Drosophila bacak Motor Nöron aksonlar yetişkin kütikül aracılığıyla görselleştirmek

Omurgalı bacak gibi Drosophila yetişkin bacak parça halinde düzenlenmiştir. Her sinek bacak her biri birden çok kas lifleri^1,2oluşur 14 Kas içerir. Yetişkin bacak MNs hücre organlarının T1 (prothoracic), (mesothoracic) T2 ve T3 (metathoracic) gangliyon ventral sinir kablosu (VNC), bir yapısal omurgalı spinal kord (Şekil 1) benzer her tarafında yer alır. Hangi hedef Ipsilateral bacak (coxa, trochanter, femur ve tibia) dört segmentlerinde (Şekil 1)³kas her gangliyon içinde yaklaşık 50 ans vardır. Önemlisi, her bireysel yetişkin bacak MN hayvanlar^3,4arasında son derece kökleşmiş benzersiz bir morfolojik kimliğe sahiptir. Bu benzersiz MNs sırasında larva aşamaları^3,4bacak MNs üreten neuroblasts (NBs) adı verilen 11 kök hücrelerden türetilir. Bütün larva aşamaları sonunda olgunlaşmamış postmitotic MNs metamorfoz sırasında onların belirli dendritik arbors ve kendi benzersiz morfoloji^3,4tanımlamak aksonal terminal hedefleri elde etmek için ayırt etmek. Daha önce bir birleşimsel kodu transkripsiyon faktörlerinin (TFs) her Drosophila yetişkin bacak MN⁵benzersiz morfoloji belirtir hipotez test ettik. Bir model olarak, soy B, postmitotic yetişkin bacağından MNs ifade TFs Kombinatorik kurallarına onların bireysel türleri morfoloji dikte gösterdi ve yedi MNs dışarı üretir 11 NB soy kullandık. MNs TF kodunu REPROGRAMING tarafından biz tahmin edilebilir bir şekilde MN türleri morfoloji geçmek mümkün olmuştur. Bunlar TFs diyoruz: mTFs (morfolojik TFs)⁵.

Yetişkin MNs morfolojik analiz en zorlu kısmı kalın ve auto-floresan kütikül yüksek çözünürlüklü aracılığıyla aksonlar görselleştirmek etmektir. Biz genellikle aksonlar MNs içinde DVglut-Gal4gibi bir ikili ifade sistemi ile ifade edilen bir membran öğesini GFP ile etiket /UAS-mCD8::GFP veya DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, DVglut güçlü bir sürücü olarak ifade nerede motoneurons⁶. Bu araçlar repressible işaretçisi (MARCM)⁷, CIS-MARCM⁸veya MARCMbow⁵ile mozaik çözümlemesi gibi klonal diğer tekniklerle birleştirerek, fenotipik analiz yapma MNs altgrupları GFP ifade kısıtlayabilirsiniz akson daha kolay. Belirli sorunları (1) Yetişkin bacak iç yapıları fiksasyonu gibi yetişkin Drosophila bacak iç ele alarak bacak MN aksonal morfoloji görüntüleme ve sonraki 3D yeniden inşası için sağlam tutmak için bir protokol üretilip axon morfoloji, endojen floresan ifade ve bacak kas, etkileyen bir coverslip altında ve görüntüleme ve (3) görüntü işleme manikür elde etmek için uygun yönde genel yapıyı korumak için bacak (2) montaj arka plan olarak aksonal floresan sinyal. Bu iletişim kuralı MN aksonlar floresan ifade tespiti için ayrıntılı iken, eklembacaklılar bacak neuromusculature diğer bileşenleri görselleştirmek için uygulanabilir.

1. bacak diseksiyon ve fiksasyon

1. Bir cam çok iyi levha ve wells ile % 70 etanol doldurmak uygun sayıda alır. 15-20 CO₂ekleyin-imzalat uçar (ya seks ve herhangi bir yaş) her şey ve sinekler tam batık kadar bir fırça kullanarak, yavaşça etanol çözüm içine sinek kurulamak.
   Not: Bu adım manikür hydrophobicity kaldırmaktır. Bu otomatik-floresan manikür, artırdığı için daha--dan 1 dakika için yıkama yok.
2. 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x % 0,3 Nonyonik yüzey aktif deterjan solüsyonu ile 3 kez sinekler durulayın. Sinekler bu çözüm için en az 10 dakika tutun.
   Not: Bacaklar daha iyi bacak içinde sabitleştirici penetrasyonu artırmak büyük olasılıkla deterjan eklerken sabitlenir.
3. %4 paraformaldehyde (PFA) bir tüp ile birlikte buz üzerinde çok iyi bir tabak koyun.
   Not: Taze %4 hazırlanması PFA bir çözümden % 16 PFA etanol ücretsiz stok önemlidir.
4. Forseps baş ve karın "Sineklerin Tanrısı" torasik segment veya bacaklar zarar vermeden kaldırmak için kullanın.
   Not: karın kaldırmak anında tutun ve bacaklar incelemek daha kolay hale getirir.
5. Legs--dan torasik segment forseps ile incelemek ve bacaklar % 4 içeren kuyu yer PFA. Bunun için bacak ayırır kadar iyi pens ucunu kullanarak coxa toraks kavşağında nazikçe ama sıkıca itin.
6. Bacaklar PFA gecede 4 ° C'de (yaklaşık 20 h toplam) % 4 fix.
7. Bacaklar % 0,3 Nonyonik yüzey aktif deterjan solüsyonu içinde 1 x PBS, 5 x 20 dk ile yıkayın.
8. Çamaşır arabellek ile montaj orta yerine. Bacak bacak içine onun tam penetrasyon için izin vermek için montaj önce en az bir gün için montaj ortamda tutmak.
   Not: montaj orta yüksek viskoz ise, viskozite ani değişikliği daraltmak ve bacak genel yapısına zarar kütikül neden olabilir çünkü montaj orta 1 x PBS ile % 80 oranında seyreltin. Gal4 sürücüsüne bağlı olarak 1-3 hafta 4 ° C'de medya montaj kadar takılacağı sinekler korunabilir.

2. bacak montaj

1. Bir mikroskop slayt ve bir kare 22 x 22 mm² coverslip (Şekil 2A, B) ile kapak sol tarafında yaklaşık 20 µL % 70 gliserol yerleştirin. Montaj orta paralel için ve küçük bir mesafe bu coverslip sağ kenarından bir çizgi boyunca yaklaşık 10 µL pipet. Başka bir 30 µL montaj orta daha fazla slayt (Şekil 2C) sağ tarafında ekleyin.
   Not: bir coverslip bacaklar (aşağıya bakın) uygularken montaj orta yavaşça coverslip altında ve bacaklar çevresinde onları yerinden olmadan yayar.
2. İyi forseps kullanarak çözümden bacak kaldırma ve montaj orta sol coverslip yakınındaki kırmadan. Her bacak için aynı şeyi ve onları baştan (Şekil 2B) altına hizalayın.
   1. Asansör ve forseps her iki ipuçları arasında düzenlenen orta bir damla bacaklarda aktarmak. Bacaklar iki şekilde yönlendirmek: dış tarafı yukarı veya aşağı.
3. Bir kez tüm bacaklar (en fazla 6-8 bacaklar monte) düzgün hizalanmış, öyle ki bu coverslip biraz daha önce yerleştirilmiş coverslip için coverslip ve doku boşluk için izin vermek için (şekil 2E) dayanıyor ikinci bir coverslip bacaklar üzerinde koymak legs--dan getting hasarlı (Şekil 2 g) önlemek.
   Not: Alternatif olarak, etiket kuyu ya da ortodontik balmumu coverslip ve slayt arasında boşluk oluşturmak için kullanın.
4. Tırnak cilası coverslips her köşesinde (Şekil 2F) konumunu korumak için kullanın.
   Not: Şimdi görüntü hazır dokudur.

3. görüntüleme

1. Tek bir parça 488 nm lazer ve iki dedektörleri aynı anda GFP floresans ve kütikül auto-floresan elde etmek için kullanarak ayarlayın. Aralık denetimi ya da kaymak göstermek belgili tanımlık bilgisayar yazılımı, ışık yolu pencerenin spektral pencerede kullanarak bir dedektör (dedektörü 1) 498-535 nm şu diğer bir (Dedektör 2) 566-652 nm arasında arasındaki algılama aralığı ayarlayın.
   Not: Genellikle, GaAsP dedektörü ve 2 Dedektör Dedektör 1 olmalıdır bir photomultiplier tüp. 498-535 kanal GFP sinyali en iyi şekilde algılar ama aynı zamanda otomatik floresans manikür üzerinden algılar. Ancak, 566-652 kanal sadece otomatik floresans kütikül (Şekil 3A) üzerinden algılar.
2. 25 X yağ daldırma amaç, 1024 x 1024 piksel çözünürlük, 12-bit derinliği ve 1 µm. Set piksel yaşamak yaklaşık 1.58 µs zaman ve 2 kare/görüntü ortalama Z aralığı ayarlamak veya bir 20 X kullanın. Hedefleri ile yüksek sayısal diyafram kullanın.
3. Diğer tüm ayarlar, confocal mikroskop ve kullanılan görüntüleme yazılımına bağlı olarak ayarlayın.
   1. 566-652 dedektörü yerine 498-535 detektörü daha parlak bir manikür sinyal aldığınızdan emin olun. Bunu yapmak için her iki Dedektörleri için 488-lazer lazer enerji kullanın. Doygunluk işaretçileri kullanarak, ilk kazanç dedektörü 1 yeterince parlak GFP sinyal (Şekil 3B, D) elde etmek için ayarlayın. Sonra bazı alanlarda yüksek kütikül sinyali (bacaklar, eklem kenarlarını) ile bu dedektörü (Şekil 3 c, E) doymuş sinyal üretmek emin olmak için dedektör 2 kazanç ayarlayın.
   2. Bacak genişletilmiş ve çok büyük bir tek kare yansıması için mikroskop düşsel bilgisayar yazılımı--dan çini veya konum seçeneği kullanın.
4. Son görüntüleri ya görüntüleme yazılımı veya ImageJ/FIJI freeware (aşağıya bakın) kullanarak özel mikroskop kullanarak yeniden.

4. mesaj işleme görüntüleme

1. Confocal yığın ImageJ/FİJİ'de açın.
   1. Bioformats eklentisi kullanmak (eklentileri | Biyo-biçimleri | Bio-formats ithalatçı) Fiji içinde olmayan görüntüleri açın. TIF tescilli yazılım paketleri⁹görüntüleme biçiminden.
2. Görüntü seçerek kanalları split | Renk | Split kanalları.
   Not: imge--dan çeşitli kademelerde yapılan ve recombined gerekir ikili kullanırsanız, FIJI eklenti dikiş (Eklentiler > Dikiş > ikili dikiş)^10,11.
3. Kütikül sinyalini GFP sinyalinden çıkartmak için görüntü Hesap Makinesi'ni açmak (süreci | Görüntü hesap makinesi): yığın dedektörü 1 görüntü 1 (GFP + kütikül) seçin (Şekil 4A), operasyon pencerede seçin çıkarmakve yığın dedektörü 2 resim 2 (kütikül) (Şekil 4B) seçin. Sonuç olarak, yalnızca endojen GFP sinyali (GFP) (Şekil 4 c) elde edilir.
   1. Geri bu yığını (GFP) dedektörü 2 elde edilen 'tek kütikül' deste ile birleştirme (Şekil 4B görüntü | Renk | Kanalları Birleştir) bir RGB görüntü oluşan doku özgü GFP sinyali hem de bacak parçaları (Şekil 4 d) içindeki axon arbors belirleme yardımcı olur kütikül sinyal almak için.
   2. Kontrast ve her görüntünün parlaklığı ayarlayın (görüntü | Ayarlamak | Brightness/Contrast) ve tek bir RGB görüntüyü oluşturun (görüntü | Türü | RGB renk).
      Not: Z-yığının en fazla bir projeksiyon oluşturmak için (görüntü | Yığınlar | Z proje...), en fazla yoğunluk projeksiyon GFP sinyal ve sonra iki kanal birleştirme önce parlaklık için ayarlanabilir manikür için Ortalama yoğunluğu için kullanın.
4. Alternatif olarak, bir makro otomatik çıkarma ve ImageJ/Fiji görüntü işleme için kullanın. Kopya belgili tanımlık metin ek dosya 1'makro Düzenleyicisi'nde (eklentileri | Yeni | Makro), makroyu Plugins klasörüne kaydedin ve makroyu kullanabilmek için ImageJ/FIJI bir kez yeniden başlatın.
   1. Makroyu kullanmak için confocal yığın açın ve parlaklık/kontrast penceresini açın (görüntü | Ayarlamak | Brightness/Contrast). Sonra makroyu çalıştırın (eklenti | Makro | Çalıştırmak) ve yönergeleri izleyin.
   2. Görüntü 1 (GFP) olarak yığını 1, resim 2 (kütikül) yığını 2 olarak ve çıkarmaişlemi (görüntü hesap makinesi penceresinin) belirtmek için sorulduğunda, seçin.
      Not: Makro işlenmiş GFP sinyal (stack1 MAX_Result), bir maksimal projeksiyon görüntüsünü oluşturur kütikül (AVG_stack2), GFP yığını (stack1 sonucu) ve işlenmemiş kütikül yığından çıkarma sonucu ortalama bir projeksiyon kütikül yığını (stack2).
   3. Karşıtlığı ayarlamak için sorulduğunda, denetimleri GFP ve kütikül GFP içinde gösterilen her iki sinyali bir RGB birleştirilen görüntü oluşturmak için Ortalama projeksiyon maksimal projeksiyon görüntünün parlaklık/kontrast ayarlamak için parlaklık/kontrol penceresinde kullanın yeşil ve gri kütikül. Stack1 ve stack2, aynı şekilde bir sonraki aşamada kullanılabilir bir kombine GFP ve kütikül yığını oluşturmak için birleştirmek.
5. Üç boyutlu bacaklarda görselleştirmek için yeni oluşturulan Baca'ya (Şekil 4E) özel 3D yazılımı kullanın.
   1. RGB yığını ile 3D yazılımını açın (bkz. Tablo malzeme). Açılan iletişim penceresinde tüm kanallar modu dönüşümü bölümünde seçin ve Voksel (Cilt bir pikselin) boyutu girin.
      Not: Kullanılan her türlü özel mikroskop yazılımı görüntü dosyalarından tüm gerekli bilgileri yer almaktadır.
   2. Kanal 2 modülü (GFP sinyal) üzerinde sağ tıklatın ve seçin ekran | volren. Sonra volren modülüsol tıklatın. Özellikler bölümünde (ekranın alt sol) sol taraftaki Düzenle'yi tıklatın ve volrengreen.colseçin. Kanal 1 modülü (kütikül sinyal) sağ tıklatın ve seçin ekran | volren. Sonra volren modülüsol tıklatın. Gelişmiş ve select ddr (şeffaf grafisi gibi ekran) Özellikleri bölümüne sol sonra kütikül arka plan (Şekil 4E) görmek için gama değerini ayarlayın.
   3. 3D döndürme üretmek için proje yığını modülü sağ tıklatın. O zaman seçme animasyon | döndürmek. Döndürme modülü sol tıklatın.
   4. Özellikleri ' nde bölüm tıklayın bbox Merkezi'ni kullanın. Döndürme modülü sağ tıklatın ve seçin hesaplamak | film yapıcı. Film yapıcı modülü üzerinde sol fare düğmesini tıklatın. Özellikleri bölümünde sol sol üzerinde Gelişmiş (tepe doğru özellikleri bölümündeki).
   5. Dosya adı alanına film döndürme adını doldurun. Kalite alanına 1 (maksimum kalite) yazın. 8.3 s döndürme isterseniz 200'de çerçeve bırakın (Bu numara azalmıştır veya dönme hızı değiştirmek için arttı). Sonra uygulamak (yeşil düğmeye, özellikleri bölümündeki (bkz: Video 1) sol alt) tuşuna basın.

Şekil 4' te gösterildiği gibi bu yordamı ile birlikte onların terminal arbors yetişkin Drosophila bacaklarda GFP etiketli aksonlar mükemmel görüntüleme sağlar. Önemlisi temiz bir GFP sinyal bacak kütikül tarafından yayılan floresans tüm kirlenme olmadan elde edilir. Manikür sinyalden sonra aksonlar bacaklarda (Şekil 4E, Şekil 1ve Video 1) konumunu tanımlamak için GFP sinyali ile kombine edilebilir. Eleştirel, iyi sabit bacaklar elde etmek önemlidir. Şekil 5 bir iyi sabit (Şekil 5A) ve bir kötü sabit bacak (Şekil 5B) gösterilmektedir. Birinci durumda bölüm içinde bacaklar içinde iç yapıları tekdüze bir renk ve koyu, tracheas görülebilir. (Ana sinir bagajı bitişik) her bacak parçasının merkezinde ana trakeal tüp çalışır ve birçok ince etkileri de görülebilir. İkinci, karanlık malzeme mevcut tarsus ve tibia ve trakeal sistemi femur ve coxa açıkça görünür değil: Bu gibi durumlarda bu her zaman floresan proteinler sinyalini düşük yoğunluk veya tamamen yok olma bozulmuş görülmektedir. İkinci, dikkatli diseksiyon bacak (dan coxa Tibia) tüm bacak parçaları elde etmek için ve bacaklar için mekanik şok önlemek için gereklidir. Üçüncü olarak, montaj orta bacak iç nüfuz için yeterince uzun bacaklar bırakılmalıdır. Bazen bacak parçaları, özellikle kalça kemiği, daraltılmış görünür — bu penetrasyon sabitleştirici ve/veya montaj orta eksikliği nedeniyle olabilir. Son olarak, bir yüksek kaliteli mikroskop hedefleri, alan düzlük için düzeltilmiş ve floresan için ve/veya apochromatic tasarlanan kullanmanız gerekir.

Şekil 1: yetişkin Drosophila bacak sistemi motor şema. Yetişkin bacak MNs (yeşil) hücre organlarının korteks (gri) VNC torasik sinir düğümü lokalizedir. MNs bacak neuropil (mavi) onların dendrites arborize ve onların aksonlar 14 bacak kasları (kırmızı) biri innervate için bacak göndermek. Not yalnızca T1 bacaklar kapsamlıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: bacaklar mikroskop slaytlarda takmak için yordam. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: yordam Imaging. (A)emisyon spectra GFP ve bacak kütikül bölümlerin GFP ifade bacaklar ve GFP sırasıyla ifade edemediği Drosophila bacakları spektral Imaging'i kullanma elde edilen 488 nm Argon lazer uyarma kullanarak. Floresans yoğunluklarda değil normalleştirilmiş, Örneğin, çoğu ham veri yordamı Imaging bacak gelince aynı parametreleri (amaç, montaj orta, lazer güç, confocal diyafram, kazanç, ofset) kullanarak dikkat edin. Ayrıca gösterilmiştir dedektörü windows için Imaging GFP + manikür kullanılan floresan (dedektörü 1: yeşil) ve kütikül (Dedektör 2: pembe), GFP vs kütikül arka plan spectra göre. (B, C) Confocal mCD8::GFP DVGlut-Gal4 kontrol altında etiketlenmiş bacaklar bölümünü dedektörü 1 (B) ve dedektör 2 (C) elde. (D, E) Resim (B, C) sırasıyla kullanılan doygunluk işaretçisi ayarlarını (Açıklama metnine bakın): hiçbir sinyal, kırmızı doygunluk mavi. Dedektör üzerinde 2 numara manikür bazı bölümlerine (bkz: oklar) doymuş iken dedektörü 1 ana sinir parça, doygun olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: ImageJ/FIJI kullanarak görüntüleri işleme. (A)498-535 nm dedektörü elde edilen confocal yığınları Max projeksiyon. (B) 566-652 nm dedektörü elde edilen confocal yığının en fazla projeksiyon. (B) (A) üzerinden çıkararak elde GFP sinyali ile (C) görüntü. (D) birleştirilmiş görüntüler (b) ve (C). (E) (C) 3-b inşası. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: düşük güç görünümü disseke bacak iyi (A) ve kötü (B) fiksasyonu örnekleri gösterilen. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Video 1: GFP etiketli akson (yeşil) bir bacaktaki kütikül (gri) ile birlikte film Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Yazarlar ifşa gerek yok.