Yöntem makalesi

Kas Myosin II Contractility üzerinden katlanmış gastrulasyon sinyal yolu Drosophila S2R + hücrelerde araştırmak için bir hücre tabanlı tahlil

9.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58325

⸱

19 Ağustos 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology, Reed College, 3Carolina Center for Genome Sciences, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill

Bu makalede

Özet

Burada bir contractility tahlil Drosophila S2R + hücreler kullanarak açıklar. Eksojen bir ligand katlanmış gastrulasyon (sis), uygulama yolu ve hücresel contractility sinyalizasyon sis harekete geçirmek yol açar. Bu tahlil hücresel contractility proteinler yol sinyalizasyon sis Yönetmeliği araştırmak için kullanılabilir.

Özet

Apikal daralma katlanmış gastrulasyon (sis), salgılanan epitel morphogen tarafından başlatılan beyannamedir Drosophila hücreleri kullanarak bir hücre tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil, sis bir agonist Rho bir G-protein-birleştiğinde reseptör (sis), bir Gα12/13 protein (akordiyon/Cta) ve bir PDZ etki alanını içeren guanin nükleotid değişim faktörü (RhoGEF2) içeren bir sinyal çağlayan etkinleştirmek için kullanılır. Bir contractile çanta dize biçiminde aktin sitoiskeleti hızlı ve dramatik yeniden yapılanma sonuçlarında sinyalizasyon sis. Çözünür sis istikrarlı hücre satırından toplanan ve ectopically S2R + hücrelere, apikal daralma gibi morfolojik değişiklikler gastrulasyon gibi gelişimsel süreçler sırasında bir süreç gözlenen önde gelen uygulanmıştır. Bu tahlil yüksek üretilen iş tarama için mükellef ve RNAi, kullanarak ek genler bu yolu dahil tanımlaması kolaylaştırabilir.

Giriş

Embriyo genetik model organizmalar ile yürütülen çalışmaların nasıl hücre dokuları monte edilir bizim anlayış için çok değerli kanıtladık. Drosophila melanogaster, çalışmaların özellikle, anahtar genlerin ve morfogenetik doğrudan biyolojik ilkeler tanımlaması ve organizmaların gelişimi için döllenme yetişkinlik1,2 yol , 3. genetik araştırması Drosophilaile paralel olarak, meyve sineği dokulardan türetilmiş kültürlü hücre hatları da geniş bir moleküler gidermek için güçlü bir sistem olarak ortaya çıkmıştır ve hücre biyolojik sorular4, 5 , 6. drosophila doku kültürü hücreleri, oda sıcaklığında ve CO2olmadan kültürlü oldukları gibi bakım için en az gereksinimleri vardır. Bu nedenle, yüksek çözünürlükte görüntüleme için mükellef olduklarını ve onlar-si olmak yüksek derecede gen inhibisyon duyarlılık RNAi6,7tarafından. Birçok grup Drosophila doku kültürü hücrelerin genler hücre şekil, hücre iskeleti dinamikleri, canlılığı, fagositoz ve sinyal iletim yollarının4,8tanımlamada yer keşfetmek için bir araç olarak kullanmış, 9,10,11. Bir model ile birlikte bütün hayvan olarak istihdam, kültürlü Drosophila hücre hatları molekülleri geliştirmesi için önemli tanımlaması hızlandırmak ve hangi için bir çerçeve sağlamak çok tamamlayıcı yaklaşımlar bir dizi teklif onların mekanik rolleri12belirlemek. Burada, bir hücre tabanlı tahlil apikal daralma üzerinden katlanmış gastrulasyon (sis) yolu13,14tetikleme sinyal yolları çalışmaya açıklar. Bu hücre tabanlı contractility tahlil araştırmacılar her ikisi de yolu ve kas myosin II contractility düzenleyen moleküler mekanizmaları sinyalizasyon sis araştırmak için izin verir.

Gastrulasyon erken Drosophila embriyo genetik bir model olarak uzun yıllar morfogenez epitelyal ve mezenkimal hücre kimliğini epitel hücre geçiş için çalışılmıştır. Gastrulasyon önemli olaylar, tek sıra halinde gelen embriyonik ventral midline için piramit Şekil15,16,17,18boyunca epitel hücrelerinin bir alt morfogenez biridir. Bu basit hücre şekli meşru mezodermal hücre içselleştirilmesi sonuçlarında değiştirmek ve kas myosin aktin ağ16,19,20constricting II motor aktivite tarafından tahrik edilmektedir. Genetik araştırma onlarca para nereye moleküler bileşenlerini tespit etti ve sırayla onlara aşağıdaki sıraya göre yer vardır: 1) sis, ventral orta hat; epitel hücrelerinin apikal etki alanından salgılanan 2) sis G protein eşleşmiş eş reseptörleri için sis ve duman, bağlar ve heterotrimeric G-protein Gα12/13 alt birim kanonik olmayan GEF Ric-8 tarafından refakâtçi akordiyon (Cta), içeren karmaşık sinyaller; 3) Cta bir guanin nükleotid exchange faktörü, RhoGEF2, küçük G-protein Rho1 sırayla etkinleştiren etkinleştirir; 4) Rho kinaz (Rok); Rho1 etkinleştirir 5) böylece üreten apikal daralma (Şekil 1)15,21,22 Kas myosin II contractility, düzenleyici hafif zincir (RLC), fosforilasyon apikal etki alanına Rok etkinleştirir ,23,24,25,26,27,28,29. Normal gastrulasyon ve kanat disk ve tükürük bezleri, bu yolu Drosophila çeşitli aşamalarında kullandığını gösteren dahil olmak üzere diğer morfogenetik hareketleri, bu bileşenleri birkaç mutasyonların müdahale embriyogenez30,31,32. Sis yolu bir en çok çalışılmış modellerin epitelyal şekillendirmeye yarayan ve nasıl doku düzeyinde morfogenez önemli anlayışlar sitoiskeleti tahrik hücre hareketleri14' e,15 Gen transkripsiyonu düzenlenmiş sağlamıştır ,21.

Biz birçok sinek embriyo17geliştirmede gözlenen hücresel yanıt-e doğru aşağı sis beyannamedir bir hücre tabanlı contractility tahlil geliştirilmiştir. Biz onun C- myc bakır sülfat (CuSO4) eklenmesi orta olarak hasat edilebilir bir indüklenebilir metallothionine organizatörü kontrol altında ile terminus, sis ifade hücre satır öğesini istikrarlı bir S2 mühendislik. Sis şartına medya S2 hücre reseptörleri Frizzled ve integrin alt birimleri gibi fark onların ifade tarafından seçkin bir alt satır olan ectopically S2 reseptörleri + (S2R +) hücrelere, uygulandığında hücreleri bir yeniden yapılanma geçmesi sitoiskeleti apikal daralma12,17,27,33son derece anımsatan. Bu değişikliklerin hangi siste tedavi yol açar faz-karanlık katlar radyal bir artış gösterge görünümünü kas myosin II contractility faz kontrast mikroskobu veya floresan mikroskopi sis tedavi nereye götürecek için dikkat edilmesi Kas myosin II yüzük EGFP öğesini RLC34ifade hücrelerdeki oluşumu. Bu halkalar bir myosin fosforile düzenleyici hafif zincir (pRLC) görünür üzerinden immunostaining23,34,35içerir. Bu sis kaynaklı yanıt Cta, RhoGEF2, Rho ve Rok gerekli; Böylece, rekombinant sis-Myc ve S2R + hücreler kullanarak, sis kaynaklı daralma bir doku kültürü-tabanlı sistem24,25,34araştırmak için bir araç kurduk.

Protokol

1. bakım Drosophila doku kültürü hücrelerin

  1. S2R +, S2R + RLC:-EGFP ve S2:Fog korumak-Myc hücreler tercihen arasında 20 ° C ve 25 ° C, % 10 fetal Sığır serum, 100 adet/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 0,25 Amfoterisin B ile takıma kalkan ve Sang M3 böcek Orta oda sıcaklığında bir Yoğunluk Hayır 5 x 105 hücre/mL daha düşük.
    Not: Alt hücre yoğunluğu ölüme sebep.
  2. Hızlı bir şekilde cryo korunmuş tüpleri hücre çözülme ve bir doku kültürü şişesi aktarabilirsiniz. Bir küçük doku kültürü şişesi ile (12,5 cm2 veya 25 cm2) hücre kültür ortamının 4-5 mL hacminde kültür kurulur ve çözülme nedeniyle hücre ölümü belirtileri sönmeye başladı kadar başlayın.
    Not: Çözülme nedeniyle hücre ölümü belirtileri bir yumuşak, yuvarlak şekil ve doku kültürü orta gösterge nekrotik hücre hücresel enkaz küçük karanlık bit eksikliği yapışık olmayan hücreler içerir.
  3. Yavaş yavaş doku kültürü boyutu kadar hücreleri % 100 confluency, nereye hücreler arasında yer biraz yok ve onlar birbirlerine kazık kadar başlar için birkaç gün (4-8 d) için rahatsız edilmeden büyümeye izin vererek çap. Tüm hücreleri bu % 100 konfluent daha küçük 12,5 cm2 veya 25 cm2 şişeye hücre kültür orta 10 mL ile desteklenmiş bir daha büyük doku kültürü şişesi (Toplam 75 cm2) aktarın.
    Not: 75 cm2 şişeye hücrelerde Bakımı çoğu deneyler için yeterince hücre ortaya çıkarır.
  4. Hücreleri yukarı ve aşağı, herhangi bir gevşek yapıştırılan hücre doku kültürü plastik çıkarmak için kullanarak hücre kültür orta pipetting her 3-4 d geçiş. Şimdi taze bir şişesi resuspended hücreleri içeren bu orta aktarın. Hücreleri 1:4 her geçiş ile taze hücre kültür orta ile sulandırmak ve gerektiği kadar yineleyin.

2. RNAi tedavi Drosophila S2R + hücre

Not: Rogers ve Rogers bakın6 dsRNA böcek kültür için uygun üretmek nasıl ayrıntılı talimatlar için.

  1. S2R + hücre canlılığı için hiçbir alt kültür medya RNAi tedaviler için 5 x 105 hücre/mL, tam kalkan ve Sang M3 kullanarak hücre daha elverişli bir yoğunluk, 6-şey veya 12-iyi doku kültürü plaka aktarın.
  2. Doku kültürü mahallede çalışma, eski hücre kültür orta yavaşça 6-şey veya 12-iyi doku kültürü plakası tilting ve hücre kültür orta bir pipet ile aspirating çıkarın. Hemen bu eski hücre kültür orta ile 1 mL taze hücre kültür ortamının her kuyuya pipetting tarafından değiştirin.
    Not: hücreler gevşek 30-45 dk önce hücre kültür orta alışverişi için bağlı kalmak için izin sonra bu önemli kaybı olmadan yapılabilir.
  3. Rogers ve Rogers detaylı protokol sonrası oluşturulan dsRNA 10 µg/mL ekleyin her şey RNAi koşul başına hücre doku kültürü orta içine doğrudan pipetting tarafından6 .
  4. Günlük, taze orta 1 mL ve 10 µg/mL dsRNA RNAi koşul başına hücre kültür orta yerine bu yordamı yineleyin.
    Not: RNAi deneyleri genellikle 7 d için yapılmaktadır; Ancak, tam zamanlama protein ciro ve dsRNA etkinliği bağlıdır. Diğer hedefler daha uzun tedaviler6gerektirirken RNAi tedaviler 3 d kısa etkili bir şekilde hücreleri belirli proteinlerin tüketmek.

3. üretim ve hasat sis

  1. S2:Fog büyüme ölçeklendirme-4-8 d bir neredeyse % 100 konfluent 75 cm2 şişe hücrelerinin hücre kültür orta (veya alternatif olarak, hücre kültürü orta 20 mL 150 cm2 şişeye) 10 mL maxi için elde etmek için rahatsız edilmeden büyümeye izin vererek Myc hücreleri mize sis üretim.
  2. 100 mM CuSO4 (100 mm CuSO4 için 150 cm2 şişesi 100 µL) için veya neredeyse % 100 konfluent 75 cm2 şişeye metallothionine organizatörü indüksiyon için 50 µL ekleyin. Oda sıcaklığında 48 h için kuluçkaya.
  3. Ve bir 15 mL veya 50 mL konik tüp için transfer pipetting tarafından doku kültürü balonun sis Myc içeren orta çıkarın. 2500 x g hücreleri ve hücresel enkaz orta temizlemek 10-15 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.
  4. Temizlenen hücrenin orta için yeni bir konik tüp aktarmak ve buza korumak. Gruplar halinde çalışma, rejenere selüloz Membranlar ile 3,000 MW yoğunlaştırıcıları 15 mL 5 mL temizlenen orta de aktarmak ve 2500 x g 30 dk için 4 ° C'de de orta konsantre teker teker santrifüj kapasitesi.
    Not: Alternatif olarak, daha büyük bir hacim kapasitesi ile yoğunlaştırıcı kullanılan (50 mL) olabilir. Toplama sırasında sis ile zenginleştirilmiştir, daha koyu renkli orta, V şeklinde filtre alt kısmında inşa etmek başlayacak.
  5. Dar kurutma başlığını "V" altına pipet ucu yerleştirin ve bir taze 1.7-mL microfuge tüp transfer ve Santrifüjü her turun arasında daha koyu renkli ortam çıkarın. Buz medyada bakımı.
  6. Aynı dar kurutma başlığını kullanarak tekrar daha koyu renkli kaldırarak adım 3.4 ve 3.5 yoğun sis-Myc medya ve daha fazlası ile yerine precleared orta, orta 1'e konsantre geçmeden onun orijinal hacminin (yani, 1 mL den 10 mL 10 Başlangıç materyali).
  7. Yoğun sis-Myc 4 ° C'de depolayın
    Not: sonra depolama, depolama uzun bir süre neden olabilir bakteriyel kontaminasyon için izlemek emin olun.
  8. SDS-sayfa 10 µL yoğun sis-Myc orta bir lysate oluşturmak için denaturing bir SDS içeren arabellek 10 µL ile karıştırılarak gerçekleştirin. SDS-sayfa jel 35, çalıştırmak için yaklaşık 1 h. mA Transfer jel nitroselüloz membran (veya PVDF membran için alternatif olarak,) 120 1 h için anne. Batı bir leke 150-kDa grup algılamak için herhangi bir ticari olarak mevcut Myc antikor kullanarak gerçekleştirin.
    Not: Sis-Myc konsantrasyon klimalı ortamda toplu değişebilir. Tahlil gerçekleştirmek için sis-Myc tam konsantrasyonu belirlemek gerekli değildir ancak her toplu iş iş etkinliği deney gerçekleştirmeden önce test edilmelidir.
  9. Aşağıdaki adımları 3.1-3.2, hücre kültür ortamından S2 hücre neredeyse % 100 konfluent 75 cm2 şişeye 10 mL (ya da alternatif olarak, 20 mL 150 cm2 şişeye üzerinden) pipetting tarafından toplayarak denetim S2 klimalı ortam hazırlamak. S2 hücre kültür orta için taze bir 15 mL veya 50 mL konik tüp aktaracağım.
  10. Aşağıdaki adımları 3.4-3.7, aralıklarla (bir seferde 30 dk 4 ° C'de 2500 x g ) de lysate hücreleri ve hücresel enkaz temizleyin ve temizlenen hücrenin lysate yoğunlaştırıcıları için aktarmak ve onları kontrol orta toplu işlemleri için konsantre için santrifüj kapasitesi 1/10 özgün birimi.
    Not: Uygulama S2 şartına medya önemli hücre contractility tahlil yol açmaz.
  11. Konsantre S2 denetim medya 4 ° C'de birkaç ay için saklayın.
    Not: depolama sonra bulaşma için izlemek emin olun.

4. Concanavalin-A-kaplı cam popolu yemekleri ve kaplama S2R + hücre hazırlanması

  1. Concanavalin (a con) çözüm 10 mL 10 mL su 0,5 mg/mL nihai bir konsantrasyon için içine con A 5 mg çözülerek olun. Aliquot bu çözümde daha uygun birimler (1 ml 500 µL) ve -20 ° C'de saklayın
  2. Her yemeğin cam bölümü 200 µL con A çözüm ile kaplama tarafından 35-mm cam popolu yemekleri hazırlamak ve bulaşıkları yaklaşık 2 dak, oda sıcaklığında bir doku kültürü Hood için kuluçkaya. Daha sonra (hangi-ebilmek muhafaza ve gelecekteki deneyler için yeniden) tüm con bir çözüm kaldırmak ve yemekler tamamen kurumasını bekleyin.
    Notlar: Yemekleri büyük gruplar halinde hazırlanan ve 6 aya kadar bir laboratuvar tezgah çekmece gibi kuru bir yerde depolanabilir.
  3. Yaklaşık 2 mL taze hücre kültür ortamının her cam popolu yemek için ekleyin. S2R + hücreler tarafından tahlil hücre kültür herhangi bir gevşek yapışan hücreleri ayırmak için kullanarak orta yukarı ve aşağı, pipetting tarafından test edilecek resuspend.
  4. Resuspended hücreleri S2R + % 50-%70 birleşmesi arasında yani taze hücre kültür ortamı içeren 35-mm cam popolu yemekleri aktarın. Doku kültürü mikroskop altında hücre yoğunluğu yukarı ve aşağı birkaç hücre sayısı bir tahmin almak için ortamda askıya hücreleri ovalarında aracılığıyla odaklanarak denetleyin.
    Not: % 50-%70 confluency ulaşmak için gereken hücreler uygun yoğunluğu deneme yanılma yoluyla elde edilebilir.
  5. Hücreleri con-A-kaplı cam popolu yemekleri için 45-60 dk takmak izin verir.
    Not: Tam olarak ekli S2R + hücreler 'kızarmış yumurta-benzeri,' görünür düzleştirilmiş ve faz-koyu.

5. sis şartına orta ve hücresel Contractility tahlil etkinlik testi

  1. İstenirse, sis-Myc verim üretilen ve S2:Fog konsantre onaylamak-Myc istikrarlı hücreleri SDS-sayfa ve western Blot çizgilerle. SDS içeren örnek arabelleği 10 µL yoğun sis-Myc ve kaynatın 5 dk. için standart SDS-sayfa ve western Blot iletişim kuralları izleyin ve sis-Myc üretim onaylamak Anti-Myc leke 10 µL ekleyin.
  2. Yavaşça pipetting tarafından tüm kalkan ve Sang M3 orta hücrelerden ekli S2R + adım 4.3 kaldırın ve dikkatli bir şekilde geri 75 µL sis şartına orta kullanılan miktarını sınırlamak için taze kalkan ve Sang orta ekleyin.
  3. Sis şartına medya 75 µL adım 5.2 sis şartına medyaya kalkan ve Sang M3 medya 1:1 oranında 150 µL toplam hacim getirmek için cam popolu çanak cam bölümüne ekleyin.
    Not: 150-200 µL toplam hacmi tam tipik bir cam popolu yemek cam bölümü karşılamak için gerekli; Ancak, bu kullanılan cam popolu çanak boyutlara göre değişir.
  4. Contractility hücrelerin hücre alanın tamamının gözlemlemek için 20 X veya 40 X büyütme kullanarak faz kontrast mikroskobu tarafından izlemek. Hücre morfolojisi izlemek ve faz karanlık ve gösterge şekli değişikliği karıştırmaktan faz ışık alternatif desen için arayabilirsiniz.
    Not: Sis uygulanması genellikle % 30 - % 50 için S2R + hücre hücresel daralma geçiren yol açar ve 10 dakika sonra hücreleri dinlenmek, kendi düz kenarlı, kızarmış yumurta gibi morfoloji dönen başlar.
  5. Hücresel contractility sağlamlık izleme. Hücre yanıt 1:1 oran taze kalkan ve Sang orta orta sis şartına kullanarak çok güçlü ise, yoğun sis-Myc orta gelecekteki deneyler için tasarruf etmek için orta sis şartına miktarını azaltmak. 1:1 oran için sağlam hücresel daralma yol değil su katılmamış sis şartına orta kullanın; Genel olarak 1:3 oranında deneme başarıyla yürütmek için yeterli yanıt üretir.
    Not: taze kalkan ve Sang orta orta sis şartına uygun oranı göz önüne alındığında orta sis şartına toplu başına kurulduktan sonra bu oran diğer deneyler için kullanın.
  6. Kas myosin II dynamics sırasında hücresel contractility tahlil GFP öğesini düzenleyici hafif zincir (S2R +: Sqh-EGFP) ifade eden istikrarlı S2R + hücre satırı kullanarak izleyin.
  7. Sis şartına orta kurulan oranını taze kalkan ve Sang M3 orta olarak 5.2-5.5, adımları kullanarak hücre kültürlü orta bir pipet ile kaldırın ve geri taze kalkan ve Sang orta camlı popolu çanak cam bölümü ekleyin. Sis şartına orta önceden belirlenmiş oranında görüntü sırası canlı hücre alınıyor ise sıvı; Cam popolu çanak perfüzyon sırasında hareket olarak kendine iyi bak.

6. sabitleme ve dar S2R + hücreleri boyama

  1. % 10 paraformaldehyde çözüm PEM arabellek (100 mM borular, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,9) kullanarak S2R + hücreleri tamir.
    Not: PEM tampon 2 x hisse senedi çözüm, genellikle yapılır ve ay 4 ° C'de depolanan
  2. Pipetting tarafından sis tedavi S2R + hücre hücre kültür orta kaldırma ve hemen 1.5-2.0 mL % 10 paraformaldehyde çözeltisi ile değiştirin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    Not: Sabit hücreleri fiksasyon çözüm 4 ° C'de günlerce saklanabilir; Ancak, ilk 15 dk fiksasyon hücreleri 4 ° C'ye aktarma önce oda sıcaklığında yapıldığını önemlidir
  3. Pipetting tarafından %10 paraformaldehyde çözümü kaldırmak ve bu organik atık ürünü uygun şekilde atın. Hücreleri nazikçe 1.5-2.0 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) 35 mm cam popolu çanak pipetting tarafından durulayın. Pipetting tarafından eski PBS kaldırın ve kalan fiksasyon çözümü kaldırmak için taze PBS 2 x daha 1.5-2.0 mL ile değiştirin.
    Not: Hücreleri bu noktadan itibaren üzerinde iletişim kuralında kurumasına da önemlidir.
  4. Yaklaşık 200 µL % 5 normal keçi serum %0,1 non-iyonik deterjan (PBST) Oda sıcaklığında 20 dakika ile takıma PBS içinde seyreltilmiş hücrelerle engelleyin.
    Not: Genellikle, ikincil antikorlar büyüdü organizma eşleşen serum engelleme çözümleri içerir.
  5. Birincil antikor çözüm PBST içinde sulandrarak hazırlayın. Yaklaşık 200 µL hacmi tamamen cam popolu çanak cam kısmını kapsayacak şekilde kullanın.
    1. Pipetting tarafından engelleme çözümü kaldırmak ve birincil antikor çözüm doğrudan yemeğin cam bölümüne ekleyin. Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya veya alternatif olarak, bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    2. Gecede 4 ° C'de kuluçka tamamlamayı buharlaşma önlemek için parafilm ile 35-mm cam popolu çanak.
  6. Pipetting tarafından birincil antikor çözümü kaldırmak ve 35 mm cam popolu yemek için taze PBS pipetting 1.5-2.0 mL tarafından hücreleri durulayın. Pipetting tarafından PBS kaldırmak ve taze PBS 2 x daha 1.5-2.0 mL ile değiştirin.
  7. İkincil antikor bir çözüm PBST içinde sulandrarak hazırlayın. 200 µL hacmi sadece çanak cam bölümü karşılamak yeterli olduğunu.
    1. İkincil antikor çözüm doğrudan yemeğin cam bölümüne ekleyin. Oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikor çözüm hücrelerle kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de
    2. Parafilm ile 35-mm çanak buharlaşma önlemek için bir gecede, kuluçka Eğer wrap.
  8. Pipetting tarafından ikincil antikor çözümü kaldırmak ve yemek için taze PBS pipetting 1.5-2.0 mL tarafından PBS hücrelerle durulayın. Eski PBS kaldırmak ve yerine aşağıdaki aynı yordamı 2 x daha,.
  9. Sabit ve lekeli hücreleri yeterince cam popolu 35-mm çanak cam kısmını kapsayacak şekilde bir anti-fade floresan montaj orta ekleyerek korumak.
  10. 4 ° C'de ve ışıktan uzak örnekleri saklayın.
    Not: Floresan sinyal yavaş yavaş ay içinde bile düzgün depolanan çürüme. En iyi sonuçlar için görüntü bir hafta içinde.

7. görüntüleme ve hücresel Contractility testin miktar

  1. Görüntü bir standart kullanarak S2R + hücreleri sabit faz kontrast, DIC veya yetenekleri düşsel floresan ışık mikroskopla ters. 20 X veya 40 X büyütme kullanarak, hücre hücre yoğunluğu, 200 görüntüleri elde etme amacı ile bağlı olarak 10-30 örtüşmeyen görüntü alanları veya koşul başına daha fazla hücre yakalamak.
  2. Standart hücre sayaç kullanarak, say ve sözleşmeli (faz-karanlık, bonneted hücreleri) ve yakalanan her alan başına noncontracted hücre kaydedin.
    Not: En iyi iki araştırmacı sözleşmeli ve noncontracted hücrelerinin bağımsız sayar sahaya sahip olmak veya alternatif olarak, aynı araştırmacı aynı görüntü alan hücre üç kez, sözleşmeli bir ortalama sayısı için izin güvenebilirsiniz ve noncontracted hücre başına hesaplanacak.
  3. Birkaç con-A-kaplı cam popolu yemekler deneysel koşul başına 4.2. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. Pipet herhangi bir gevşek yapisan S2R +: Sqh-EGFP hücreleri çıkarmak ve % 50-%70 birleşmesi 35-mm cam popolu yemeklerinde böylece onları plakası için hücre kültür orta yukarı ve aşağı. Hücreleri 30-45 dakika takmak izin verir.
  4. Görüntü S2R +: Sqh-EGFP hücreleri canlı bir iplik-disk, süpürüp götürdü-alan confocal mikroskop ya da ışık sayfalık mikroskobu tarafından 60 X - 100 X büyütme kullanarak. Kalkan ve Sang M3 orta ekli S2R +: Sqh-EGFP hücreleri içeren cam popolu çanak kaldırın.
    1. Sis-Myc şartına orta önceden belirlenmiş oranını adımları 5.2-5.5 cam bölümü bir pipet, çanak üzerinde objektif konumunu rahatsız etmek dikkatli olarak kullanarak cam popolu yemeğin üzerine doğrudan gelen taze kalkan ve Sang M3 orta olarak sıvı. Görüntüler için 12-15 dk başlatma ve tam S2R +: Sqh-EGFP hücreleri daralma yakalamak için kazanmak.
      Not: sigara kas myosin veya myosin-pRLC için boyama eğer hücrelerin yüzeyinde bir sıkı myosin halka oluşumu da contractility göstergesidir. S2R +: Sqh-EGFP hücreleri canlı, EGFP öğesini RLC benzer oluşturacak sıkı Imaging (bkz. Şekil 3) göstergesi contractility, yüzük. Oluşan şekil değişikliği "Kaporta için", hücrelerin 3D şekil alarak neden olur; mikroskop odak düzlemi bu hücre şekil değişikliği izlemek için ayarlanması gerekebilir. Altında RNAi koşulları kontrol etmek için genellikle, % 30-%50 hücre daralma sis eklenmesi üzerine geçmesi. Bazı RNAi koşullar daralma sis yokluğunda neden olabilir unutmayın.

Sonuçlar

S2 ve S2:Fog-Myc hücreleri bir 150 cm2 doku kültürü şişesi konfluent koşullarda yakın yetiştirilmiştir ve 25-75 µM CuSO4 ile bir sis-Myc (Şekil 2) ifade ikna etmek için 24-48 saat boyunca tedavi edildi. S2 hücreleri (Şekil 2A) ve S2:Fog örnekleri-Myc hücreleri (Şekil 2B) çıkarıldı ve sis-Myc üretim western blot tarafından izlenen. Beklendiği gibi biz herhangi bir koşullar altında S2 hücrelerden hasat medya sis-Myc algılamak başarısız oldu. Ancak, biz sis medya S2:Fog hasat tespit etmedi-Myc istikrarlı hücre kültürünü gibi erken endüksiyon 75 µM CuSO4ile sonraki 24 saat. Bir EGFP olarak etiketlenmiş düzenleyici hafif zinciri (GFP-RLC) kas myosin II (Şekil 3A ve 3B) ifade con-A-kaplı cam popolu yemekleri bağlı S2R + hücreler. Canlı hücre görüntüleme bir 100 X ile donatılmış bir ters mikroskobu performansı / 1.4 NA objektif lens sis şartına medya perfüzyon sırasında. Yaklaşık 5 dakika tedavi sonrası ile sis-Myc, RLC yüzük olmayan kas myosin II daralma gösterge kurdu. Bu halkalar immunostaining S2R + hücre insan myosin RLC (rakamlar 4A ve 4B) Ser19 çevreleyen artıkları için karşılık gelen bir sentetik phosphopeptide karşı harekete geçirilen bir antikor ile görülebilmektedir. Bu antikor Drosophila ile RLC cross-reacts.

Burada kontrol RNAi hücrelerle ve dsRNA Rho1 karşı 7 günlük tedavi aşağıdaki hücresel contractility tahlil temsilcisi bir örneği var (rakamlar 5A - 5E). S2R + hücreler con-A-kaplı cam popolu yemekleri üzerinde kaplama ve sis şartına ile tedavi (+ sis) veya denetim ortamlardan (-sis). Sözleşmeli hücre sayısı sonra fiksasyon sayısal. Daralma faz yoğun katlar gösterge tükenmiş kontrol hücreleri sis şartına ortamla (Şekil 5B) tedavi önemli. Şekil 5' teC, S2 şartına orta ile tedavi Rho tükenmiş düz kenarlı, kızarmış yumurta gibi morfoloji tipik bir örneği hücrelerdir. Not Rho sis sinyal yolu, ayrıca sitokinez bir rol oynar; Böylece, Rho tükenmiş hücreleri kez düzgün bölmek, hücre boyutunu ve Ploitlik bir artış yol başarısız. Tükenmiş medya tipik sis şartına hücrelerle yol açar % 30 - % 50 için hücre daralma, geçiren önemli daralma Rho tükenmiş hücrelerdeki gözlemlemek başarısız oldu, ancak denetim tedavisinde.

figure-results-1
Resim 1:yolu sinyal sözde sis. Sis yokluğunda, Gα12/13 alt birimi, akordiyon (Cta), Gϒ ve Gβ, bağlama ortakları ile birlikte etkin olmayan ve sis ve duman Co reseptörleri ile ilişkili. Ric-8 Cta etmez ve onun hücre altı yerelleştirme düzenler. Sis üzerine bağlama, Cta Gϒ ve Gβ acemi RhoGEF2 nerede GTP küçük GTPazlar Rho1 de GSYİH karşılığında tromboksan hücre zarı için disassociates. GTP bağlı Rho1, şu anda etkin Rho kinaz (Rok), onun harekete geçirmek ve sonraki hücresel contractility önde gelen RLC kas myosin, in phosphorylates etkinleştirir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Resim 2 : Zaman-ders sis-Myc üretimin. Bu paneller hücre kültür bir çevre % 100 konfluent şişesi(a)kontrol S2 hücreleri veya (B) S2:Fog--dan hasat orta göster-Myc istikrarlı hücreleri. Hücreleri bir 24-48 saat boyunca 25-75 µM CuSO4 ile tedavi edildi. Hücre kültür orta toplanan ve SDS-sayfa ve western Blot için hazır. Sis-Myc bir anti-Myc antikor tarafından tespit edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3 : Sis kaynaklı daralma canlı hücre görüntüleme. Hücre EGFP öğesini RLC kas myosin II sis şartına medya perfüzyon sırasında tarafından süpürüldü-alan confocal mikroskobu görüntüsü, ifade S2R + hatları kararlı. Saat, dakika ve saniye gösterilir. (A) Bu panel 0 zamanında cep-coverslip arabirimi yakın odak düzlemi görüntüsünü gösterir: sis-Myc. (B) Bu panel perfüzyon zaman serisi gösterir önce 00 (0:30-10:00) hücrenin üstündeki bir odak düzlemi çekilen görüntülerin. Beyaz okları kas myosin II düzenlenmesi sırasında daralma contractile yüzük içine EGFP-RLC tarafından belirtildiği şekilde gösterir. Ölçek çubuğu 10 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4 : Fosforile-RLC yerelleştirir contractile halkalara daralma indüksiyon sis-Myc. tarafından takip S2R + hücreleri sabit ve aktin phalloidin (kırmızı) kullanarak, fosforile phosphoserine-19 antikor (yeşil) kullanarak RLC ve DAPI (DNA, mavi) için denetim (A) veya (B) sis Myc şartına medya ile tedavi sonrasında lekeli. Fosforile RLC yeniden yapılanma içine yüzük sis-Myc. eklenmesi üzerine Not Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5 : Sis indüklenen hücresel contractility testin temsilcisi quantification. S2R + hücreler için 7 gün (A ve B) denetim RNAi veya küçük GTPazlar Rho1 karşı (C ve D) dsRNA ile tedavi edildi. Bu sefer, hücreleri con-A-kaplı cam popolu yemekleri üzerinde kaplama ve (A ve C) denetim veya (B ve D) sis Myc şartına ortamlardan ile tedavi edildi. Ölçeğin temsil eder 10 µm. (E) A dağılım çizim bar koşul başına sözleşmeli hücreleri kısmını ortalama ve % 95 güven aralıkları gösterir. Bireysel puan görüş alanı 40 X büyütme (alan başına 10-120 hücreleri), başına sözleşmeli hücre kısmını temsil ve sayıları parantez içinde sayılan hücreleri toplam sayısı sözleşmeli ve anlaşmalı olmayan hücreler için üç ayrı gösterir RNAi deneyler. Yıldız Tukey'nın birden fazla karşılaştırma post hoc analizi ile tek yönlü ANOVA (p < 0.0001) tarafından belirlenen RNAi ve sis tedavi koşulları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gösterir. Kumanda ile ya da sis-Myc-klimalı ortam ile tedavi Rho1 RNAi tedavi örnekleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark (NS) olduğunu unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Burada, kas myosin II daralma sis yanıt olarak geçer bir Drosophila doku kültürü hücre hattı (S2R + hücreler), kullanarak bir hücre tabanlı contractility tahlil için detaylı bir protokol mevcut sinyal. Bu tahlil kas myosin II contractility düzenleyen mekanizmalar yanı sıra sis yolu soruşturma için yararlıdır.

Hücre kültürü çalışmalarının dikkat edilecek noktalar:
Koşullar altında hangi S2R + hücreler bu tahlil üzerinden güvenilir veri elde etmek için önemlidir tutulur. Contractility yöntemi, kalkan ve Sang M3 böcek ortamda S2R + hücreleri korumak en iyi gerçekleştirmek planlama yaparken. S2R + hücreler diğer böcek hücre kültür medyada gelişmek iken (Örneğin, SF900 veya Schneider'ın böcek orta), genellikle sis için onların yanıt kaybederlerdi. Yüksek geçiş numarası, genellikle daha--dan 20-25 pasajlar, olan S2R + hücre RNAi için duyarlılık kaybetmeye başlar. Tüm deneyler için erken geçiş hücreleri kullanmak en iyisidir. Bir başka önemli yönü RNAi tükenmesi deneyleri için uygun kontrollerin seçmektir. Ortak negatif denetimler içerir dsRNA EGFP veya pBlueScript, ben de hedefleyen Homoloji sinek genom için sahip. Sis yolu (Rho, Rok, vb) proteinler hedefleme, hangi, boşaldığında, kas myosin contractility aktivasyonu önlemek için aynı zamanda yararlı denetimleridir. S2:Fog-Myc hücreleri 100 adet/mL ile 100 µg/mL streptomisin, penisilin takıma SF900 gibi bir alternatif hücre kültürü ortamında tutulan ve SF900 hücre kültürü çalışmalarının ne zaman 0,25 Amfoterisin B. Not o FBS zorunlu değildir. Hücre yoğunluğu da tüm yönleri Drosophila doku kültürü hücreleri ile önemli bir bileşenidir. Memeli doku kültürü hücreleri, Drosophilaaksine-türetilmiş doku kültürü hücreleri daha yüksek hücre yoğunluğu altında iyi gelişmek (yoğunlukları Hayır 5 x 105 hücre/mL daha düşük). Miktar sözleşmeli karşı olmayan sözleşmeli hücre-ecek var olmak son derece sıkıcı gibi ancak, bu tahlil yaparken, bu hücreleri con-A-kaplı cam popolu yemekleri % 80 izdiham, yukarıda kaplama değil önemlidir.

Kritik yönleri ve hücresel Contractility testin alternatif yaklaşımlar:
Sis, kas myosin II contractility, tetikler ligand üretimi bu testin önemli bir bileşenidir. Sis gen 730 amino asitler protein ~ 78 kDa26tahmin edilen moleküler ağırlığı ile kodlar. Hydropathy çözümleme gerinmek Fog'un amino-bu salgı sinyal dizi olarak işlev olabilir terminus adlı 12 hidrofobik kalıntıları ortaya. Ek olarak, kodlama dizisi de daha fazla salgılanan protein26sis olduğunu düşündüren potansiyel N ve O bağlı glikozilasyon için birden çok site içerir. Bu destek, sis meşru epidermal hücrelerin apikal daralma16geçiren salgı veziküller için yerelleştirilmiş. Sis-Myc ifade bakır sülfat orta eklenmesi üzerine akımıdır ve kültür ortamdan bir 150-kD proteinin indüklenen kültürler hasat ama değil medya sis-Myc yapı eksik S2 hücrelerden indüklenen sis veya Myc karşı antikor tanıdı. Bu molekül ağırlığı daha yüksek tahmin edilen 80-kD moleküler ağırlığı sis ve S2 hücreler salgı makine glycosylate protein ekzositozu önce olabilir öneriyor. Sis arıtma potansiyel değişkenlik nedeniyle sis şartına medya aynı toplu iş için tüm deneylerin kullanılması önerilir. Yoğun sis-Myc medya büyük toplu işlem yapma tutarlılık deneyler tur boyunca korumada yardımcı olacaktır.

Bu tahlil başarısı da güvenle daralma uğramıştır hücreleri tanımlamak bağlıdır. Tanımlamak ve dar hücreleri ölçmek için en güvenilir yol faz kontrast veya DIC mikroskobu aracılığıyla dar hücreleri floresan mikroskopi tarafından aktin ya da kas myosin II, boyama tarafından gözlenen ise. Doğru sayıları 20 X - 40 X büyütme en standart ışık mikroskoplar kullanılarak elde edilebilir. Yazılı iletişim kuralı burada cam popolu yemekleri kullansa da, tahlil da standart 1,5 cam coverslips con a ile kaplı kullanarak gerçekleştirilebilir Doku kültürü her tahlil için kullanılan sis miktarını sınırlamak için parafilm yerleştirilen bir coverslip üzerinde 35 mm sis ilavesi yapılabilir. Kötü sabit hücreler için yanlış mutlak yol açabilir gibi fiksasyon kalitesini tahlil önemli bir bileşenidir. Taze fiksasyon çözüm kullanarak ve emin hücreleri hiç kuru sabit bir kez daha güvenilir sonuçlara neden. Son olarak, çok sayıda hücreleri saymak önemlidir. Genellikle, sadece % 30-%50 tedavi edilmediği veya kontrol hücreleri RNAi tedavi sis perfüzyon daraltır. Ancak, çok sayıda hücre tedavileri nedeniyle herhangi bir değişiklik dar hücreleri kısmını sağlamak için gerekli değildir S2R + hücrelerde, gerçekleşen daralma bazal bir düzeyde vardır. Ayrıca, bazı proteinler kas myosin II contractility yönetmelikte yer alan tükenmesi hiper-contractility, sis yokluğunda bile neden olabilir. Burada sunulan ve aynı toplu işlem medya sis şartına üç ardışık RNAi tedavilerde sayıldı 3.600 hücreleri yerinden veridir.

Hücresel Contractility tahlil uygulamalar:
Eleme yöntemleri, RNAi ile birleştiğinde bu contractility tahlil hücre sinyallemesi, morfogenez ve hücresel contractility çalışmak için güçlü bir sistem sunuyor. Daha önce bu iki sis Co reseptörleri21birini tanımlamak için kullanılmıştır. 138 G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) hedeflenen bir ekran RNAi hücrelerdeki S2R + tarafından tüketilmiş ve onun yetenek sis için yanıt vermek için burada sunulan protokolünde açıklandığı gibi denetlesinler. 138 GPCRs, tek bir daha önce uncharacterized gene, şimdi sis bilinen ortaya çıkarılmıştır. Sis işlev içine daha fazla araştırma sadece sis indüklenen hücresel contractility hücrelerdeki S2R + için gerekli oldu, ama aynı zamanda gelişmekte olan Drosophila21gastrulasyon için gerekli gösterdi. Ayrıca, bu tahlil Ric-8, kanonik olmayan GEF olduğunu da bir bileşen siste yolu27sinyal göstermek için kullanıldı. Ric-8 Gα12/13 alt birim Yöneticisi ve sis indüklenen hücresel contractility için31 önemlidir hücre içindeki yerelleştirmek için işlevler etkileşim contractility tahlil ile birleştiğinde epistasis RNAi deneyler bir dizi gösterdi .

Hücreleri kolayca oda sıcaklığında muhafaza, CO2 gerektirmeyen veya hücre kültür orta arabelleğe alınmış ve uygun hücre kültür yoğunlukları tutulur sürece sağlam olarak drosophila doku kültürü acemiler için son derece uygundur. Hücresel contractility tahlil nerede hiçbir deneyimi az kodlamayla hücreleri veya mikroskobu ile öğrenciler vardı laboratuvar bölümünü bir lisans hücre biyoloji ders tarafından başarıyla gerçekleştirildi. Burada sunulan hücresel contractility tahlil gen bulma gelen istihdam edilebilir bir güçlü, hücre tabanlı araç temsil eder veya yol sinyalizasyon sis sorguya çekmek için yemek servisi bizi daha iyi anlamak, apikal daralma gibi gelişim süreçlerini ve Kas myosin II contractility, genel olarak.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Yazarlar Rogers laboratuvar ve Applewhite laboratuvar, Greta Glover ve bu protokol gelişmesine katkıda bulunan öğrenciler Reed College bahar 2018 Hücresel biyoloji ders, teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, yazarlar dikkatle okumak ve bu el yazması düzenleme için Ritz laboratuvar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen Araştırma Ödülü numarası 716964 D.A.A. ve A.R. ve Reed College Biyoloji bölümü altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
S2R+ hücreleriDrosophila Genomics Rezorce Center 150hücre kültürü hattı, Fog S2 ile tedavi edildiğinde kasılma gösterir
: Fog-myc hücreleriDrosophila Genomics Rezorce Center 218hücre kültürü hattı, pMT promotörü S2R + altında Fog-myc üretir
Sqh-EGFP hücreleriDrosophila Genomics Resorce Center 196hücre kültürü hattı, EGFP Shield ve Sang M3 ile etiketlenmiş Sqh'yi (kas dışı miyozin II'nin RLC'si) kararlı bir şekilde ifade eder
Sigma-AldrichS3652hücre kültürü
ortamı SF900 böcek ortamıThermofisher Scientific12658019alternatif hücre cutlure ortamı
Schneider' s böcek ortamıThermofisher Scientific21720024alternatif hücre cutlure ortamı
Fetal Sığır SerumuThermofisher Bilimsel16000044medya takviyesi
Antibiyotik-Antimikotik (100X)Thermofisher Scientific15240112antimikrobiyal/antifugal medya takviyesi
Concanavalin AMP Biomedicals150710bulaşıkları ve lameller kaplamak için kullanılır hücresel yapışma için
Cam alt plakalarMaktekP35G-1.5-10tahlil için ve hücreleri sabitlemek ve boyamak için kullanılır
Cam kapak fişleriCorning2940-225cam tabanlı tabaklara alternatif
Protein yoğunlaştırıcılarMilliporeUFC90300830.000 moleküler ağırlık kesme,
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 doku kültürü şişeleriGenessee ortamını konsantre etmek için kullanılır25-204,25-206,25-208,25-210kültürlemek için kullanılır
6 oyuklu ve 12 oyuklu doku kültürü kaplarıGenessee25-105, 25-106hücreleri kültürlemek için kullanılır
hücreleri korumak içinfloresan montaj ortamıDakoS3023
%32 ParaformaldehitEMS15714-Shücreleri sabitlemek için kullanılır
HücreEMS19240 fiksasyon
Anti-Myc AntikoruDrosophila Hybirdoma Bankcat# 9E10Fog-Myc 'yi tespit etmek için kullanılır;
FosfoSerin-19 antikoruHücre SinyalizasyonuFosforile düzenleyici hafif zincir (RLC) serin 19
488-Phalloidin, 568-PhalloidinThermofisher ScientificA12379, A12380'eantikor, f-aktin
Hawk-VT çok noktalı dizi taramalı konfokal sistem için boyama ve nbsp;VisiTech InternationalS2R+:Sqh hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi için kullanılır
Eclipse TE300 Ters mikroskopNikonS2R+:Sqh hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi için kullanılır
: hücreleri Sabit için PEM tamponunda kullanılan boruları karşı

Kaynaklar

  1. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  3. Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. FlyBase portals to human disease research using Drosophila models. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).
  4. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology. Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).
  5. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
  6. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
  7. Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells. Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).
  8. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells. The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).
  9. Yi, C. H., et al. A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation. The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).
  10. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).
  11. Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen. Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).
  12. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), 98(2013).
  13. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  14. Leptin, M. Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
  15. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  16. Dawes-Hoang, R. E., et al. folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  17. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Häcker, U., Turck, C., Vale, R. D. Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner. Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).
  18. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  19. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  20. Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134 (3), 567-578 (2007).
  21. Manning, A. J., Rogers, S. L. The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis. Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).
  22. Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. Loss of Gα12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).
  23. Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).
  24. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  25. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  26. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  27. Peters, K. A., Rogers, S. L. Drosophila Ric-8 interacts with the Gα12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway. Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).
  28. Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis. Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).
  29. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  30. Myat, M. M., Andrew, D. J. Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia. Development. 127 (4), 679-691 (2000).
  31. Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).
  32. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  33. Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling. Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).
  34. Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).
  35. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Apikal Daralma DeneyiFog-koşullandırılmış Medyum UygulamasıFaz-kontrast MikroskobuParaformaldehit FiksasyonuRNAi Gen AzaltmaHücre Morfolojisi AnaliziKontraktil Büzgülü İp Oluşumu
Kas Myosin II Contractility üzerinden katlanmış gastrulasyon sinyal yolu Drosophila S2R + hücrelerde araştırmak için bir hücre tabanlı tahlil
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.