Algılama ve yalıtım için yüksek saflıkta apoptotik organlarının

Apoptozis, programlı hücre ölümü iyi çalışılmış bir form fizyolojik homeostazı korumak ve insan vücudu¹içindeki zararlı olma olasılığı bulunan hücreleri kaldırmak için gereklidir. Apoptozis indüksiyon sonra apoptotik hücreler (ApoCells) morfolojik değişiklikler bir dizi tabi ve ApoBDs olarak adlandırdığı küçük membran bağlı veziküller sökmeye. Genel olarak, bu işlem apoptotik hücre sökme bilinir ve morfoloji^2,3dayalı 3 farklı adımları ayrılabilir. Adım 1 (plazma zarı blebbing) blebs^4,5olarak bilinen hücre yüzeyinde balon benzeri yapıların oluşumu ile karakterizedir. Adım 2 (apoptotik çıkıntı oluşumu) uzun membran çıkıntılar sivri^6,7,8apoptopodia, boncuklu-apoptopodia ve Mikrotubul gibi oluşumu içerir. Son olarak, adım 3 (ApoBD oluşumu) parçalanma apoptotik çıkıntılar ve/veya ApoBDs^6,9oluşturmak için ApoCells içerir. Önceki bulgular ApoBDs apoptotik hücre temizleme yardım ve hücreler arası iletişim arabuluculuk rolü tavsiye ettiler. Örneğin, bir ApoCell parçalanma ApoBDs içine kolayca fagositler^2,10,11çevreleyen tarafından kaldırılmış olabilir küçük 'ısırık büyüklüğünde' parçalar oluşturabilir önerilmiştir. Ayrıca, ApoBDs biomolecules DNA, RNA ve proteinler, hücre-hücre iletişim^12,13,14kolaylaştırmak için çevredeki hücreleri insan ticareti gibi bir dizi olabilir liman. Bu işlemlerin işlevsel olarak araştırmak için (i) doğrulama apoptosis indüksiyon ve ApoBD oluşumu, ApoBDs izolasyonu (II) ve (III) onay ApoBD saflık da dahil olmak üzere üç anahtar parametreleri onaylamak için hayati önem taşımaktadır.

Daha önce birkaç yöntem akış sitometresi ve Elektron Mikroskopisi gibi apoptozis ve ApoBDs^15,16,17,18eğitim için kullanılmaktadır. Ancak, ApoBD algılama ve miktar zor veya gözden çoğu kez. Örneğin, rutin olarak kullanılan akış sitometresi tabanlı apoptosis V annexin istihdam tahlil (A5, externalized bağlar bir protein ' yemek-bana ' sinyal Fosfatidilserin (PtdSer)) ve nükleik asit leke propidium iyodür (PI)¹⁹. Ancak, bu evrensel leke bileşimini kullanarak, analiz hücre alt kümeleri (hücrelerin, ApoCells ve nekrotik hücre) örnek yalnızca üç tür vardır varsayar. Ayrıca, apoptozis için pek çok araştırmacı tarafından "altın standart" olarak kabul rağmen akış sitometresi deneyleri ve sonraki veri analizi kez FSC/SSC^Orta-yüksek olaylar seçerek bir ilk gating adım adım ApoBDs dışarıda tutar. Bu nedenle, biz son zamanlarda A5 ve kime-PRO-3 kullanarak bir roman akış sitometresi tahlil geliştirdik, seçmeli olarak caspase 3/7-aktif pannexin 1 (PANX1) tarafından alınabilir başka bir nükleik leke^7,20kanal. Caspase 3 kaynaklı PANX1 harekete geçirmek PtdSer pozlama apoptosis erken aşamada önce gelir gibi kime-PRO-3 differentially apoptotik ve nekrotik hücre lekeleri. Buna ek olarak, bu yaklaşım strateji çoğunluğuna bizim roman ile birlikte veri çözümlemesi sırasında tüm alınan olayları içerir ve dahil olmak üzere altı hücre/parçacık alt kümeleri sonuç olarak tanımlanır: (i) hücrelerin (FSC/SSC^Orta/yüksek, A5^düşük , Kime-PRO-3^düşük), (II) A5^- erken ApoCells (FSC/SSC^Orta/yüksek, A5^düşük, kime-PRO-3^Ara), (III) A5⁺ ApoCells (FSC/SSC^Orta/yüksek, A5^yüksek , Kime-PRO-3^Ara), (IV) nekrotik hücre veya geç ApoCells (FSC/SSC^Orta/yüksek, A5^yüksek, kime-PRO-3^yüksek), (v) ApoBDs (FSC/SSC^düşük, A5^Ara, kime-PRO-3^{düşük / ara}) ve (vi) enkaz (FSC/SSC^düşük, A5^düşük, kime-PRO-3^düşük)²⁰. Bizim yaklaşım tüm hücreler/parçacık alt kümeleri ve daha da önemlisi, ApoBDs ayrılık hücreleri ve enkaz²⁰analiz önemini vurgular. Böylece, bu yaklaşım aynı anda apoptozis ve ApoBD oluşumu indüksiyon doğrulamak için verimli bir tekniği gösteriyor.

Geleneksel olarak, ApoBDs nereye ApoBDs hücreleri veya yoğunluğu dayalı diğer ekstraselüler veziküller ayrılabilir diferansiyel Santrifüjü yaklaşımlar çeşitli aracılığıyla izole edilmiştir. Ancak, tür Santrifüjü yöntemler genellikle düşük ApoBD saflık,-sizlik çekmek-in örnek saflık ve/veya hücre türüne özgü ApoBDs^17,21,22ayrı yetersizlik onaylamak için bir miktar adım tarafından sınırlıdır. Bu nedenle, biz son zamanlarda iki yaklaşım, FACS tabanlı ve hangi Apoptozis ve örnek saflık²³indüksiyon doğrulamak için bizim daha önce kurulan akış sitometresi yöntemi ile birleştiğinde yeni fark Santrifüjü temelli bir yaklaşım geliştirdik. ApoBD yalıtım FACS tabanlı yaklaşımımız ile % 99 saflık için yukarı ApoBDs zenginleştirmek ve hücre türüne özgü antikor ApoBDs karma hücre popülasyonlarının, doku örnekleri ve vücut sıvıları²³izole etmek için çeşitli ile birleştiğinde. Ayrıca, bizim gözden geçirilmiş fark Santrifüjü yaklaşım ApoBDs için yalıtmak için verimli bir yöntem gösteriyor > % 90 saflık²³.

Bu yazıda, apoptozis indüksiyon, doğrulamak ve algılamak ve ApoBD oluşumu ölçmek için deneysel bir işlem bizim biz ayrıntılı olarak tarif. FACS tabanlı ve fark Santrifüjü tabanlı yöntemleri kullanarak ApoBD yalıtım iş akışları da özenli ve karşılaştırıldığında. Temsilcisi veri açıklanan yöntemi gelecekteki ApoBD çalışmalar için etkili bir üstün araç sağlar gösterir.

1. indüksiyon apoptozis

1. Hücre örneği 300 x g 5 min için'santrifüj kapasitesi ve önceden varolan herhangi bir hücre artıkları kaldırmak için süpernatant atın.
   Not: yapışık hücreleri kullanırken, hücreleri önceden tohum ve 1 fosfat tamponlu çözüm (PBS) apoptosis indüksiyon öncesinde x ile yıkayın.
2. Cep numarasını belirlemek ve hücreleri toplamak.
   Not: tahlil sonrası yalıtım bağlı olarak en az 1 x 10 bir başlangıç hücre sayısı⁷ hücreleri önerilir.
3. Komple medya (%10 (vol/vol) fetal buzağı serum, 50 IU/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin karışımı içeren ilgili orta) 1 x 10⁶ hücre/mL nihai bir konsantrasyon için resuspend.
4. Aliquot ~ 2 x 6 iyi plaka kuyu başına 10⁶ hücre.
5. Apoptozis ikna etmek için plaka kapağı kaldırın ve hücreleri bir UV irradiator kullanarak 150 mJ/cm² ışınlatayım. Bu yaklaşık 30-60 s almalıdır.
   Not: ~0.5 x 10⁶ hücreler 'Untreated' hücre kontrolü için korunur ışınlama önce olun.
   Not: Apoptosis Ayrıca anti-Fas veya serum açlık⁶gibi diğer yöntemleri ile indüklenen.
6. 37 ° c, % 5 CO₂ hücre bağlı olarak 2-8 saat için kuluçkaya.
7. Bir tezgah en iyi ışık mikroskop kullanarak, blebbing, apoptopodia oluşumu ve ApoBD oluşumu gibi apoptotik türleri morfoloji varlığını doğrulamak için hücreleri görselleştirin.
   Not: 40 X büyütme yeterlidir
8. P1000 pipet, pipet ve apoptotik örnekleri toplamak kullanma.
9. 1 x PBS ile tabak yıkama ve maksimum verim sağlamak için kalan örnek ile birleştirmek.
10. Toplamak ~1/10^th 'Bütün apoptotik örnek' (WAS) için kontrol.
11. 'Tedavi edilmezse' örnek toplamak.
12. 6 dk 3000 x g de WS ve Untreated örnekleri santrifüj kapasitesi.
13. 1 mL 1 x PBS resuspend ve buz üzerinde bir kenara koyun.
14. ApoBD yalıtımı için her iki adım 2 veya 3 kalan apoptotik örnek ile devam ediyor.

2. ApoBD yalıtım FACS üzerinden

1. 3000 x g 6 dk için tüm örnek santrifüj kapasitesi.
2. Pelet aksatmadan süpernatant çoğunluğu kaldırmak.
3. 1 mL 1 x A5 bağlama arabellek, A5-FITC 75 µL ve kime-PRO-3 2 µL başına 1 x 10⁷ hücreleri içeren bir boyama çözüm resuspend.
4. Örnek 10 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya.
5. 1-2 mL 1 x A5 bağlama arabellek ekleyin ve örneği için fazla leke kaldırmak 6 dk 3000 x g'santrifüj kapasitesi.
   Not: Karma hücre popülasyonlarının veya doku örnekleri, adım 1 x A5 bağlayıcı arabelleğe birleşimiyle hücre türüne özgü Marker boyama bir antikor gerçekleştirmek ve Santrifüjü 3000 x g 6 için de önce buz 20 dk (veya üreticinin iletişim kuralı göre) üzerinde kuluçkaya Min.
6. Örnek Pelet FACS arabellek 3 mL resuspend (1 x PBS, 1 x A5 bağlama arabellek, % 10 FSC, 2 mM EDTA) 1 x 10⁷ hücre başına.
7. 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla bir yuvarlak-alt, polipropilen (akış sitometresi) tüp filtre ve örnekleri buz üzerinde ve karanlıkta tut.
8. FACS makinede açmak ve bir 100 µm meme kullanarak standart olarak gerçekleştirmek, damla gecikme yapmak ve istikrarlı bir akışı sağlamak.
9. Örnek yüklemek ve satın alma hızını ~ 1000 olayları/s için.
10. FSC, SSC, APC (kime-PRO-3) ayarlamak ve FITC (A5) gerilim ve nüfus sağlamak için FACS araziler içinde pozisyon olayları açıkça ayrılmış olabilir.
11. 20.000 olayları kaydetmek.
12. Gating bir strateji olduğu gibi bölüm 4 ayarlayın.
13. Sıralama düzeninde son ApoBD kapısı istenen sıralama nüfus eklemek.
14. Örnek alınıyor başlamak ve ~ 250 µL FACS arabellek içeren yeni bir tüpe 5,000-10,000 ApoBDs toplayarak bir test sıralamayı gerçekleştirmek.
15. Bir sistem geri floş gerçekleştirmek ve yük ApoBDs sıralanır.
16. Elde etmek ve test-sıralama ApoBDs kaydedin.
17. FSC (y ekseni) vs A5 karşılaştırarak ApoBD saflık % ~ 99 olduğundan emin olun (x ekseni olaylar).
    Not: A5 boyama biraz nedeniyle lazer beyazlatma örnekleri yeniden analiz ederken azaltmak.
18. Yüksek saflıkta elde sonra orijinal örnek yük ve ApoBDs için istediğiniz sayıyı elde kadar sıralama devam edin.
    Not: gerekirse, ikili sıralama aynı anda ApoCells ve ApoBDs izole etmek için gerçekleştirilebilir.
    Not: uzun bir süre boyunca sıralarken, koleksiyon tüp 4 ° C'de kuluçka önerilir
19. Sıralama işlemi tamamlandıktan sonra sonrası sıralama ApoBDs küçük bir bölümünü toplamak, tür sonrası ApoCells, Untreated ve WAS apoptosis doğrulamak ve sonrası sıralama saflık onaylamak için.
    Not: test-sıralama ve sonrası sıralama saflık önemli ölçüde farklı değil olsa da, bu akış ayarları ve istikrar üzerinde temel alır.

3. ApoBD yalıtım fark Santrifüjü üzerinden

1. Kalan apoptotik örneği ' 300 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.
2. Hücre Pelet etkilemesini önlemek için ~ 500 µL bırakarak süpernatant, toplamak ve bir yeni 15 mL konik tüp içine ekleyin.
3. Kalan 500 µL kaldırmak ve hücre Pelet resuspend 2 mL 1 x PBS (Bu 'ApoCell zenginleştirilmiş kesir' temsil eder.
4. Toplanan süpernatant 3000 gde 20 dk santrifüj kapasitesi.
5. Pelet için kontrol edin ve dikkatli bir şekilde (süpernatant microvesicles ve exosomes de dahil olmak üzere küçük hücre dışı veziküller içerebilir) süpernatant çıkarın.
6. Pelet 1 mL 1 x PBS (Bu 'ApoBD-zenginleştirilmiş' kesir temsil eder) resuspend
7. Her Viable, WS, ApoCell zenginleştirilmiş ve ApoBD zenginleştirilmiş örnekleri içinde bir yeni turda-dip, polistiren (akış sitometresi) tüp 100 µL toplamak.
8. 2 x A5 bağlama arabellek, 1: 100 A5-FITC ve 1:1,000 kime-PRO-3 içeren leke 100 µL Ekle
9. 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
10. Örnekleri gating strateji apoptosis başarılı indüksiyon ve ApoBD zenginleştirilmiş kesir saflığı doğrulamak için yukarıda açıklandığı gibi kullanarak akış sitometresi tarafından analiz.

4. akış sitometresi strateji geçişi

1. Arsa kime-PRO-3 (y ekseni) karşı nekrotik hücre (kime-PRO-3^yüksek) tüm diğer permeabilized olmayan olaylardan (kime-PRO-3^{düşük/orta}) ayırmak için FSC (x ekseni).
2. Tüm sigara permeabilized olayları seçin ve A5 karşı SSC arsa. Nüfus 1 (P1), SSC^Orta/yüksek, A5^{düşük/orta} hücreleri ve nüfus 2 (P2), diğer bütün olayları da dahil olmak üzere iki popülasyonun kapı.
3. P2, kime-PRO-3 A5 karşı komplo ve A5^Orta/yüksek olaylar tüm hücre artıkları dışarıda bırakmak için seçin.
4. Tüm A5 olumlu olayları seçin ve A5 karşı FSC arsa. ApoBDs (FSC^düşük) ApoCells (FSC^Orta/yüksek) ayırın.
   Not: ApoBDs ApoBD yalıtım FACS dayalı yaklaşım yoluyla için geçişi, son bir adım ApoBDs ve kime-PRO-3 A5 için karşılaştırma ve tüm olayları seçerek önerilir. Bu son sıralama kapısı FSC/SSC parametreleri yerine floresans kullanmasını sağlar.
5. Geçerli hücre analizi, P1 seçin ve iki gating stratejileri birini gerçekleştirin. Genel geçerli hücre analizi için FSC A5 karşı arsa ve bu nedenle kalan hücre artıkları kaldırma tüm FSC^Orta/yüksek hücreleri seçin. Alternatif olarak, derinlemesine analiz için hücrelerin A5 ayrılabilir^- kime-PRO-3 FSC karşı komplo tarafından erken ApoCells. Seçin kime-PRO-3^düşük, FSC^Orta/yüksek hücrelerin ve kime-PRO-3^Ara, FSC^Orta/yüksek A5^- erken ApoCells.

Burada özetlenen yordamı kullanarak, THP-1 monosit apoptosis akımıdır ve ApoBDs algılanır ve bir FACS tabanlı veya bir fark Santrifüjü yaklaşım (Şekil 1) yolu ile izole. İlk olarak, apoptozis UV ışınlama tarafından indüklenen ve apoptotik türleri morfoloji, blebbing, apoptotik membran çıkıntı oluşumu ve ApoBDs6nesil de dahil olmak üzere hücreleri sergilenen zaman örnekleri, kuluçka sonra 2-3 h toplanmıştır. Kime-PRO-3 ve A5 tabanlı akış sitometresi yöntemi hücrelerin, nekrotik hücre, erken ApoCells, ApoCells, ApoBDs ve enkaz (Şekil 2) ayırarak monosit apoptozis ve ApoBD oluşumu indüksiyon onaylamak için kullanıldı. Birlikte ele alındığında, Akış Sitometresi Analizi UV tedavi ~ sonuçları belirtilen ApoCells (Şekil 3).

THP-1 monosit ApoBDs zamanlar olarak WS iki yaklaşım yoluyla gelen izole. İlk olarak, örnekleri yüksek saflıkta FACS dayalı yaklaşım nerede sadece bir tek Santrifüjü adım boyama önce tüm apoptotik örnek cips için gereklidir için hazırlanmıştır ve FACS. Bu önemli ölçüde yüksek örnek saflık (örneğin, qPCR analiz için) gerekli olduğunda, ApoBDs belirli sayıda gerekli ne zaman veya ne zaman elde hücre türüne özgü ApoBDs karmaşık bir örnek üzerinden işlevsel deneyleri için uygun bir yöntemdir. Bu yöntemi kullanarak, ApoBDs % ~ 99 saflık (Şekil 4) izole edildi.

Yazarlar ifşa gerek yok.