 L-glutamine, % 1 Sodyum pyruvate, % 1 penisilin/streptomisin ve 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN takıma DMEM) içeren % 10 fetal buzağı serum (FBS) atmosfer % 5 altında 37 ° C kuluçka hücrelerle kültür CO2 gece.
    3. Sonra hücreleri coverslip için uygun, orta atın ve hücreleri iki kez PBS ile durulayın.
    4. Tüm coverslip bırakın ve 15 dakika oda sıcaklığında hücreleri saptamak için PBS içinde seyreltilmiş yeterli miktarda % 4 paraformaldehyde (PFA) ekleyin.
    5. İngiltere'de yılın çözüm atmak ve coverslips iki kez PBS durulayın.
  3. Ayirt boyama
    1. MECap18 hücreleri % 0,1 daldırma tarafından permeabilize Triton X-100 PBS için 10 dk içinde.
    2. Coverslips PBS ile yıkayın.
    3. MECap18 hücreleri % 3 BSA ile engellemek ve immunolabeling epididimal doku bölümleri için açıklananlara eşdeğer protokolleri kullanan hücre ile devam edin.

4. yalıtım şartına hücre kültür ortamdan proteinlerin

  1. Klimalı hücre kültür orta topluluğu
    1. Geçit aliquots hücrelerinin 4 × 105 mECap18 6 her şey de plaka ile mECap18 hücre orta % 10 ile desteklenmiş FBS 24 h için.
    2. MECap18 hücreleri üç kez mECap18 hücre Orta (FBS hazırlanmış) ile kalan FBS ve ilgili kaldırmak için yıkama protein kirletici.
    3. Her şey için mECap18 hücre Orta (FBS hazırlanmış) 1,5 mL ekleyin ve 37 ° C kuluçka altında %5 12 h için mECap18 hücreler kuluçkaya CO2.
      Not: Bu adımda mECap18 hücreleri için farklı bir hedef antijenleri deneysel tasarım göre tespit edilebilir.
    4. 12 h kuluçka sonra hücre orta ve santrifüj 2.000 × g tüm hücresel enkaz kaldırmak 10 dk de toplamak.
      Not: Kuluçka süresi uygun olarak deneysel tasarım/bitiş noktası değerlendirme ve hücrenin tolerans uygulanan treatment(s) için söz konusu değiştirilmesi yapabiliyor. Bu en iyi sonuçları elde emin olmak için belirli deneysel rejimleri göre kuluçka zamanlaması terzi için tavsiye edilir.
    5. MECap18 hücre canlılığı bir standart trypan mavi dışlama tahlil28uygulanması yoluyla değerlendirmek. Tüm malzemesini içinde % 90 ölü ya da can çekişen hücrelerden serbest proteinler tarafından tanıtıldı önyargı ortadan kaldırmak için aşağıda hücre canlılığı reddetti.
    6. Aşağıdaki gibi proteinler hücre ortamdan izole veya orta-80 ° C'de korumak
  2. Protein yalıtım (duman mahallede yapılacak)
    1. Soğutulmuş % 100 trichloroacetic asit hacmi % 20 kültürlü mECap18 hücrelerden serbest protein çökelti şartına cep orta hacmi % 80'i ekleyin. 4 ° C'de gecede sürekli karıştırma ile kuluçkaya.
    2. Kuluçka sonra zarlarını protein Santrifüjü tarafından cips (17, 000 × g, 10 min için 4 ° C).
      Not: Orta salgılanan bekleniyor protein sınırlı miktarı nedeniyle, Pelet kolayca Santrifüjü sonra görüntülenmeyecektir değil ki mümkündür. Bu nedenle doğru biçimde Santrifüjü önce tüp yönlendirmek ve bekleyen Pelet konumu süpernatant kaldırılması sırasında bozmamaya özen için şarttır.
    3. Süpernatant atmak ve Pelet iki kez yeniden Santrifüjü önce soğutulmuş aseton ile yıkayın (17, 000 × g, 10 min için 4 ° C).
    4. Dikkatle kaldırmak ve süpernatant bir duman başlık içinde herhangi bir kalıntı aseton air-drying önce.
    5. Bir uygun ayıklama arabellek tam salgı protein profilleri ve/veya bireysel hedef proteinler algılamak bitiş noktası analizi için hazırlık içinde protein Pelet resuspend (Örn., SDS-sayfa, immunoblotting).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Resim 1 ve Şekil 2 fare kaput epididim DNM ayirt yerelleştirme temsilcisi sonuçlarını göster. Her biri üç DNM izoformlarının görüntü farklı yerelleştirme profilleri araştırıldı. Böylece, DNM1 ilk segment ve kaput epididimlerden (Şekil 2A) boyunca epididimal hücrelerinin nispeten mütevazı diffüz etiketleme ile karakterizedir. Buna karşılık, DNM2 izoformu ilk hücreleri ilk segmentteki ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmalar parafin gömme ve standart parça protokolleri için tabi Bouin'ın sabit epididimal doku kullanımı dahil. Bouin'ın sabitleştirici çözüm özel ve tamamlayıcı bir işleve sahip her bileşeni ile formaldehit, pikrik asit ve asetik asit, karışımından oluşmaktadır. Böylece, formaldehit protein çapraz bağlantıları oluşturmak için Birincil aminler ile reaksiyona girer, pikrik asit tuzları oluşturan doku yavaş yavaş nüfuz eder ve dolayısıyla koagulasyon temel proteinler ve tersine, asetik asit hızla dokuya nüfuz eder ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar bu eser destek için Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi, Avustralya proje Grant APP1103176 kabul etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dinamin 1 antikoruAbcamab108458Ev sahibi tür: Tavşan, izotip: IgG, Sınıf: poliklonal
Dynamin 2 antikoruSanta Cruzsc-6400Ev sahibi tür: Keçi, izotip: IgG, Sınıf: poliklonal
Dynamin 3 antikoruProteintech14737-1-APgüçlü>Ev sahibi tür: Tavşan, izotip: IgG, Sınıf: poliklonal
ATP6V1B1 antikoruSanta Cruzsc-21206Ev sahibi tür: Keçi, Isotype: IgG, Sınıf: poliklonal
CD9 antikoruBD Pharmingen553758Ev sahibi tür: Sıçan, izotip: IgG, Sınıf: monoklonal
Flotillin-1 antikoruSigmaF1180Ev sahibi tür: Tavşan, izotip: IgG, Sınıf: poliklonal
ALOX15 antikoruAbcamab80221<güçlü>Ev sahibi tür: Tavşan, izotip: IgG, Sınıf: poliklonal
TUBB antikoruSanta Cruzsc-5274Ev sahibi tür: Fare, izotip: IgG, Sınıf: monoklonal
PSMD7 antikoruAbcamab11436Ev sahibi tür: Tavşan, izotip: IgG, Sınıf: poliklonal
Anti Tavşan Alexa Fluor 488ThermoA11008Ev sahibi tür: Keçi, Isotype: IgG, Sınıf: poliklonal
Anti Keçi Alexa Fluor 488ThermoA11055Ev sahibi tür: Eşek, Isotype: IgG, Sınıf: poliklonal
Anti Keçi Alexa Fluor 594ThermoA11058Ev sahibi tür: Eşek, Isotype: IgG, Sınıf< / güçlü>: poliklonal
Anti Sıçan Alexa Fluor 594ThermoA11007Ev sahibi tür< / güçlü>: Keçi, izotip< / güçlü>: IgG, Sınıf< / güçlü >: poliklonal
Anti Tavşan HRPMilliporeDC03LEv sahibi tür< / güçlü>: Keçi, izotip< / güçlü>: IgG, Sınıf: poliklonal
Anti Sıçan HRPMilliporeDC01LEv sahibi tür: Keçi, Isotype: IgG, Sınıf: poliklonal
Anti Fare HRPSanta Cruzsc-2005Ev sahibi tür: Keçi, Isotype: IgG, Sınıf< / güçlü >: poliklonal
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)SigmaD9564
propidyum iyodür (PI)SigmaP4170
Mowiol 4-88Calbiochem475904
Sığır serum albümini (BSA)SigmaA7906
fetal sığır serumu (FBS)BovogenSFBS-F
DMEMTermo11960-044
L-glutaminTermo25030-081
penisilin / streptomisinTermo15140-122
5 alfa ; - androstan-17 ve beta; -ol-3-oneC-IIINSigmaA8380
sodyum piruvatTermo11360-070
Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA)SigmaT4049
Paraformaldehit (PFA)EMS15710
KsilenVWR Kimyasalları1330-20-7
EtanolVWR Kimyasalları64-17-5
Fosfat tamponlu salin (PBS)SigmaP4417
Sodyum sitratSigmaS1804
TrisAstral0497-5KG
GliserolSigmaG5516
1, 4-diazabisiklo-(2.2.2)-oktanSigmaD2522
Poli-L-gysineSigmaP4832
Triton X-100Sigma78787
Tripan mavisiSigmaT6146
Trikloroasetik asitSigmaT9159
AsetonAjax FinechemA6-2.5 L GL
SükrozSigmaS0389
Poli (vinil alkol)SigmaP8136
D-GlikozAjax Finechem783-500G
OptiPrep Yoğunluk Gradyanı OrtaSigmaD1556
Floresan mikroskobuZeissZeiss Axio Görüntüleyici A1
UltrasantrifüjBECKMAN COULTEROptima Max-XP
MikrosantrifüjlerEppendorf5424R
İnkübatörHeracell150
Büyük Orbital ÇalkalayıcıRatekOM7
MikrodalgaLGMS3840SR /00
Lab pH MetreMeterLabPHM220
Sıvı itici kayar işaretleyiciDaido SangyoMini
LamelThermo586
6 oyuklu plakaCELLSTAR657160
12 kuyulu plakaCELLSTAR665180
SürgülüMikro-CamSF41296PLMK
0.45 &mikro; m filterMillox-HVSLHV033RS
Kimwipes Tozsuz KağıtKIMTECH34155
Ultrasantrifüj tüpü (2,2 ml, 11 ve 35 mm)BECKMAN COULTER347356
Ultrasantrifüj tüpü (3,2 ml, 13 ve 56 mm)BECKMAN COULTER362305
Hücre süzgeci 70 & mikro; m NaylonFALCON352350
Petri kabı 35 > 10 mm kamlıSARSTED82.1135.500
Sürgülü kavanozTRAJAN# 23 319 00
<

Kaynaklar

  1. Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59(2018).
  2. Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
  3. Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
  4. Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
  5. Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
  6. Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
  7. Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
  8. Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
  9. Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
  10. Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
  11. Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
  12. Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
  13. Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
  14. Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
  15. Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
  16. Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
  17. Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
  18. Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
  19. Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
  20. Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
  21. Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
  22. Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
  23. Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
  24. Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
  25. Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
  26. Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
  27. Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
  28. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
  29. Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
  30. Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
  31. Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
  32. Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
  33. Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
  34. Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
  35. Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
  36. Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46(2015).
  37. Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
  38. Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
  39. Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
  40. Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
  41. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).
  42. Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
  43. Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
  44. Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

mm nofloresan MikroskopiEpididimozom zolasyonuUltrasantrif gasyon GradyanmECap18 H cre Hattmm nofloresan aretlemeProtein Salg lama AnaliziSDS PAGE mm noblotlamaTrikloroasetik Asit PresipitasyonuEpididimal Doku Diseksiyonu
Epididimal Protein sentezi ve salgı Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.