Yöntem makalesi

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

13.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58333

⸱

19 Şubat 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section of Virology, Department of Medicine, Imperial College

Bu makalede

Özet

3-b "karaciğer-on-a-chip" enfeksiyon hepatit B virüs ile deneyler gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlamak için bu protokolü hedefidir.

Özet

Nerede sadece üç viral genom deneysel olarak enfekte şempanzelerin kronikleşme içinde sonuçlanabilir, olağanüstü infektivite hepatit B virüsü (HBV) içinde vivo rağmen en tüp bebek modelleri birkaç yüz binlerce hücre başına viral genom gerektirir. geçici bir enfeksiyon başlatmak için sipariş. Ayrıca, birincil insan tetkikine (PHH) statik 2D kültürleri sadece kısa vadeli çalışmalar nedeniyle onların hızlı dedifferentiation izin. Burada, biz 3D karaciğer-on-a-chip kültürleri PHH, monocultures veya cocultures ile diğer nonparenchymal karaciğer yerleşik hücre tanımlamak. Bu fizyolojik konak hücre yanıt-e doğru uzun vadeli HBV enfeksiyonlarıdır eğitimi için önemli bir gelişme sunar. İlaç etkinliğini araştırmaları, toksikolojik analiz ve Patogenez soruşturmalar kolaylaştırıcı ek olarak, bu mikrosıvısal kültür sistemleri kovalent kapalı ortadan kaldırarak hedef alan HBV enfeksiyonu için şifalı tedaviler değerlendirilmesi olanaklı kılmak, Daire (ccc) DNA'sı. Bu yöntem PHH monocultures ve PHH/Kupffer hücre ortak kültürleri, saflaştırılmış HBV ile onların enfeksiyon ve ana bilgisayar yanıt analizini up açıklar. Bu yöntem, özellikle uzun vadeli etkileri HBV enfeksiyonu, tedavi kombinasyonları ve Patogenez değerlendirilmesi için geçerlidir.

Giriş

HBV çalışmanın birkaç yüz binlerce enfeksiyon1başlatmak için hücre başına HBV genomu kopya gerektiren kültür sistemlerinin, zavallı duyarlılık tarafından karmaşık. Ayrıca, birincil insan tetkikine genellikle son derece kırılgan ve hızla geleneksel kültürler2sırasında dedifferentiate. Gerçeğini esas olarak düz ve sert plastik yüzeyler karaciğer ve oksijen yokluğunda mikrosıvısal dolaşım, kültürlerin genel eksikliği içinde bulunan doğal hücre dışı ortamlarda taklit değil nedeni bu. Geleneksel statik hepatosit kültür kolajen kaplı plakalar üzerinde hızla dedifferentiate ve HBV enfeksiyonu3onların duyarlılık kaybetmek. Burada, kurulum ve geleneksel 2B statik PHH kültürler onların genişletilmiş metabolik ve fonksiyonel yetkinlik nedeniyle kolajen kaplı tabaklarda çok avantajlı bitti, 3D karaciğer-on-a-chip kültürler, yetiştirilen PHH enfeksiyonu tarif kolaylaştırılması en az 40 gün4uzun vadeli kültürleri. Bu sistemde, PHH sürekli oksijen ve besin hücrelere sağlamak için büyüme orta ile periosteum kolajen kaplı iskele üzerinde seribaşı. PHH için alternatif kültür sistemleri dayalı olsa bile fare fibroblastlar veya 3D büyüme pulcuklarının karmaşık cocultures doğrulandıktan ve HBV enfeksiyonu ilişkilendirmenin çeşitliliği 500 genom (GE) karşılıkları HBV enfeksiyonu hücre başına, 3D kullanarak yatkındır karaciğer-on-a-chip kültürler kalır tek tüp bebek modeli sistemi 0,05 duyarlı GE HBV hücre4başına. Bu ayrıca HBV enfeksiyonu kurmak için dimetil sülfoksit (DMSO) ve Polietilen glikol (PEG) yüksek konsantrasyonda kullanma gerekliliği tarafından bu kültürlerde 3D karaciğer-on-a-chip kültür sistemleri enfeksiyon için gereksiz olan desteklenen 4. HBV önemli işaretlerinden arasında tüm de üretilen novo-virions5,6için transkripsiyon şablon görevi görür cccDNA havuzu enfeksiyondur. CccDNA geleneksel hepatosit kültürler7,8' tespit edilebilir olsa da, ister cccDNA düzenlenmesi ve herhangi bir tedavi yaklaşımları onun eleme amaçlı olarak kısmen recapitulated olarak belirsizdir veya tamamen dediferansiye tetkikine. Biz o cccDNA işlevsel olarak 3D karaciğer-on-a-chip kültürlerde oluşturulur, fizyolojik uyaranlara yanıt verir ve transkripsiyon makine cccDNA genom4erişilebilirliğini engel tarafından hedef göstermiştir.

Bu enfeksiyon, hem de tedavi başarı için biyolojik tanımlaması etkinleştirme, HBV infekte hastaların gözlenen 3D karaciğer-on-a-chip taklit HBV enfeksiyonu için ana bilgisayar yanıt. Karaciğer-on-a-chip kültürlerin benzersiz özellikleri arasında PHH ve karaciğer Kupffer hücreleri4, yildiz seklinde hücre9ve karaciğer sinüsoidal dahil olmak üzere, içindeki diğer nonparenchymal hücreleri arasında uzun vadeli ana bilgisayar yanıt-e doğru değerlendirmek için yeteneğidir endotel hücreleri10,11. Bu karmaşık bir 3D microenvironment etkileşimlerde hücre/hücre değerlendirmek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır.

Ayrıca, bu platform genişletilmiş kültür döneminde geleneksel hepatosit kültür sistemleri kullanarak mümkün olmayan sıralı ilaç tedavileri değerlendirilmesi ve HBV sebat, üzerindeki etkilerini kolaylaştırır.

Bu protokolü nasıl 3D karaciğer-on-a-chip açıklar monocultures, PHH veya PHH cocultures Kupffer hücreleri ile kültürler oluşturulur. Ayrıca, saf HBV enfeksiyonu, düşük çeşitlilik araştırmaları üretimi yanı sıra ev sahibi ve viral yanıt daha sonraki analiz açıklar.

Protokol

1. montaj ve denge plakaların

  1. Kompresör ve vakum pompası LiverChip platformu ile ilişkili açık olduğundan emin olun. Derleme ve denge plakaların bir sınıf II kabine içinde gerçekleştirin.
  2. Aseptik mikrosıvısal tabak tabak Bankası arasındaki steril bir zar yerleştirerek ve iyi içeren üst plaka (Şekil 1a) ekleyerek birleştirin.
  3. Steril membran sorunsuz taban plakası, iki iğneli üzerinde düzensiz membran yerleşim uzlaşma beri mikrosıvısal dolaşım aittir emin olun.
  4. Steril plaka kapak eklemek ve bir otomatik hassas tork 33 sıra sıkma bir sarmal kullanarak lb için kullanarak plaka temelini vidaları sıkıştırın. Tüm vidaları kullanarak el ile bir tork 35 lb için sıkılır emin olun. Bu adım sırasında vidaları simetrik olarak sıkılır emin olun (Şekil 1a).
  5. Hepatosit tohumlama orta içeren Williams E orta, çözülme ve takviyeleri, % 5 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 µM deksametazon 37 ° c daha önce astar kaplama birincil hepatosit prewarm.
  6. Tamamen monte plaka içinde çamaşır dock yerleştirerek ve orta her şey rezervuar tarafına tohum hepatosit 400 µL ekleyerek Başbakan. Plaka çamaşır dock tamamen oturana emin olun.
  7. 1 µL/s'de 3,5 dakika yukarı doğru yönde akışı başlatın. Başarılı işlevi mikrosıvısal dolaşım plaka (Şekil 1a) tarafında kırmızı göstergeleri ile tespit edilebilir.
  8. Bir kez orta plaka hücre büyüme tarafına pompalanır, akışı Kanal doğru Meclisi sağlanması orta tohum hepatosit bir ek 1.2 mL ekleyin.
  9. Dikkatle plaka 37 ° C ve % 5 CO2 oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine transfer ve akışını 1 µL/s 16 h (Şekil 1 c) için akış hızında yukarı doğru yönde başlatmak.
  10. Plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyi kabarcıkları ortadan kaldırmak.
  11. Steril, filtre kağıdı, ardından bir hücre eki iskele ve istinat bir halkaya, steril forseps kullanarak her şey yuvarlak ekleyin. Her şey steril lavabo pompası ile aşağı istinat yüzük ve iskele (Şekil 1b) kilitlemek için tuşuna basın.
  12. Tüm Orta Aspire edin ve prewarmed hepatosit tohumlama Orta 400 µL yavaşça iskele üzerinde ekleyin ve akışını 3,5 dk 1 µL/s için aşağıya doğru yönde başlatmak.
  13. Tüm Orta plaka rezervuar yan dışarı pompalanır Aspire edin. Bu akışı kanal içinde yer alan orta değiştirmek için gerekli bir adımdır.
  14. Orta ve her şey iyi başına toplam hacim tamamlamak için dock plaka dönmeden önce tohum hepatosit 1.4 mL ekleyin. Birimin başına iyi şimdi 1.6 mL (1.4 mL iyi ve akış kanaldaki 0.2 mL) olduğunu.

2. çözülme ve Monocultures için tetkikine tohum

  1. Orta ve hepatosit tohumlama orta PHH bir şişe tedarikçiler yönergelerine göre çözülme önce 37 ° C olarak çözdürme hepatosit prewarm. Bir santrifüj ani sıcaklık değişiklikleri önlemek için bu adımı sırasında oda sıcaklığında kullanın. Çözme ve bir sınıf II kabine tetkikine, tohum gerçekleştirin.
  2. Hepatosit tohumlama orta 1 mL hücrelerde resuspend ve trypan mavi kullanarak hücreleri saymak. Hücrelerin canlılık %90 üzerinde olduğundan emin olun.
  3. Onlar için kuyu eklenene kadar hücreler buz üzerinde tutmak.
  4. Denge ve montajı plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin.
  5. 600.000 tetkikine hepatosit tohumlama orta 500 µL birimindeki her şey ekleyin.
  6. Akış debisi 1 µL/s'lik yönü aşağı yönde başlatmak ve toplam hacim kuyuda 1.6 mL orta tohum hepatosit 900 µL ekleyerek getir.
  7. Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO2oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon aktarın.
  8. 1 µL/s 8 h, yukarı yönde 1 µL/s 8 h için akış hızında bir akış ters tarafından takip için akış hızında aşağıya doğru yönde akışı başlatın.
  9. Plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin.
  10. Her iyi ve başlatmak akışını 1 µL/s için 3,5 dk akış hızında aşağıya doğru yönde 400 µL hepatosit bakım Orta (Hepatosit bakım takviyeleri ve 100 nM deksametazon ile desteklenmiş Williams E orta) ekleyin.
  11. Tüm Orta rezervuar Aspire edin ve 1.4 mL hepatosit bakım Orta (Şekil 1 d) ekleyin.
  12. Orta hepatosit bakım orta her 48 h ile değiştirin. İyi tüm orta yerine emin olmak için taze hepatosit bakım orta eklenmesi önce çamaşır adımı gerçekleştirin.
  13. Çamaşır adım için plaka çamaşır dock cihazına aktarmak, tüm Orta kuyulardan Aspire edin ve bakım Orta 400 µL ekleyin.
  14. Akışını 1 µL/s'de 3,5 dk. aspiratı aşağıya doğru yönde tüm Orta kuyuları rezervuar tarafında görünen başlatın.
  15. 1.4 mL hepatosit bakım orta ve oksijen inkübatör içinde 37 ° C'de ve % 5 CO2ekleyin, plaka belgili tanımlık rıhtım istasyon aktarmak ve akışını 1 µL/s 48 h (Şekil 1f) için akış hızında yukarı doğru yönde başlatmak.
    Not: Denetimler için cocultures, denetlenen koşullar, sağlamak için kullanılan hepatosit monocultures için cocultures birincil insan Kupffer hücreleri ile kullanmak için belirli olan bakım orta ikinci tür kullanılır. 48 h hepatosit bakım Orta (3. gün sonrası tohum) ile orta tohum hepatosit değiştirdikten sonra düzenli hepatosit bakım orta coculture bakım orta II, özellikle ne zaman için karşılaştırma PHH monocultures değiştirilecektir Orta bileşenleri olarak PHH ve Kupffer hücrelerinin cocultures biraz farklı.

3. çözülme ve Kupffer hücreleri ve tetkikine ortak kültürler için tohum

  1. Amacıyla doğru bir karşılaştırma sonuçları sağlamak için her zaman PHH/Kupffer hücre cocultures PHH monocultures için karşılaştırın
  2. Cocultures PHH ve Kupffer hücrelerinin erimek için bir şişe içinde ileri Kupffer hücrelerinin Dulbecco'nın deksametazon olmadan kartal Orta (AdDMEM) değiştirilen ancak birincil hepatosit çözdürme ile desteklenmiş ve kaplama (coculture orta tohum) according takviyeleri Tedarikçiler yönergeleri için. Çözdürme ve Kupffer hücreleri ve bir sınıf II kabine tetkikine tohum gerçekleştirin.
  3. 1 mL coculture orta tohum hücrelerinde resuspend ve trypan mavi kullanarak hücreleri saymak. Hücrelerin canlılık %90 üzerinde olduğundan emin olun.
  4. Hücreleri hücre adezyon önlemek için kuyu eklemeden önce buz üzerinde tutun.
  5. Birincil insan tetkikine çözdürme için adımlar 2,1-2.3 yönergeleri izleyin.
  6. Denge ve montajı plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin.
  7. 60.000 Kupffer hücreleri ve/veya 600.000 tetkikine toplam hacmi 250 µL her Orta tohum coculture her kuyuya ekleyin.
  8. Akış debisi 1 µL/s'lik yönü aşağı yönde başlatmak ve orta ve her şey tohum coculture 900 µL ekleyin.
  9. Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO2oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine aktarın.
  10. 1 µL/s 8 h, yukarı yönde 1 µL/s 8 h için akış hızında akış ters tarafından takip için akış hızında aşağıya doğru yönde akışı başlatın.
  11. Plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin.
  12. Coculture bakım Orta 400 µL eklemek için her iyi ve başlatmak akışını 1 µL/s için 3,5 dk akış hızında aşağıya doğru yönde ben (deksametazon hepatosit bakım takviyeleri ile desteklenmiştir ama olmadan AdDMEM).
  13. Rezervuar tarafından gelen tüm Orta Aspire edin ve coculture bakım orta 1.4 mL ekleyin ben her şey için.
  14. Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO2 oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine aktarmak ve akışını 1 µL/s 48 h için akış hızında yukarı doğru yönde başlatmak.
  15. Plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin. Coculture bakım orta II (deksametazon 100 nM hidrokortizon ve hepatosit bakım takviyeleri ile desteklenmiştir ama olmadan Williams E orta) 400 µL ekleyin ve akışını 1 µL/s'de 3,5 dk için aşağıya doğru yönde başlatmak.
  16. Tüm Orta kuyuları rezervuar tarafında görünen Aspire edin.
  17. Coculture bakım orta II 1.4 mL ekleyin ve Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO2oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine aktarın.
  18. 1 µL/s 48 h (Şekil 1e) için akış hızında yukarı doğru yönde akışı başlatın.
  19. Orta her 48 h coculture bakım orta II ile değiştirin. İyi tüm orta yerine emin olmak için taze orta eklenmesi önce çamaşır adımı gerçekleştirin.
  20. Yıkamak için plaka çamaşır dock cihazına aktarmak, tüm Orta kuyulardan Aspire edin ve coculture bakım orta II 400 µL ekleyin.
  21. Akışını 1 µL/s'de 3,5 dk. aspiratı aşağıya doğru yönde tüm Orta kuyuları rezervuar tarafında görünen başlatın.
  22. Coculture bakım orta II 1.4 mL ekleyin ve Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO2oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine aktarmak ve akışını 1 µL/s 48 h (Şekil 1f) için akış hızında yukarı doğru yönde başlatmak.

4. bir bulaşıcı hepatit B virüsü enfeksiyonu etütler imalatı

  1. Bu bölüm iletişim kuralının bir koruma düzey III laboratuvar gerçekleştirin. Tohum, orta değişiklikler, orta koleksiyonu ve bir sınıf II kabine virüs konsantrasyon yapmak.
  2. Kültür HBV üreten hücrelerin (örn, HepDE19, HepAD38) kolajen kaplı T1000 5 katmanlı şişe tam DMEM/F12 (%10 FBS, penisilin/steptomycin, önemli olmayan amino asitler, 500 μg/mL G418 ve 1 μg/mL tetrasiklin) 120 ml % 90 confluency ulaşana kadar.
  3. HBV üretim ikna etmek için indüksiyon Orta (tetrasiklin olmadan tam DMEM) orta değiştirin.
  4. Tam orta ses her 48 h 12 gün tetrasiklin sonrası çekilmesi için toplamak ve 4 ° C'de saklayın
  5. Toplanan orta 0,45 µm şişe ilk filtre ile filtre.
  6. 4 g/g son bir konsantrasyon için toplanan orta steril PEG 8000 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) içinde eklemek, 8 x-10 x ters çevirme mix ve 16 h. santrifüj 10.000 x g 1 h 4 ° C'de PEG çöktürülmüş virüs toplamak ve resuspend için de için 4 ° C'de kuluçkaya % 10 içeren PBS Pelet FBS.
  7. PEG çöktürülmüş virüs--dan tüm hasat zaman noktaları birleştirmek ve bir % 20 sükroz yastık üstüne katman. 140.000 x g bir SW28 rotor kullanarak 4 ° C'de 16 h için de santrifüj kapasitesi.
  8. Süpernatant Aspire edin ve Pelet PBS ile %10 FBS, ve aliquot içinde resuspend ve-80 ° C'de saklayın
  9. HBV DNA kopyalama numarasını süpernatant içinde mevcut HBV DNA qPCR (adım 6) belirlemek.

5. enfeksiyon HBV ile 3D kültürlerin

  1. Enfeksiyonlar bir sınıf II içinde bir koruma düzey III laboratuvar kabine gerçekleştirin.
  2. 3 gün sonra monocultures veya cocultures, tohum HBV içeren aliquots oda sıcaklığında gerekli sayıda çözülme ve sırasıyla gerekli virüs doz hepatosit bakım orta veya coculture bakım orta II şey, başına 1,8 ml seyreltik.
  3. Bu 1.8-mL sulandırılmış virüs çamaşır adım (400 µL) ve orta iyi (1.4 mL) değiştirilmesi için yeterlidir. Ancak, enfeksiyon gerekli çokluğu hesabına 1.6 mL son kültür hacmi için ayarlanması gerekir.
  4. Plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin. HBV içeren Orta 400 µL ekleyin ve tüm Orta görünen kuyuları rezervuar tarafında akışını 1 µL/s'de 3,5 dk. aspiratı aşağıya doğru yönde başlatmak.
  5. 1.4 mL başına orta II iyi ve 37 ° C'de ve % 5 CO2oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine plaka transfer HBV içeren bakım orta/coculture bakım ekleyin. 1 µL/s 8 h, bir akış hızı 1 µL/s'lik yönü yukarı doğru yönde bir ters tarafından takip için akış hızında aşağıya doğru yönde akışı başlatın.
  6. 24 h HBV, eklenmesi aşağıdaki plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin.
  7. Her yıkama de plaka kültür türüne göre karşılık gelen orta ile 3 x içinde özetlenen adımlar 2.12-2,14 kuyudan arta kalan virüs ortadan kaldırmak için. Adımlar 2.12-2,14, aksine orta 1.6 mL her kuyuya hesap inoculum ertelenmiş (Şekil 1 g) dışlamak için tatmak ilave birim için ekler.
  8. Bu çamaşır merdiven orta 200 µL ekstraselüler HBV DNA miktar tarafından HBV inoculum tümüyle kaldırılmasını onaylamak için her şey toplamak.
  9. Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO2oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon takabilir ve akışını 1 µL/s 48 h için akış hızında yukarı doğru yönde başlatmak.
  10. 48 saat sonra aşağı akım analizi, hepatosit bakım orta ile üç yıkama 2.12-2,14 adımlarda açıklandığı şekilde ardından tam iyi birimde toplamak. Orta yerine ve her iyi 3 x her 48 saat kadar deneysel fesih yıkayın.

6. miktar ekstraselüler HBV DNA'ın

  1. Kültür supernatants taşıyıcı RNA bir koruma düzey III lab 1 µg ilavesi ile üretici yönergelerine farklı bir alana taşımak önce örneklerinde virüs inactivation sağlamak göre toplam DNA izole et.
  2. Kantitatif PCR ana mix, 600 nM ileri astar, 600 nM ters astar, içeren bir ana karışım hazırlamak ve 300 nM sonda.
  3. 7 µL 384-şey plaka her kuyuya ana karışımı ekleyin.
  4. DNA örnekleri 5 µL yinelenen, bir no-şablon kontrol ve seri olarak seyreltilmiş HBV-standart genom içeren (örneğin, pCMV-HBV) plazmid tabanlı tepki tepki her kuyu başına 102 kopya başına 109 kopya arasında değişen kopyası eklemek qPCR plaka.
  5. Plaka üzerinde bir yapıştırıcı kapağını yerleştirin ve her şey doğru şekilde kilitlendi emin olun.
  6. 1dk 300 x gde plaka santrifüj kapasitesi.
  7. Üreticinin yönergelerine göre çalıştırmak qPCR başlayın. 95 ° C 10 min 95 ° C 40 döngüsü tarafından takip için döngüsü koşullardır gerçek zamanlı PCR 15 s ve 60 ° C için 1 dk için.
  8. Bilinmeyen örnekleri standart eğri göre içinde HBV DNA kopya sayısını ölçmek.

7. miktar, hücre içi HBV Pregenomic (pg) RNA

  1. Üreticinin yönergelerine göre iskele üzerinden toplam RNA yalıtmak. Tam hücre lizis sağlamak amacıyla, girdap her İskele yapısı-3 x 30 s her vortexing arasında aralıklarla 300 x g 1 dk. için de izledi. Hücre lizis koruma düzeyi farklı bir alana taşımak önce örneklerinde virüs inactivation sağlamak için III laboratuvar gerçekleştirin.
  2. CDNA dan izole RNA üretici yönergelerine göre uyarlamak.
  3. 25 ° C 10 dk, 37 ° C 120 dakika için döngüsü koşullar için retrotranscription ve 5 min için 85 ° C.
  4. CDNA örnekleri için 4 ° C'de tutmak kısa vadeli veya uzun süreli depolama için-20 ° C'de.
  5. PgRNA ve RPS11 içeren kantitatif PCR ana mix ve pgRNA ve RPS11 (kat hizmetleri gen kullanılan) için ileriye ve geriye doğru astar 0.2 µM son bir konsantrasyon, ana karışımları hazırlayın.
  6. 7.5 µL ana mix ve cDNA iyi başına 2.5 µL 384-şey tabağa ekleyin. RPS11 ve pgRNA yinelenen her örneğinin ölçmek ve no-şablonu her iki genler de kumandasında içerir.
  7. Plaka üzerinde bir yapıştırıcı kapağını yerleştirin ve her şey tamamen kilitlendi emin olun.
  8. 1dk 300 x gde plaka santrifüj kapasitesi.
  9. QPCR cycler eklemek plaka ve üreticinin yönergelerine göre standart kantitatif PCR protokolü kullanarak çalıştırmak qPCR başlar. 2 dk, 95 ° C için 2 dk, 95 ° C 40 döngüsü tarafından takip döngüsü gerçek zamanlı PCR 50 ° C koşullar 15 s ve 60 ° C için 1 dk için.
  10. PgRNA RPS11 göre ifade hesaplayın.

8. ayirt Viral antijen ile boyama

  1. İstinat Yüzük kuyudan çıkarın ve bir sınıf II kabine koruma düzey III laboratuarında forseps ile iskele kaldırın.
  2. Hücreyi içeren iskele %4 paraformaldehyde PBS 1 ml koruma düzey III laboratuvar oda sıcaklığında 30 dakika ile düzeltmek. Aşağıdaki adımları farklı bir alanda gerçekleştirilir.
  3. İskele 3 yıkama x 1 mL PBS ile.
  4. % 0.1 kullanarak hücreleri permeabilize Triton-X 100 PBS 1 ml oda sıcaklığında 1 h için.
  5. İskele 3 yıkama x 1 mL PBS ile.
  6. 4 ° C'de 16 h blok non-spesifik bağlama tarafından PBS 1 ml %1 BSA ile iskele kuluçka
  7. İskele 3 yıkama x 1 mL PBS ile.
  8. 16 h 4 ° C'de 1: %200 1 BSA PBS 1 ml içinde seyreltme, tavşan anti-hepatit B virüs core antijeni kullanarak birincil antikor boyama gerçekleştirmek
  9. İskele 1 yıkama x % 0.1 ile 1 mL PBS (PBS-ara) ve 3 x 1 mL PBS ile ara.
  10. Kullanarak ikincil antikor boyama gerçekleştirmek keçi Anti-tavşan IgG (H + L) çapraz adsorbe Alexa Fluor 594 Birleşik ikincil antikor 1:2,000 PBS 1 ml için 16 h 4 ° C'de % 1 BSA içinde seyreltme,
  11. İskele 1 yıkama x 1 mL % 0.1 ile PBS-ara ve 3 x 1 mL PBS ile.
  12. Oda sıcaklığında 10 dakika için PBS 1 ml 2 µg/mL bir konsantrasyon, DAPI kullanarak iskele counterstain.
  13. İskele 1 yıkama x 1 mL % 0.1 ile PBS-ara ve 3 x 1 mL PBS ile.
  14. İskele mikroskop slayda aktarmak ve görüntüleme için monte edin.
  15. Bir floresan mikroskop kullanarak iskele görüntü.

9. İnsan Albumini ELISA

  1. Bulaşıcı malzeme ile çalışıyorsanız koruma düzeyini III laboratuvar ayrılan bu bölüm iletişim kuralının bir sınıf II kabine içinde gerçekleştirin.
  2. Canlılık ve metabolik PHH işlevselliğini değerlendirmek için insan albumini üretiminde ELISA değerlendirin.
  3. Kat 96-şey pilakalar ve keçi anti-insan antikor kuyu başına 50 µL 1:800 kaplama arabellek (100 mM bikarbonat/karbonik asit, pH 9,6) içinde seyreltilmiş. Kuruyucu ve 37 ° C'de 2 h veya gecede 4 ° C'de için kuluçkaya
  4. Kaplama antikor plaka Aspire edin ve yıkayın 4 x %0,05 200 µL ile PBS-ara.
  5. Engelleme arabelleği (PBS % 1 BSA) 200 µL ekleme, kuruyucu ve onları 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya veya 4 ° C'de 3 ay için stok onları. Uzun süreli depolama için % 0.05 sodyum azid engelleme arabelleğe ekleyin.
  6. Engelleme arabellek Aspire edin ve 1 x %0,05 200 µL ile yıkayın PBS-ara.
  7. Daha önce seyreltilmiş örnek iyi (1: 100) / 50 µL ekleyin. Örnek seyreltici %0,05 %1 BSA içeren PBS-ara. 1 h 37 ° C'de veya gecede 4 ° C'de için kuluçkaya
    Not: standartları örnekleri aynı anda kuluçkaya. Bir konsantrasyon aralığı 500 – 0.488 ng/mL (1:2 seri dilutions) önerilir. İnsan Albumini tüm seri dilutions örnek seyreltici gerçekleştirin.
  8. Plaka örneklerinden Aspire edin ve yıkayın 4 x %0,05 200 µL ile PBS-ara.
  9. HRP-Birleşik keçi anti-insan albumini antikor 50 µL daha önce 1:10,000 örnek seyreltici içinde seyreltilmiş ekleyin. 37 ° C'de 2 h veya gecede 4 ° C'de için kuluçkaya
  10. Plaka antikor Aspire edin ve yıkayın 6 x %0,05 200 µL ile PBS-ara.
  11. TMB reaktif 100 µL ekleyin ve en kısa zamanda en yüksek standartları tam olarak gelişmiş, 100 µL 1 M H2yani ekleyin kolorimetrik reaksiyon durdurmak için4 .
  12. 450 absorbans okumak nm bir 96-şey plaka okuyucu analiz için.

10. interlökin (IL) 6 ve tümör nekroz faktör (TNF) α üretimi 3D Co kültürlerde

  1. Bulaşıcı malzeme ile çalışıyorsanız koruma düzeyini III laboratuvar ayrılan bu bölüm iletişim kuralının bir sınıf II kabine içinde gerçekleştirin.
  2. Birincil Kupffer hücreleri canlılığı ve işlevlerinin değerlendirmek için IL6 ve TNFα üretim ölçmek. Bu sitokinler Kupffer hücreleri tarafından üretimi ikna etmek için cocultures 1 µg/mL lipopolysaccharide (LPS) 9 d sonrası 48 h coculture bakım orta II tohum ile tedavi.
  3. Gün sonrası 11 Ekim tarihi, her şey ortamından hasat ve-80 ° C'de depolayın
  4. Kültür orta IL6 ve TNFα konsantrasyon tarafından uygun bir tahlil ve üreticinin yönergelerine göre ölçmek.

Sonuçlar

Biz birincil insan Kupffer hücreleri ve/veya tetkikine ve onların enfeksiyon HBV ile uzun vadeli kültür için basit ve çok yönlü bir platform tanımlamak. Birincil insan hücreleri kollajen kaplı polistren iskele sürekli büyüme orta (Şekil 1a) hücrelerle perfuses bir mikrosıvısal plaka derleme içindeki seribaşı.

Genellikle sadece sınırlı bir süre için geleneksel kültür sistemlerinde istikrarlı, PHH işlevsel olarak uzun bir süre için muhafaza edilebilir. Fonksiyonel hepatositler tarafından salgılanan ve hepatik metabolizma değerlendirilmesi için en iyi işareti olarak kabul edilir, insan albümin, stabil ve son derece 3D kültürler tarafından gün 40 sonrası tohum kadar (Şekil 2) ifade edilir. Cocultures için belirli sitokinler (örneğin, IL6 ve TNFα) salgılanmasını Kupffer hücre işlevselliği ve canlılığı değerlendirilebilir. Sitokin üretim ölçmek için LPS-cocultures uyarılması üzerine yakalama tabanlı algılama araçlarının kullanımı (Şekil 3) tavsiye edilir.

Hücreleri genellikle 3 gün içinde işlevsel safra kanalcık ve tam hücre polarizasyon (Şekil 2) gösteren PHH tohum, hepatik microtissues oluştururlar. Onların fizyolojik hücre metabolizması istinat ek olarak, bu kültürler HBV enfeksiyonu için son derece duyarlı hale gelir. HBV DNA ve diğer kültür sistemleri, aksine diğer viral işaretleri 2 gün sonrası enfeksiyondan (Şekil 4) kolayca algılanabilir hale gelir. Viral enfeksiyon salgılanan işaretleri yanı sıra, hepatosit içeren iskele alınabilir kültürler ve viral antijenler ayirt tespiti için kullanılan (örneğin, HBsAg, HBcAg) (Şekil 4). Nerede geleneksel hepatosit kültürler aşılama ile en az 500 HBV GE hücre ve % 2 DMSO ek ücret isteyen ve % 4 PEG, 0,05 HBV GE az olan DMSO veya PEG (Şekil 4) 3-b kültürlerde zorunluluğu olmadan enfeksiyon başlatmak mümkün.

figure-results-1
Şekil 1: 3-b karaciğer-on-a-chip kültürlerin Set-up. (bir) Bu bir Şematik düzeni kültür plaka Meclisi mikrosıvısal dolaşım kurulmasını sağlamak için 's. (b) Bu panel gösterir de dahil olmak üzere kültür wells, yakından görmek filtre kağıdı, iskele ve istinat yüzük. (c) Bu panel kültürler tohum önce plaka denge süreci gösterir. Sonraki iki panel (d) hepatosit monocultures ve (e) hepatosit/Kupffer hücre için cocultures tohumlama işlemi gösterir. (f) Bu panel çamaşır adımları fiş boşaltmaya karışan orta değişiklikler gösterir. (g) HBV enfeksiyonu kurulumu inoculum kaldırılması da dahil olmak üzere, bu panel gösterir. S.M. tohumlama orta, mm = bakım orta =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: hepatik microtissue oluşumu ve hepatosit canlılığı. (bir) Bu panel gösterir takip microtissue oluşumu gösteren 3D hepatosit monocultures görüntülerini boyuna aydınlık alan tohumlama. (b) Bu panel gösterir ayirt görüntüleme çekirdeği (mavi) kültürler ve insan albumini (yeşil). (c) Bu panel boyuna toplam albümin gösterir, hem de hücre başına hepatosit monocultures, 40 gün boyunca albümin üretim ELISA tarafından belirlendiği şekilde ayarlanabilir. Gösterilen veriler ortalama ± SD vardır Bu rakam Ortega Prieto ve ark.4den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: 3-b cocultures Kupffer hücre işlevindeki. Bu paneller göstermek salgılanmasını (bir) IL6 ve (b) TNFα hepatosit monocultures ve 11 gün insan manyetik kullanarak belirlenen tohum sonrası gün 9 mesaj tohum, exogenously eklenen LPS karşılık olarak hepatosit/Kupffer hücre cocultures Luminex tahlil. Bu rakam Ortega Prieto ve ark.4den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: HBV enfeksiyonu karaciğer-on-a-chip kültürlerde. (bir) Bu panel ayirt mikroskobu algılama HBcAg (kırmızı), HBsAg (yeşil) ve çekirdek (mavi) kültürleri ile HBV enfeksiyonu izleyen 10 gün gösterir. (b) Bu panel HBV DNA bir miktar olarak kültür supernatants tarafından belirlenen enfeksiyon, farklı çeşitlilikler kullanarak HBV enfeksiyonu kültürlerin duyarlılık gösterir. (c) Bu panel HBV pgRNA temizlik gen RPS11 göre boyuna birikimi miktar gösterir. Gösterilen veriler ortalama ± SD vardır Bu rakam Ortega Prieto ve ark.4den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Uzun vadeli PHH kültürleri korumak zorluklar birçok kültür modeli geliştirilmesi artırılmış işlevsellik ve uzun ömürlü, her farklı avantajları ve dezavantajları sergilenmesi ile tahrik. O şimdi 2D kültürleri statik PHH zaman çok sınırlı miktarda hepatosit biyoloji bazı yönlerini taklit eden yaygın kabul edilmektedir. Böylece, micropatterned12,13, küresel kültürler14,15, cocultures ve 3D karaciğer-on-a-chip kültürler16,17 hızla bu daha temel sistemleri değiştirme. Özellikle belirli microenvironments kullanmak için ev sahibi ile coevolved, bulaşıcı hastalıklar, okurken fizyolojik ortamlar sağlamak için gereksinim insan-tropic kültür kez zorlu doğa tarafından desteklenen bulaşıcı hastalıklar, Hepatit C virüsü, HBV ve sıtma gibi.

3D karaciğer-on-a-chip kültürler yerine en kritik kalite başlangıçta kaynaklı birincil hücre tiplerinin adımdır. Bu hücreler-meli var olmak sınav için onların bağlılık kapasitesi ve sadece plateable PHH çok başarılı doku oluşumu ve kültür üretimi sağlamak için kullanılmalıdır. Taze izole PHH kullanılabilir olsa bile, onların dondurma genellikle karmaşık ve özel dondurucular oranı kontrol gerektirir.

Geleneksel statik 2D kültürler, aksine ana bilgisayar genetik arka plan HBV enfeksiyonu duyarlılık açısından ihmal edilebilir düzeydedir ve tüm böylece uzak test hepatosit bağış HBV enfeksiyonu4kurmak mümkün.

Rağmen hasta elde edilen HBV enfeksiyonlar 3D kültürlerin kurar, PEG çöktürülmüş kullanmak zorunludur ve sukroz yastık-HBV indüklenebilir HBV yapımcı hücre kullanarak viral inocula üretimi için hatları her saf. Doğrudan 3D karaciğer-on-a-chip kültürler, inhibitör faktörleri veya tetkikine ile mevcut büyüme faktörlerinin bir uyumsuzluk nedeniyle yoluyla uygulanan hücre kültür supernatants kolayca enfeksiyonu neden değil. Plazma kaçınılmaz pıhtılaşıyor ve kültür platformu mikrosıvısal dolaşımını takunya beri Ayrıca, hasta kaynaklı viral inocula seçerken, yalnızca serum, kullanılmalıdır.

Kullanılan viral inoculum ne olursa olsun, hücresel canlılığı ve farklılaşma temin yanı sıra ilk HBV inoculum tümüyle kaldırılmasını sağlamak başarılı uzun vadeli enfeksiyon çalışmalar anahtarıdır. Bunu yapmak için en uygun yolu viral inoculum kaldırılması aşağıdaki gibi insan serum albümin düzeyleri kültür süresi boyunca ölçme kültürler örnekleme. Dikkat, tüm diğer açıklanan platformlar, HBV enfeksiyonu, benzer şekilde, bir kez kurulan, kolayca kandan hücrelere yayılmış değildir. HBV enfeksiyonu içinde vivo kolayca hepatosit karaciğer içinde çoğunluğu bulaşan beri bunun için altta yatan mekanizma zor kalır.

Açısından cocultures PHH ve Kupffer hücrelerinin tüm ticari olarak mevcut Kupffer hücre bağış eşit bir yanıt beri IL6 ve TNFα salgı LPS stimülasyon, yanıt olarak değerlendirmek için Kupffer hücrelerinin çok testleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir.

Önemlisi, bütün ilaç tedavileri veya HBV ile kültürlerin ilk enfeksiyon için kuyu (1.4 mL), de mikrosıvısal kanal (0.2 mL), tarihi itibariyle toplam hacmi alınmalıdır dikkate uyuşturucu ya da inoculum konsantrasyonları hesaplanması için. Doğru dozaj sağlamak için mikrosıvısal kanal Başbakan için bir yıkama adım HBV veya uyuşturucu içeren orta ile gerçekleştirilir.

Platformu kullanılan iskele içinde çok katmanlı tetkikine sağlayan şey, başı 600.000 PHH kullanır. Cep numarası farklı olsa bile, seçilen hücre toplama en iyi sonuçları sağlar. Plaka biçimi için 36 iskele yükseltilebilir 12 iskele toplam tutar. Ancak, mikrosıvısal gereksinimleri nedeniyle, daha iyi numaralarına kadar ölçeklendirme bugüne kadar mümkün değildir.

Bu yaklaşımları kullanarak, kültürler, şimdiye kadar yanı sıra yeni ilaç adaylarının değerlendirmek için farklı karaciğer hücre arasındaki karmaşık etkileşim çalışma benzeri görülmemiş fırsatlar sunan en iyi cep performans için en az 40 gün, ile korunabilir nüfus HBV enfeksiyonu sırasında.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Avrupa Araştırma Konseyi (637304), bir hoş geldiniz güven araştırmacı Ödülü (104771/Z/14/Z), başlangıç hibe ve CN Bio yenilikler tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler< / güçlü >
William's E Medium, fenol kırmızısı yokGIBCOA12176-01
Hepatosit Çözülme OrtamıGIBCOCM7500
Primer Hepatosit Çözdürme ve Kaplama TakviyeleriGIBCOCM3000
Primer Hepatosit Bakım TakviyeleriGIBCOCM4000
DMEM / F-12GIBCO11320-033
Gelişmiş DMEMGIBCO12491023
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokGIBCO14190-144
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA) 100xGIBCO11140050
Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)GIBCO15140-122
Fetal Sığır Serumu, ABD menşei, Isı ile İnaktive edilmiş, steril filtreli, hücre kültürüne uygunSIGMA12106C
HidrokortizonSIGMAH0888
Tripan mavisiMerckT8154
Baldır derisinden elde edilen kollajenMerckC9791
G418SIGMAG418-RO
TetrasiklinSIGMAT3258
Polietilen glikol 8000SIGMAP2139
SükrozSIGMASO389
Sodyum karbonat susuzSIGMA451614-25G
Sodyum bikarbonatSIGMAS5761
Sodyum azidSIGMAS2002-5G
Sülfürik asit, %99,999SIGMA339741
% 4 ParaformaldehitSIGMA252549
Triton-X 100SIGMAX100
Tween 20SIGMAP1379
DAPISIGMAD9564
Albümin (insan)SIGMAA9731
Fisher BioReagent  Sığır Serumu Albümini, Fraksiyon V, Isı Şoku UygulanmışFisher ScientificBP9701-100
ProLong Altın Antifade MountantInvitrogenP36930
TaqMan Universal Master Mix II, UNG UygulamalıBiyosistemler4440040
SYBR Select Master MixUygulamalı Biyosistemler4472903
Escherichia coli K12InvivoGentlrl-eklps
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Kitler/Sarf Malzemeleri
Steril membranCN Bio yenilikleriLC-SC
LiverChip Perfüzyon hücre kültürü plakasıCN Bio yenilikleriLC12
LiverChip kültür plakası kapağıCN Bio yenilikleriLC-SC
Steril yuvarlak filtre kağıdıCN Bio yenilikleriLC-SC
Hücre bağlantı iskelesiCN Bio yenilikleriLC-SC
Tutma halkasıCN Bio yenilikleriLC-SC
Steril pistonCN Bio yenilikleriLC-ST
Dneasy kan ve doku kitiQiagen69506
Rneasy mini kitQiagen74106
İnsan Manyetik Luminex testiR& D Systems
1 Adımlı Ultra TMB-ELISA Yüzey ÇözeltisiThermoFisher Scientific34028
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon KitiThermoFisher Scientific4368814
QIAamp Viral RNA Mini Aksesuar SetiRNA taşıyıcısıiçeren Qiagen
1048147 Millicell HY 5 katmanlı hücre kültürü şişesi, T-1000, sterilMillipore (Merck)
MicroAmp Optik 384 Kuyulu Barkodlu Reaksiyon PlakasıYaşam teknolojileri4309849
MicroAmp Optik Yapışkan FilmLife teknolojileri4311971
Şeffaf Düz Tabanlı İmmüno Steril Olmayan 96 Kuyulu PlakalarThermoFisher Scientific442404
96 Kuyulu Plakalar için Sızdırmazlık BandıThermoFisher Scientific15036
Nalgene Hızlı Akışlı PES Membranlı Steril Tek Kullanımlık Şişe Üstü FiltrelerThermoFisher Scientific295-3345
Fisherbrand  Zemin Kenarlı Mikroskobik Slaytlar, Twin FrostFisher ScientificFB58628
Tüpü, İnce Duvar, Ultra Şeffaf, 38,5 mL, 25 x 89 mmBeckman Coulter344058
AdıŞirketKatalog NumarasıgüçlüYorumlar
Birincil hücreler / Hücre hatları
İnsan Plakalanabilir Hepatositler, Taşıyıcı NitelikliThermo Fisher ScientificHMCPTS
Dondurularak Korunmuş İnsan Kupffer HücreleriThermo Fisher ScientificHUKCCS
HepDE19 hücre hattıHaitao Guo (Indiana Üniversitesi, IN, ABD)
< güçlü > İsim< / güçlü> < güçlü > Şirket < güçlü > Katalog NumarasıComments
Primers/Probes/Standards
HBV DNA ileri primerInvitrogen5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV
DNA ters primerInvitrogen5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'HBV
DNA probuInvitrogen5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA
pgRNA ileri astarInvitrogen5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'pgRNA
ters astarInvitrogen5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'RPS11
ileri astarInvitrogen5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11
ters astarInvitrogen5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV
Profesör Christoph Seeger (Fox Chase Kanser Merkezi, PA, ABD)
Name< / strong><strong>Company< / strong>Katalog Numarası< / strong>Yorumlar< / strong>
Antikorlar< / güçlü>
Anti-Hepatit B virüsü çekirdek antijen IgG fraksiyonu (poliklonal)DAKOLot 10102505Laboratuvarları'nı durdurdu
.A80-129A
İnsan Albümini çapraz adsorbe edilmiş Antikor, A80-229PBethyl Laboratuvarları içinde. incA80-229P
Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 594ThermoFisher Bilimsel#  A-11072Lot 1431810
AdıCompanyKatalog Numarası<strong>Comments
Equipment
LiverChip Vakum pompasıCN Bio yeniliklerLC-PN
LiverChip Pnömatik BağlantıCN Bio yeniliklerLC-PN
LiverChip platformuCN Bio yenilikleriLC-PN
LiverChip plaka yıkama iskelesiCN Bio yenilikleri
Otoklavlanabilir metal forsepsVWR232-0106
Vortex Genie 2Bilimsel endüstrilerSKU: SI-0236
Optima XPN-80 UltrasantrifüjBeckman CoulterA95765
Heraeus Multifuge X3R SantrifüjTermo Bilimsel75004500
SAM-12 Tıbbi Emme Yüksek Vakumlu Yüksek AkışlıMGE dünyaçapında  SAM12/01010101
NUAIRE 5800 SERİSİ kuluçka makinesiNUAIRENU-5841
Otomatik hassas torkCN Bio yenilikleri
Manuel torkCN Bio yenilikleri
LiverChip kompresörCN Bio yenilikleri
Luminex LX-200 xPONENT 3.1Luminex
ile cihazMillipore El Tipi Manyetik Ayırıcı BlokThermoFisher ScientificMillipore & trade; 40-285
FluoStar Optima Plaka OkuyucuBMG Labtech
KOLVER Hassas elektrikli tornavidalarVTECH ltdFAB10RE/FR
KOLVER Güç kaynağıVTECH ltdEDU1FR
BAMBI VTS75DHava EkipmanlarıDurduruldu
Integra VacuboyINTEGRA
ViiA 7 384 Kuyulu Bloklu Gerçek Zamanlı PCR SistemiThermoFisher Scientific4453536
PFHYS1008, İnsan Albümin Antikoru, A80-129A Bethyl

Kaynaklar

  1. Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection. Viruses. 8 (9), (2016).
  2. Elaut, G., et al. Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures. Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).
  3. Konig, A., et al. Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes. Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).
  4. Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682(2018).
  5. Allweiss, L., Dandri, M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses. 9 (6), (2017).
  6. Guo, J. T., Guo, H. Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics. Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).
  7. Lucifora, J., et al. Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes. Scientific Reports. 8 (1), 5390(2018).
  8. Hosel, M., et al. Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).
  9. Mazza, G., et al. Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization. Scientific Reports. 7 (1), 5534(2017).
  10. Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).
  11. Hwa, A. J., et al. Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes. The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).
  12. Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
  13. March, S., et al. Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens. Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).
  14. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
  15. Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
  16. Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. Engineering liver. Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).
  17. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikroakışkan KültürHBV EnfeksiyonuKonak Yanıt AnalizicccDNA Değerlendirmesiİlaç Etkinliği ÇalışmalarıFizyolojik Model Sistemi
"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.