Method Article

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

DOI:

10.3791/58320

⸱

October 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresans mikroskobu biyolojik moleküller üzerine çalışmaları in situ algılamak ve onların dinamiği ve etkileşim gerçek zamanlı olarak izlemek için güçlü bir araçtır. Geleneksel epi-floresan mikroskopi ek olarak, belirli deneysel hedeflere ulaşmak için çeşitli görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Bazı yaygın olarak kullanılan teknikler konformasyon değişiklikler ve angstrom çözünürlük ve tek molekül algılama tabanlı moleküler etkileşimleri bildirebilirsiniz tek molekül floresans rezonans enerji transfer (smFRET), dahil uzaysal çözünürlüğü için yaklaşık on twentyfold kırınım-sınırlı Mikroskopi için karşılaştırıldığında artırabilir görüntüleme-Süper çözünürlük (SR). Burada bir mikroskop, geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı SR görüntü ve çok renkli tek molekül algılama dahil olmak üzere birden çok görüntüleme yöntemleri birleştirir bir müşteri tasarlanmış entegre sistemi, mevcut, smFRET görüntüleme dahil olmak üzere. Farklı görüntüleme yöntemleri kolayca ve tekrarlanarak optik öğeleri geçiş yaparak elde edilebilir. Bu kurulum rutin ve düşük maliyet ve bireysel amaçlar için ayrı mikroskoplar bina göre alan çeşitli görüntüleme deneyler için bir ihtiyaç ile Biyoloji Bilimleri herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından evlat edinmek kolaydır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresans mikroskoplar modern biyolojik bilim araştırma için önemli araçlar ve floresan görüntüleme düzenli olarak birçok biyoloji laboratuvarlarında yapılan. Biomolecules fluorophores ile ilgi etiketleyerek, biz doğrudan onları mikroskop altında görselleştirmek ve yerelleştirme, uyum, etkileşim ve derleme devlet içinde VIVO veya vitrozamana bağımlı değişiklikleri kaydetmek. Geleneksel floresan mikroskoplar ~ 200-300 nm yanal yönde ve ~ 500-700 nm eksenel yönde1,2ve vardır, bu nedenle, düşsel vasıl 100'ler için sınırlı olduğunu bir kırınım-sınırlı kayma çözünürlüğe sahip nanometre mikron ölçek. Moleküler derleme veya kuruluşunuzdaki ince ayrıntıları ortaya çıkarmak için kırınım sınırı zarar verebilir çeşitli SR microscopies geliştirilmiştir. SR elde etmek için kullanılan stratejiler içerir uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi3,4 ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)5,6, gibi doğrusal olmayan optik etkileri 7, Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)8 ve photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM)9ve MINFLUX10gibi her ikisinin bir birleşimi gibi tek moleküllerin Stokastik algılama. Bu SR microscopies arasında tek molekül algılama tabanlı SR mikroskoplar tek molekül mikroskop set-up nispeten kolayca değiştirilebilir. Tekrarlayan harekete geçirmek ve photoactivatable floresan proteinler (FPs) veya fotoğraf değiştirilebilir boyalar üzerinde ilgi biomolecules öğesini görüntüleme ile Uzaysal Çözünürlük 10-20 nm11ulaşabilirsiniz. Moleküler etkileşimleri ve konformasyon bilgi elde etmek için gerçek zamanlı, angstrom nanometre çözünürlükte dynamics gereklidir. smFRET12,13 bu çözünürlük elde etmek için bir yaklaşımdır. Genel olarak, faiz biyolojik sorular bağlı olarak, görüntüleme yöntemleri farklı uzamsal çözünürlük ile ihtiyaç vardır.

Tipik olarak, görüntüleme her türü için belirli uyarma ve/veya emisyon optik yapılandırmasına gerek yoktur. Örneğin, tek molekül algılama için en sık kullanılan aydınlatma yöntemlerden birini belirli uyarma açı bir prizma veya objektif lens yoluyla ulaşılması gereken toplam iç yansıma (tır), geçer. SmFRET tespiti için donör ve alıcısı boyalar emisyonları dağınık şekilde ayrılmış olup elektron-çarpımı, şarj kuplajlı birtakım aynalar ve dikroik ışın ayırıcılar ile elde edilebilir cihaz (EMCCD), farklı bölümlerine yönelik gerek emisyon yolundaki yerleştirilir. Üç boyutlu (3-D), düşsel bir optik, bir bileşen bir silindirik objektif14, SR emisyon yolundaki bir astigmat etkiye neden için gereklidir. Bu nedenle, homebuilt veya piyasada bulunan entegre mikroskoplar genellikle, işlevsel olarak görüntüleme yöntemi her türü için uzmanlaşmış olan ve aynı kurulum üzerinde farklı görüntüleme yöntemleri arasında geçiş yapmak için esnek değildir. Burada üç farklı görüntüleme yöntemleri arasında ayarlanabilir ve tekrarlanabilir anahtarları sağlayan bir maliyet-etkin, hibrid sistemi mevcut: kırınım-sınırlı çözünürlük, tek molekül algılama tabanlı SR ile geleneksel epi-floresan görüntüleme görüntü ve çok renkli tek molekül algılama, smFRET (Şekil 1A) görüntüleme dahil olmak üzere. Özellikle, burada sunulan set-up fiber birleştiğinde giriş lazerler çok renkli uyarma için içerir ve epi- ve tır modları arasında geçiş yapmak için uyarma açı kontrolünü sağlar uyarma yolunda bir ticari aydınlatma kol programlanmış. Emisyon yolundaki bir çıkarılabilir homebuilt silindirik objektif Kaset 3-b SR görüntüleme için mikroskop gövdesi içinde yerleştirilir ve bir ticari ışın ayırıcı seçerek birden fazla emisyon kanal algılamak için etkin bir EMCCD kamera önce yerleştirilir aynı anda.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. mikroskop tasarım ve montaj

  1. Uyarma yolu
    Not: Lazerler, fark girişim kontrast (DIC) bileşenleri, mikroskop beden ve onun aydınlatma kol uyarma yolu içerir.
    1. Titreşim izole optik masa hazırlamak. Örneğin, bir yapısal amortisörleri tablosu 48 x 96 x 12'' tüm bileşenler için yeterli alan sunuyor.
      Not: kurulum ile sıcaklık kontrolü (Örneğin, 21.4 ± 0.55 ° C) bir odada kurmak. Sıcaklık kararlılığı optik uyum korumak açısından önemlidir.
    2. Fiber optik bağlantı için bir aydınlatma kol ile donatılmış bir mikroskop vücut yüklemek bir 100 X Petrol-daldırma TIRF objektif lens ve DIC bileşenleri.
    3. Dört lazer kafaları yerleştirin (647 nm, 561 nm, 488 nm ve 405 nm, Şekil 1Badımında çevrili) ve optik masada onların ısı lavabolar ve aynı yükseklik ve vardır (Örneğin iyi istikrarı sağlamak olabildiğince kısa emin olun verilmiş lazer ışınları var 3'').
      Not: Eğer bir lazer kafa diğer lazerler daha kısa bir yükseklikte, altındaki yeterli kalınlığı ile bir alüminyum plaka koymak. Her zaman ısı alıcıları ve optik tablo için en iyi ısı dağılımı (Şekil 1B) arasında en fazla temas emin olun. Lazerler SR görüntüleme için güçlü olmak gerekir. Malzemelerin tabloyabakın. Bu lazer temizlik filtreleri diyot lazerler önünde olması tavsiye edilir.
    4. Bir iş istasyonu bir veri edinme kartı bir çevre birimi bileşen bağlantısı (PCI) arabirimi üzerinden yüklemek ve lazerler bu kart ile bağlayın. Lazerler ON/OFF davranışları çıkış transistör transistör mantık (TTL) tarafından ve bu kartın (Şekil 1 c) analog çıkış tarafından kendi güç ayarı denetler. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı (ticari veya homebuilt) veri alma kartı denetlemek için uygun bir mikroskobu mikroskop vücut yanı sıra yükleyin.
    5. Aynalar ve dikroik ışın kırma (590, 525 ve uzun filtreler geçiş 470) onların anılan sıraya göre bağlar için mount. Çok istikrarlı ayna bağlar için ayna kullanın. Dairesel kırma yüzük istinat ile herhangi bir dikroik ışın kırma (Şekil 1 d) eğilmesini önlemek için kullanın.
    6. Aynalar ve dikroik ışın kırma lazer ışınları (Şekil 1B) birleştirmek için optik masaya koyun. En istikrarlı hizalama sağlamak için tüm anlaşma mümkün olduğunca kompakt ve 1''-kalınlık optik mesaj kullanabilirsiniz. Kısa dalga boyu ışıklar daha havada dağıtmak bu yana kısa dalga lazerler fiber optik bağlantı (Şekil 1B) daha yakın olacak lazerler düzenleyin.
    7. Lazer ışınları bir tek modlu fiber optik birleştirmek. Bunu yapmak için aşağıdaki adımlarda bir kafes sisteminde bir fiber bağlantı kurmak:
      1. Bir z ekseni çeviri Mount (Şekil 1E, en soldaki panel) fiber adaptör plaka bağlayın.
      2. Bir akromatik tamamen objektif mount (odak uzaklığı 7.5 mm =) bir kafes plaka (Şekil 1E, soldan ikinci panel).
      3. Yukarıda iki bölümü arasında uzantısı çubuklar tarafından bir kafes oluşturmak için bağlantı. Kafes parantez 1''-kalın optik yazılarda (Şekil 1E, orta panel) montaj ile optik masaya monte.
      4. 647-nm lazer ilk tek modlu optik fiber (FC/APC sonuna coupler) ile hizalayın.
        Not: tek modlu fiber optik kullanmadan önce bir çok modlu fiber optik kullanarak bir kaba hizalama hizalama işlemi yardımcı olabilir. Aynalar ve dikroik ışın kırma (Şekil 1 d, ayarlama topuzlar tarafından), açılarını yanı sıra akromatik tamamen objektif ve lif adaptör plaka (z ekseni çeviri Dağı ayarlayarak1E rakam,) arasındaki mesafeyi ayarlamak kazanmak için en yüksek lazer fiber üzerinden çıkış gücü.
      5. İlk lazer hizalama işlem tamamlandıktan sonra geçici olarak süsen çifti yüklemek ve geri kalanı lazerler teker teker (Şekil 1F) hizalayın. Hizalama verimliliği ile güç ölçeri denetleyin.
      6. Bir gözü önünde lazerler yansımaları azaltmak için adaptör plaka bırakın.
        Not: Güçlü geri yansımaları lazer kaynakları ömrünü azaltabilir. İsteğe bağlı olarak, bir optik İzolatör yansımaları tamamen kaldırmak için her lazer kafa önünde yüklenebilir.
    8. Diğer ucunu fiber optik mikroskobu (Şekil 1 H) aydınlatma kol bağlayın.
    9. Tasarım ve "büyütme objektif (mag objektif)" aşağıdaki adımlarda yükleyin:
      Not: Lazerler örnek epi-floresan görüntüleme için kullanılabilir, ancak her lazer dar demet boyutunu örnek bir alana karşılık gelen fotoğraf makinesi sensörünün gerçek boyutundan daha küçük birkaç kez ışıklı alan özellikle için yeni sınırlar kameralarla (köşegen uzunluğu geleneksel 11,6 mm uzunluğa göre 18.8 mm). Böylece, bu örnek daha büyük ve daha düz aydınlatma elde etmek için ışın genişletmek için tercih edilir.
      1. Aydınlatma kol (Şekil 1 H) sığabilecek mag lens tasarımı.
        Not: Mag lens tasarımı nerede yüklü üzerinde bağlıdır. Şekil 1 H aydınlatma kolundan yükleme örneği gösterir ama sonra lazer ışınları collimated (bkz: tartışma) herhangi bir yerde yüklenebilir. Bir bilgisayar destekli tasarım ve çizim yazılımı ile tasarlayabilirsiniz.
      2. Koyun iki achromatic lens, bir içbükey (odak uzaklığı = f1) ve bir konveks (odak uzaklığı = f2) onların odak uzunlukları toplamı, için f1 eşit mesafe ile ev yapımı mag objektif tutucu (Şekil 2A ve 2 C), + f2 (-25) = + 50 = 25 mm (Şekil 2B).
        Not: Bu odak uzaklık seçeneği ile mag objektif ışın f2tarafından genişletir / | f1| = 2 pas geçiyor. Mag lens çok yönlülük sağlar. Normal aydınlatma kirişler (Şekil 2B) genişleyen olmadan devam etmek için kaldırılabilir veya daha güçlü bir uyarma yoğunluğu elde etmek için lazer ışını odaklanmak için ters yönde eklenir.

2. emisyon yol

Not: Emisyon yol çıkarılabilir bir silindirik lens, bir bariyer filtresi tekerlek, bir emisyon splitter ve bir EMCCD kamera (Şekil 1G) oluşur. En iyi noktaya ulaşmak için işlev (PSF) tek moleküllerin yaymak, DIC prizma uzak objektif lens alınır.

  1. Özel-tasarım el ile DIC çözümleyicisine sığabilecek silindirik objektif (3-b objektif) kaset yuvası (Şekil 3 c) mikroskop gövdesine yerleştirin.
    Not: bir Çözümleyicisi blok filtre tarete eklenebilir bu yana bu tasarım DIC analyzer ödün vermeyen.
  2. 3-b lens odak uzaklığı 10 m kasete ve astigmat etkisi her molekülünü14z koordinatı ayıklamak için gerekli oluşturmak için emisyon ışını yolun içine yerleştirin.
    Not: İsteğe bağlı olarak, 3-b objektif kaset içinde ya da dışında emisyon yol (Şekil 3 c) yerleştirilebilir.
  3. Bir çok bantlı dikroik ışın ayırıcı filtre taret mikroskop vücut içinde yükleyin.
  4. Emisyon filtreleri yükler.
    Not: Emisyon filtreler tercih edilen fluorophores bağlı olarak seçilir. Görüntüleme modülü bağlı olarak, farklı konumlarda yerleştirilmiş emisyon filtreler aşağıda açıklandığı gibi kullanılır:
    1. Sıralı çok renkli epi-floresan görüntüleme veya SR görüntüleme için mikroskop vücuttaki titreşim kanal anahtarı (Şekil 1G) sırasında en aza indirmek için mikroskop cesedin yanında bağlı bariyer filtresi tekerlek yerleştirilen emisyon filtreleri kullanın.
    2. Eşzamanlı çoklu renk algılama için (Örneğin, smFRET deneyleri), başka bir filtre bir emisyon splitter (onay adım 4 Ayrıntılar için) set koyun.
      Not: Genellikle, iki değiştirilebilir modu (yani, "meşgul" veya "atlamak" modları) bir ticari emisyon splitter vardır. İki dikroik ışın ayırıcılar ve üç emisyon filtre tutan bir filtre küp chromatically eşzamanlı çoklu renk görüntüleme ("Nişanlı" modu) için emisyon ışıklar ayırmak için kullanılır ("Üçlü küp," rakam 4 c ve 4 D). Bariyer filtresi tekerlek boş bir yuvaya çift küp ile birlikte kullanılır. Öte yandan, sıralı çok renkli görüntüleme için üçlü küp sadece bir ayna ("yan yol küp," Şekil 4A ve 4 D) içinde olan bir küp değiştirilir.
  5. EMCCD kamera emisyon yolun son parçası olarak yükleyin. Hızlı kare hızı elde etmek için USB-PCI bağlantı kullanmak.
    Not: Bir EMCCD kamera en hassas tek molekül algılama için tavsiye edilir, ama bir Gelişmiş sCMOS kamera bir alternatif olabilir.

3. kırınım-sınırlı Epi-uyarma ile görüntüleme

  1. Epi-aydınlatma kol modunda uyarma lazerler arızi açıya ayarlayın.
  2. 3-b objektif olsa (Şekil 3 c, doğru kapı aynası) meşgul kapatın.
  3. Yan yol küp emisyon splitter (Şekil 4A ve 4E, alt paneli) yerleştirin.
  4. (İsteğe bağlı) Mag objektif genişletilerek aydınlatma alanı (Şekil 2B, sol panelde) için ekleyin.
    Not: bir mag lens ve 100 X Petrol-daldırma objektif lens kullanımı ile yaklaşık 91 x 91 µm2 eşit olarak, beyaz bir ışık kaynağı ve birden çok filtre küpleri kullanma gereksinimini ortadan kaldırarak aydınlatılmış.
  5. Bir mikroskobu görüntüleme yazılımı çok kanallı, almak ve/veya Z-yığın ve/veya Hızlandırılmış resimler kullanın.
    Not: Mikroskobu görüntüleme, sadece mikroskop üreticilerin aynı zamanda üçüncü taraf şirketler veya açık kaynak geliştiricileri için kullanılabilir birden çok program vardır.

4. çok kanallı Imaging tek molekül de dahil olmak üzere smFRET

Not: herhangi bir dalga boyu ile tüm emisyon emisyon splitter filtreler/dikroik ışın kırma ikinci kümesi ulaşabilirsiniz bariyer filtresi tekerlek "boş" bir konuma taşıyın.

  1. Çok renkli tek molekül tespiti TIRF uyarma, smFRET ölçüm, dahil olmak üzere kullanarak yüzey immobilize molekülleri15 ayarlamak için uyarma lazerler arızi açı TIRF açıyla ayarlayın. Mag lens ve 3-b lens kapatın.
  2. Üç kanallı modu aşağıdaki adımlarda emisyon splitter (Şekil 1G) meşgul:
    1. Bir "kalibrasyon küp" ile bypass cube yerine tüm kanallardan (Şekil 4B ve 4E) gitmek ışık sağlar.
    2. DIC (yani, hiçbir emisyon filtre bariyer filtresi tekerlek) altında kamera açmak ve üç tamamen ayrı kanal ekranda görününceye kadar emisyon splitter diyafram ayarlamak.
      Not: oda ışığı yaktı, tüm kanallar görselleştirmek için bu adımı gerçekleştirin.
    3. Yatay/dikey ayarı kontrol düğmeleri emisyon splitter açmak ve kabaca üç kanal (Şekil 4E ve 4F) hizalayın.
    4. Fotoğraf makinesini kapatın ve kalibrasyon küp çift küp (Şekil 4 c ve 4E) ile değiştirin.
    5. Bir örnek ile 100 X objektif lens ve odak üstünde 100-nm çok kanallı boncuk örnek üzerinde yerleştirin.
    6. Kamera ve 488-nm lazer açın, bir parlak boncuk üzerinde yakınlaştırma ve ince ayar kontrol düğmeleri yeniden (Şekil 4E ve 4 G) açarak üç kanal hizalayın.
      Not: 488-nm uyarma, üç kanallı hizalama etkinleştirme üzerine ışık farklı dalga boylarında 100-nm çok kanallı boncuk yayarlar.
  3. Kamera ve lazerler, odak açmak ve makul bir nokta yoğunluğu ile iyi bir pozisyon bulmak. Lazer güç ve pozlama zaman kabul edilebilir sinyal-gürültü ve photobleaching seviyeleri elde etmek için ayarlayın. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı mikroskobu hızlandırılmış fotoğraf çekmek için kullanın.

5. SR görüntüleme

Not: Bu tek molekül algılama tabanlı SR mikroskobu olduğunu.

  1. SR görüntüleme yukarı ayarlamak için 3-b objektif ekleyebilir veya mag objektif kaldırabilir. Kameranın çekim hızı (Örneğin, 5-60 ms) uygun lazer kanallarında ayarlayın. Belirlemek ve en uygun uyarma lazerler arızi açı TIRF açı için el ile ayarlayın.
  2. Örnek arabellek16Imaging SR yerleştirin. Arabellek en az 10 dk önce görüntüleme için equilibrate izin.
    Not: SR görüntüleme arabellek yaklaşık 1 saat sonra sona eriyor, bu nedenle yeni SR arabellek buna göre görüntüleme olun.
  3. DIC görüntü SR görüntüleme önce al. Doğru objektif yükseklik astigmat etkisi en iyi duruma getirir, SR için bulmak için hücrelerin orta uçak bulmak için Imaging DIC kullanın. Uçağın yükseklik tarafından hücreleri "karanlık" resimlere geçiş "light" ve şeffaf olmak için görünür tanımlamak (Şekil 5A, 5Bve 5 C). İstenen odak düzlemi belirlendikten sonra z-drift düzeltme sistemi (Şekil 1A) meşgul.
  4. SR görüntüleme kuralları. 405 nm lazer güç noktalar 'yanıp sönen-açık' makul bir yoğunluğu korumak için değiştirin.
    Not: 405 nm lazer el ile değiştirmek mümkün olsa da, "yanıp sönen-tarih" noktalar yoğunluğu korumak için programlanmış veri alma kodu çalıştırmak daha uygun olur. İşte bir örneği nasıl otomatik olarak yürütülür. Kaynak kodu (Şekil 6) istek üzerine mevcuttur.
    1. Görüntüleme edinme 0 W/cm2 menekşe lazer güç ile başlayın.
    2. Yanıp sönen üzerinde noktalar belli bir süre içinde saymak.
    3. Böylece yanıp sönen üzerinde noktaların sayısını eşiğin bir kullanıcı tarafından tanımlanan"sayım" görüş alanı içinde tutulur menekşe lazer güç modüle. Yanıp sönen üzerinde noktaların sayısını sayım eşiğin altına düştüğünde menekşe lazer gücünü arttırın.
    4. Yanıp sönen üzerinde noktaların sayısını en fazla menekşe lazer güç kullanarak sayım eşiğin altına düştüğünde satın sonlandırın.
      Not: En fazla örnek parlaklık bağlı olarak farklı şekilde ayarlanmış, ancak 130 W/cm2' den daha yüksek olabilir. SR görüntüleme gerçek amacı bağlı olarak, bu otomatik satın alma kodu el ile istediğiniz herhangi bir noktada sonlandırılabilir.
  5. Yanıp sönen davranış ve PSFs noktalar yakında satın başladıktan sonra kontrol edin.
    Not: Eğer yanıp sönen davranış ideal değil, uyarma lazerler arızi açısını değiştirebilir veya görüntüleme arabellek değiştirin. "Dikey", "yatay" ve "elmas" şekilleri fluorophores aşağıdan, yukarıda ve odak düzlemi içinde sırasıyla temsil eden PSF, (Şekil 5 d) bir örnekleme bekliyoruz. Çoğu noktalar dikey veya yatay PSFs gösterirsen, sonra odak düzlemi hücreleri Merkezi'nden kapalıdır, bu yüzden deneme sonlandırmak ve yine odak düzlemi ayarlamak. Yağ değiştirmek veya örnek bir farklı görüntüleme alanına değiştirmek gerekli olabilir bu yüzden hava kabarcığı Daldırma yağ veya diğer yerel faktörler varlığı PSFs kalitesini etkileyebilir.
  6. Veri analizi için her spot cisimlerin görüntüleme her çerçevede algılamak ve x ve y genişlikleri14her spot z değerlerini ayıklamak için (NIH ImageJ eklentileri içinde) açık kaynak veya piyasada bulunan kodları kullanın.
    Not: Bu rapordaki orijinal erken tek molekül algılama tabanlı SR8 birinde gelişmiş bir kaynak kodu için 3-b algılama16 güncellenmiştir ve kullanılmıştır.
  7. İki renkli görüntüleme söz konusu olduğunda, daha kısa uyarma dalgaboyu olan ardından uzun uyarma dalga boyu ile fluorophore görüntü. Otomatik satın alma kodu aynı şekilde adım 5,4, ancak farklı bir görüntüleme lazer ile açıklanan bir çalıştırın.
    Not: renk sapmaları görüntü farklı fluorophores (Örneğin, kırmızı boya ve sarı-yeşil boya) ile arasında düzeltilmelidir. Burada adımlar vardır.
    1. Birden fazla 100-nm çok kanallı boncuk kümeleri şekillendirme kaçınarak cam coverslip üzerinde hareketsiz.
    2. Onları farklı uyarma kanalları görüntülerini almak.
    3. Özü onların (X, Y, Z) yazılımı (adım 5.6) tarafından koordine eder.
    4. ΔXben Arsa = X1I -2i ve ΔYi X Y1I - Y2i = (ben için farklı boncuk ve 1 ve 2 farklı renk kanalları) ayrı ayrı ve bunları uygun işlevleriyle uygun. İşlevleri kaydedin.
      Not: Doğrusal fonksiyonlar çoğu durumda yeterlidir. Bir kez bu işlevler belirlenir, bu ölçüm görüntüleme her seferinde yinelenmesi sahip değil.
    5. Bir örnek ilgi gerçek iki renkli SR görüntüleme içinde işlevleri (X, Y) doğru renk sapmaları için geçerlidir. Z yönlü renk sapmaları için ΔZ elde ederek yapmak = Z1 - Z2 çok kanallı boncuk ya da bilinen başvuru çok kanallı örnekleri faiz örnek ile birlikte tohumlari için.
      Not: (X, Y) farklı renk sapmaları, z yönlü renk sapmaları iyi-tekrarlanabilir kanal geçiş üzerine ağırlıklı olarak eksik z yönlü odak bakım nedeniyle her denemede değil. Bu nedenle, bu her zaman düzeltme yapmak için tavsiye edilir. ΔZ = Z1 - Z2 çoğunlukla (X, Y), bağımsız olarak sadece birkaç boncuk veya başvuru örnekleri ilgi her örnek alan yeterli olurdu. İnşa son iki renkli SR görüntüleri bir 3-D görüntüleme yazılımındaki arsa ve ΔZ el ile denetleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu mikroskop esnek ve tekrarlanabilir farklı görüntüleme yöntemleri arasında geçiş sağlar. Burada her görüntüleme modülü ile toplanan örnek resimleri göster.

Şekil 5 d üzerinde yanıp sönen molekül PSF SR alım sırasında gösterir. Böyle görüntüleri binlerce son SR görüntü (Şekil 5E) oluşturmak için yeniden. Şekil 5E aynı bakteriyel düzenlemes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu melez mikroskop sistem birden fazla mikroskoplar satın almak için ortadan kaldırır. Optik tablo, tablo yükleme işçilik, yazılım ve iş istasyonu, dahil bütün parçalar için maliyet yaklaşık $230.000 toplamdır. Mag lens ve 3-b lens, dahil, özel işlenmiş parçalar yaklaşık 700 $ (farklı kurumları gerçek masrafları maliyeti bağlıdır) maliyet. Tipik piyasada bulunan entegre sistemleri tek molekül algılama tabanlı SR mikroskobu fazla 300.000 $ maliyet için ~ 400.000 ve değil kolayca smFRET ölçüm için kullanılabilir, veya epi-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.F. Searle akademisyenler Program ve NIH yönetmenin yeni yenilikçi Ödülü destek kabul eder. Yazar Paul Selvin'ın Lab (Illinois Üniversitesi, Urbana-Champaign) 3-b objektif konumlandırma için yararlı öneriler kabul etmiş oluyorsunuz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nikon Ti-E mikroskop standıNikonTi-E
Objektif lensNikon100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Mikroskopi görüntüleme yazılımıNikonNIS-Elements Advanced Research/HCHC, SR görüntüleme için kullanılan programlanmış toplama modülü olan "JOBS" modülünü içerir.
Aydınlatma koluNikonTi-TIRF-EM Motorlu Işık Ünitesi MBu kolda büyütme lensi için bir yuva vardır
Analiz bloğuNikonTi-ABu, filtre taretine monte edilmiştir.
Z-kayma düzeltme sistemiNikonPFSBu sistem, objektif burunluktaki step motor, IR LED ve bir dedektörden oluşur.
Optik masa üstüTMC783-655-02R
Optik masa tabanlarıTMC14-426-35
647 nm lazerCobolt90346 (0647-06-01-0120-100)Modülasyonlu Lazer Diyot 647nm 120mW, lazer kafası, CDRH kontrol kutusu, USB kablosu ve PSU (Güç Kaynağı Ünitesi) dahil
561 nm lazerTutarlı1280721OBIS 561nm LS 150mW Lazer Sistemi
488 nm lazerCobolt90308 (0488-06-01-0060-100)Modülasyonlu Lazer Diyot 488nm 60mW, lazer kafası, CDRH kontrol kutusu, USB kablosu ve PSU (Güç Kaynağı Ünitesi) dahil405
nm lazerCrystalaserDL405-025-O405 (+/- 5)nm, 25mW, Dairesel, M2 < 1.3, Düşük Gürültü, CW, 20MHz'e kadar TTL. TTL ve için 2 BNC konektörü Analog ayar
Isı emiciCobolt11658 (HS-03)İki ünite, Fansız ısı emici HS-03, 647 nm ve 488 nm lazerler için ısı emici
Isı emiciFanlı1193289 Obis ısı emici, 561 nm lazer için 165 x 50 x 50 mm
CAB-USB-miniUSBCobolt10908İki ünite, 647 nm ve 488 nm lazerler için iletişim kablosu
yükseklik ayarı için alüminyumMcMaster-Carr9146T35Çok Amaçlı 6061 Alüminyum, Dikdörtgen Çubuk, 4MM X 40MM, 1' Uzun Yükseltmek için 561 nm lazer
yükseklik ayarı için alüminyumMcMaster-Carr8975K248Çok Amaçlı 6061 Alüminyum, 1-1 / 4 "Kalınlık X 3" Genişlik X 1' 405 nm lazer BNC
kablosuL-comCC58C-6RG58C Koaksiyel Kablo, BNC Erkek / Erkek, 6.0 ft
BNC adaptörüL-comBA1087Koaksiyel Adaptör, BNC Bölme, Topraklı
SMA - BNC AdaptörüHODSMA-870Cobolt MLD lazerler SMA arayüzüne sahiptir, bu nedenle bu adaptör BNC bağlantısı için kullanılır.
SMB - BNC AdaptörüFairview MikrodalgaFMC1638316-12SMB Fiş - BNC Dişi Bölme Kablosu RG316 Tutarlı Obis lazerler için 12 İnçte Koaksiyel
Veri Toplama KartıNational InstrumentsPCI-672313-Bit, 32 Kanal, 800 kS/s Lazerleri, DIC LED'i vb. kontrol etmek için Analog Çıkış Cihazı
Bariyer Filtresi Tekerlek kontrolörüSutter InstrumentLambda 10-BOptik Filtre Değiştirici
Emisyon AyırıcıCairnOptoSplit III
Dikroik ışın ayırıcıChromaT640LPXR-UF2OptoSplit III'te kırmızı emisyonu yeşil emisyondan ayıran dikroik ışın ayırıcı
Dikroik ışın ayırıcıChromaT565LPXR-UF2OptoSplit III'te yeşil ve kırmızı emisyonu mavi emisyondan ayıran dikroik ışın
ayırıcı Emisyon filtresiChromaET700/75Mİki ünite, OptoSplit III'te kırmızı emisyon için emisyon filtresi (Alexa Fluor 647 gibi) ve ayrıca Bariyer filtre tekerleğinde
Emisyon filtresiChromaET595 / 50Mİki ünite, OptoSplit III'te sarı / yeşil emisyon için emisyon filtresi (Cy3B gibi) ve ayrıca Bariyer filtre tekerleği
Emisyon filtresiChromaET525 / 50Mİki ünite, OptoSplit III'te mavi emisyon için emisyon filtresi (Alexa Fluor 488/GFP gibi) ve ayrıca Bariyer filtre tekerleğinde
Emisyon filtresiSemrockFF02-447/60-25Menekşe emisyonu için emisyon filtresi (DAPI/Alexa Fluor 405 gibi), Bariyer filtre tekerleğine takılı
Dikroik ışın ayırıcıChromazt405/488/561/647/752rpc-UF3Mikroskop gövdesinin içinde 647, 561, 488 ve 405 nm lazer uyarımları için çok bantlı dikroik ışın ayırıcı
DAPI Filtre setiChroma49000mikroskop gövdesine takılıdır
Nikon lazer/TIRF filtre küpüChroma91032
590 uzun geçiren filtre647 nm lazer ve 561 nm lazeri birleştirmek içinChromaT590LPXR-UF1
525 uzun geçiren filtreChromaT525LPXR-UF1halihazırda birleştirilmiş 647 nm ve 561nm lazerleri 488 nm lazerle birleştirmek için
470 uzun geçiren filtreChromaT470LPXR-UF1, halihazırda birleştirilmiş 647 nm, 561 nm ve 488 nm lazerleri 405 nm lazerle birleştirmek için
Lazer temizleme filtresi (647)647 nm lazerden diğer dalga boylarını temizlemek için Chromazet640/20x
Lazer temizleme filtresi (488)SemrockLL01-488-25488 nm lazerden diğer dalga boylarını temizlemek için
DAPI görüntüleme için kullanılanLED ışık kaynağıExcelitasX-Cite120LED
Ayna montajıNewportSU100-F3K
Optik direklerNewportPS-2
Sıkıştırma çatalıNewportPS-F
Güç ÖlçerNewportPMKITLazer gücünü ölçmek için
Dikroik ışın birleştirici montajıEdmund Optics58-872C-Montajlı Kinematik Montaj, dikroik ışın birleştiricileri lazer uyarma düzeneğinde tutmak için
Tutma halkasıThorlabsCMRRdikroik ışın birleştirici montajları için kullanılır
Fiber Adaptör PlakasıThorlabsSM1FCFC/PC Harici SM1 ile Fiber Adaptör Plakası (1.035 "-40) Dişli
Z ekseni öteleme montajıThorlabsSM1ZZ Ekseni Çeviri Dağı, 30 mm Kafes Uyumlu
Akromatik Çift lensThorlabsAC050-008-A-MLØ 5 mm, Monte Edilmiş Akromatik Çiftler, AR Kaplamalı: 400 - 700 nm
Kafes PlakasıThorlabsCP1TM09M9 x 0.5 İç Dişli 30 mm Kafes Plakası, 8-32 Musluk
Kafesi Montaj ÇubuğuThorlabsER4Kafes Montaj Çubuğu, 4" uzunluğunda, & Oslash; 6 mm
Kafes Montaj BraketiThorlabsCP02B30 mm Kafes Montaj Braketi
Tek modlu fiber optikThorlabsP5-405BPM-FC-2Yama Kablosu, PM, FC/PC - FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Çok modlu fiber optikThorlabsM42L01Ø 50 ve mikro; m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Bağlantı Kablosu, 1 m
Akromatik Çift lens (mag lens)ThorlabsACN127-025-AACN127-025-A - f=-25.0 mm, & Oslash; 1/2" Akromatik Çift, ARC: 400-700 nm, "mag lens" içinde içbükey bir
lensAkromatik Çift lens (mag lens)ThorlabsAC127-050-Af=50.0 mm, Ø 1/2" Akromatik Çift, ARC: 400-700 nm, "mag lens" de dışbükey bir lens
Tutma halkasıThorlabsSM05PRRSM05 ø için plastik tutma halkası; 1/2" Lens Tüpleri ve Yuvaları, "mag lens"
içinNaylon uçlu vidaThorlabsSS3MN6M3 x 0.5 Naylon Uçlu Ayar Vidası, 6 mm Uzun, "3D lens" tutmak
için3D lensCVI Lazer OptikRCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700f=10 m, dikdörtgen silindirik lens
EMCCD kameraAndoriXon Ultra 888
100 nm çok kanallı boncuklarThermoT7279, TetraSpeck mikro küreler
kırmızı boyaThermoAlexa Fluor 647
sarı-yeşil boyaGE HealthcareCy3
yeşil boyaGE HealthcareCy3B
mavi boyaThermoAlexa Fluor 488
tutarlı yükseltmek için uzunluk , Yalnızca

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
  4. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
  5. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  6. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  7. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  8. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  9. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  10. Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
  11. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
  12. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  13. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  14. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  15. Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
  16. Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
  17. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  18. Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
  19. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  20. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  21. Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
  22. Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopySuper Resolution ImagingSingle Molecule FRETMulticolor DetectionEpifluorescence ImagingOptical AlignmentLaser ControlEmission Filter Wheel3D Lens InsertionData Acquisition Card

Related Articles