Burada, sabit/permeabilized Histoloji bölümlerde nötrofil var olup olmadığını belirlemek ve canlı arıtılmış nötrofil etkinleştirme durumunu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Özellikle, MUB40 peptid laktoferrin nötrofil özgü ve Tersiyer granül mevcut bağlar. Pozlama permeabilization veya nötrofil harekete geçirmek granül İçindekiler nötrofil işaretleme için sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
MUB40 peptid nötrofil aracılıklı iltihaplanma olayları algılama kullanmak için
Bu makalede
Özet
Özet
Burada, biz MUB40, yüksek konsantrasyonlarda nötrofil özel ve Tersiyer granül depolanan glikozile laktoferrin bağlama yeteneği ile sentezlenmiş bir peptid kullanımını içeren bir protokol sağlar. Nasıl Birleşik MUB40 doğrudan bir fluorophore için bu protokolü ayrıntıları bu canlı hücre Imaging'de nötrofil etkinleştirme ve de-granülasyon için tahlil için kullanılabilir ne kadar sabit/permeabilized dokularda de nötrofiller leke için kullanılabilir. Nötrofil algılama yöntemleri her zaman bazı uygulamalar için uygun değildir species-specific monoklonal antikorlar sınırlı olmalıdır. MUB40 hücre zarı nüfuz etmez ve böylece sigara-aktif/sigara-permeabilized nötrofil içinde depolanan laktoferrin üzerinden söz konusu değildir. MUB40 tane laktoferrin geniş ana bilgisayar aralığından, özellikle birden fazla araştırma modeli, ilgili çalışmalarda sonuçları karşılaştırmak için faydalı hale tanıma yararı yinelenen reaktifler sayısını azaltarak ve protokolleri kolaylaştırarak tek adım boyama yoluyla.
Giriş
Nötrofil bir doğuştan gelen bağışıklık sisteminin birincil silah ve rutin olarak inflamasyon vücut etrafında siteler için işe. Nötrofil çalışma büyük ölçüde bozulmuş onların kısa ömrü vitro (az 8 h) ve sınırlı algılama araçları bazal koşullar altında veya aktivasyon sonra olmuştur. Burada, sabit/permeabilized örneklerinde memeli nötrofil geniş ve belirli algılanması için iyi sınanmış bir protokol mevcut. Ayrıca canlı nötrofil MUB40ile boyama için detaylı bir protokol sağlar. Canlı nötrofil boyama iletişim kuralını kullanarak, zamanlama ve nötrofil harekete geçirmek konumunu kesin olarak belirlemiş. Bu iletişim kuralı nötrofil harekete geçirmek ya d....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm yöntem tanımlamak burada gözden geçirilmiş ve onaylanmış Fransız kuruluşlarca CoRC (Comite de Recherche Clinique), CPP (Comite de koruma des Personnes) ve CNIL (komisyon Nationale Informatique et Liberté).
1. Fluorescently nötrofil histopatoloji doku ile boyama MUB40 etiketli
- Histopatoloji için doku elde etmek için en fazla 4 h örnek kalınlığına bağlı olarak doku/biyopsisi bölümleri % 4 paraformaldehyde (PFA) 30 dk için uygun bir birimdeki düzeltmek. Örnekleri fiksasyon sırasında 4 ° C buzdolabında yerleştirin.
Not: Alternatif fiksasyon yöntemleri/zamanlamaları kullanıcının benzersiz ihtiyaçlarına göre yedek olab....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sonuçları MUB40-histopatoloji slaytlardan lekeli dokular genellikle tek tek hücreleri doku dağınık ortaya. MUB40 lactoferrin, nötrofil granül bulunması ve bölümlere olan leke bırakır. Böylece, tipik olarak görülen punctate boyama veya sinyal çeşitli büyük ayrılmış alanlarda bireysel nötrofil (Şekil 1) geliyor. DAPI MUB40 sinyal lekeli hücre ile birlikte yerelleştirilmesine yardımcı gibi ikinci bir hücre işaretçisi eklemek yara.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, iki deneyleri MUB40 peptid nötrofil inflamasyon ve harekete geçirmek için kullanılan açıklanır. Biz nasıl MUB40 nötrofil histopatoloji bölümlerde ya da canlı arıtılmış nötrofil kullanarak onların harekete geçirmek durum göstermek-ebilmek açığa vurmak göstermek. MUB40 boyama reaktifi kullanmak için kritik adımlar olarak başka bir floresan algılama yöntemi ile aynıdır. Floresan sinyallerin ve güncelliği ve yeterli çamaşır adımlar arka plan boyama kaldırmak için atılmıştır özen göste.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
B.S.M. bir mucit MUB40 patent üzerinde listelenir:
MUB40: Avrupa Patent EP11290403.2, 09/09/2011.
RI-MUB40: Avrupa Patent AP No 17306746.3, 11/12/17.
Teşekkürler
Bu eser Fondation Laurette Fugain (Eğer-2015-15) (B.S.M.) tarafından desteklenen ve ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.) verir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Floresan MUB40 peptit (diğer konjuge floroforlarla kullanılabilir) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso floresan MUB40 peptidi. D-amino asitlerle sentezlenir ve proteazlara dirençli (diğer konjuge floroforlarla birlikte mevcuttur) |
| Parformaldehit | Sigma-Aldrich | 16005 | Histoloji için fiksatif |
| Sükroz | Sigma-Aldrich | S7903 | Fazla PFA'yı çıkarmak için kullanılan çözelti |
| Optimal Kesme Sıcaklığı Bileşiği (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Kriyostat kesitinden önce dokuyu dondurmak için kullanılır |
| 2-Metilbütan | Sigma-Aldrich | M32631 | Kriyostat kesitinden önce dokuyu dondurmak için kullanılır |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Dokuyu dondurmak için kuru buz banyosu için kullanılır |
| Leica Kriyostat | Leica Biosystems | CM1520 | Dokuları kesitlere ayırmak için kullanılır |
| Cam mikroskopi slaytları | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Kapak fişleri | Thor Labs | CG15CH | Hi hassas lamel |
| Dako kalem | Sigma-Aldrich | Z377821 | Doku boyama sırasında sıvı kaybını önlemek için kullanılır |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | IF boyama için hücrelere nüfuz etmek için kullanılır |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Lekeleri DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Aktini bağlar |
| Altın antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | IF sinyalini ve fotobleachinge direnci uzatır |
| Floresan mikroskop | Çeşitli | IF slaytlarını görüntülemek için kullanılır | |
| Anoksik Kabin | Çeşitli | inaktive nötrofillerin saflaştırılması için kullanılır | |
| Çeşitli Sodyum Klorür NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Yıkama tamponu bileşeni |
| MACS BSA tamponu | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Yıkama tamponu bileşeni |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Nötrofil saflaştırması için gradyan |
| CD235a glikoforin manyetik mikro boncuklar | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Kirletici RBC'leri çıkarmak için kullanılır |
| LS sütunları | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Nötrofillerden RBC'lerin uzaklaştırılmasında kullanılır |
| Fenol Kırmızısı içermeyen RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8755 | Nötrofil tahlilleri için kullanılır |
Kaynaklar
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
