Akış Sitometresi veya diferansiyel Santrifüjü kullanarak bir iş akışı tespit etmek, ölçmek ve apoptotik vücutlarından apoptotik örneği yüksek saflıkta yalıtmak için geliştirilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Algılama ve yalıtım için yüksek saflıkta apoptotik organlarının
Bu makalede
Özet
Özet
Apoptotik organları (ApoBDs), microvesicles ve exosomes anahtar hücre dışı vezikül ailesiyle en büyük türü olan ApoBDs üyesidir. ApoBDs hücre izni hem de hücreler arası iletişim yoluyla kaçakçılığı biomolecules yardımcı olabilir teklif edildi. Kimlik ve ApoBDs yalıtım için kullanılan geleneksel yaklaşımlar genellikle doğru miktar ve düşük örnek saflık eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Burada, apoptozis indüksiyon onaylamak, ApoBD formasyonu doğrulamak ve ApoBDs için yüksek saflıkta yalıtmak için bir iş akışı açıklanmaktadır. Ayrıca anahat ve floresan aktif hücre (FACS) sıralama ve ApoBDs izole etmek için fark Santrifüjü dayalı yaklaşımlar karşılaştırın. Ayrıca, izole ApoBDs saflığı kullanarak teyit edilecek bir daha önce akış sitometresi tabanlı boyama ve analitik yöntem kurmak. Birlikte, açıklanan yaklaşım kullanılarak yapılan THP-1 monosit apoptozis ve apoptotik hücre sökme indüklenen ve doğrulanmış ve THP-1 monosit oluşturulan ApoBD 97-%99 saflık için izole edildi.
Giriş
Apoptozis, programlı hücre ölümü iyi çalışılmış bir form fizyolojik homeostazı korumak ve insan vücudu1içindeki zararlı olma olasılığı bulunan hücreleri kaldırmak için gereklidir. Apoptozis indüksiyon sonra apoptotik hücreler (ApoCells) morfolojik değişiklikler bir dizi tabi ve ApoBDs olarak adlandırdığı küçük membran bağlı veziküller sökmeye. Genel olarak, bu işlem apoptotik hücre sökme bilinir ve morfoloji2,3dayalı 3 farklı adımları ayrılabilir. Adım 1 (plazma zarı blebbing) blebs4,5olarak bilinen hücre yüzeyinde balon benzeri....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. indüksiyon apoptozis
- Hücre örneği 300 x g 5 min için'santrifüj kapasitesi ve önceden varolan herhangi bir hücre artıkları kaldırmak için süpernatant atın.
Not: yapışık hücreleri kullanırken, hücreleri önceden tohum ve 1 fosfat tamponlu çözüm (PBS) apoptosis indüksiyon öncesinde x ile yıkayın. - Cep numarasını belirlemek ve hücreleri toplamak.
Not: tahlil sonrası yalıtım bağlı olarak en az 1 x 10 bir başlangıç hücre sayısı7 hücreleri önerilir. - Komple medya (%10 (vol/vol) fetal buzağı serum, 50 IU/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin karışımı içeren ilgili orta) 1 x 106 hücre/mL nihai bir konsantrasyon için resus....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada özetlenen yordamı kullanarak, THP-1 monosit apoptosis akımıdır ve ApoBDs algılanır ve bir FACS tabanlı veya bir fark Santrifüjü yaklaşım (Şekil 1) yolu ile izole. İlk olarak, apoptozis UV ışınlama tarafından indüklenen ve apoptotik türleri morfoloji, blebbing, apoptotik membran çıkıntı oluşumu ve ApoBDs6nesil de dahil olmak üzere hücreleri sergilenen zaman örnekleri, kuluçka sonra 2-3 h toplanmıştır. Kime-PRO-3 ve A5 tabanlı akı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
1950'lerin başlarında açıklamasını beri apoptozis alanında belirgin, bir önde gelen araştırma alanı haline ilerlemiştir. Geniş ilgi ve geniş çabalarına rağmen apoptozis, özellikle ApoBDs, oluşumu bazı yönlerini de uygun yöntemleri eksikliği nedeniyle incelenmiştir değil. Bunlar özellikle belgili tanımlık sınırlama apoptosis ilerleme ve ApoBD oluşumu aynı anda geleneksel akış sitometresi A5/PI analiz ve ApoBD yalıtım kirleri kullanarak izleme içerir. Biz son zamanlarda metodolojik Bu eksiklikleri gidermek için yaklaşımlar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bunun işe yaradığına I.K.H.P. için Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (GNT1125033 ve GNT1140187) ve Avustralya Araştırma Konseyi (DP170103790) hibe tarafından desteklenmiştir
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücreler, örneğin kültürlenmiş insan THP-1 monositleri (klon numarası: TIB-202) | ATCC-RPMI | ||
| 1640 orta | Yaşam Teknolojileri | 22400-089 | |
| Penisilin-streptomisin karışımı | FSC | ||
| PBS | - | ||
| iyodür | Yaşam Teknolojileri | T3605 | TO-PRO-3 cilt, göz ve solunum yolu irrasyonuna neden olabilir. Doğrudan temastan kaçının. |
| 10x Annexin V bağlayıcı tampon | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Santrifüj tüpü (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Mikrosantrifüj tüpü (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Doku kültürü inkübatörü (37 ° C,% 5 CO2) | - | ||
| Santrifüj | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III FITC ve APC tespiti için iki lazerle yapılandırılmış akış sitometresi | BD Bioscience-FACS | ||
| Canto II FITC ve APC tespiti için iki lazerle yapılandırılmış akış sitometresi | BD Bioscience-FACS | ||
| FlowJo 8.8.6 yazılımı | - | - | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | - |
Kaynaklar
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
