Yöntem makalesi

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

DOI:

10.3791/58369

⸱

28 Eylül 2018

 ,  , 
1Molecular Plant Biology, Department of Biochemistry, University of Turku

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir iletişim kuralı bitki aydınlatma için thylakoid protein kompleksi organizasyon ve mavi yerel polyacrylamide ile kompozisyon jel elektroforez (BN-sayfa) ve 2D-SDS-sayfa açıklanmıştır. Protokol Arabidopsis thalianaiçin optimize edilmiş ama küçük değişiklikler ile diğer bitki türleri için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotosentetik Elektron transferi zinciri (vb) NADPH ve ATP şeklinde kimyasal enerji güneş enerjisi dönüştürür. Dört büyük protein kompleksleri elektron sudan NADP+ ile iki photosystems için sürücü ve ATP üretimi için oluşturulan proton degrade kullanmak için thylakoid membran hasat güneş enerjisi gömülü. Photosystem PSII, psişik, sitokrom b6f (Cyt b6f) ve ATPaz farklı yönlendirme ve thylakoid membran dinamikleri ile tüm multiprotein kompleksleri vardır. Kompozisyon ve thylakoid membran protein kompleksleri etkileşimleri hakkında değerli bilgiler elde hafif deterjan yerli jel elektroforetik ayrımı tarafından takip tarafından kompleksleri membran bütünlüğü gelen çözücü tarafından kompleksleri. Mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez (BN-sayfa) protein kompleksleri yerli ve fonksiyonel formlarındaki ayrılması için kullanılan bir analitik yöntemdir. Yöntem protein kompleksi arıtma daha ayrıntılı yapısal analizi için kullanılabilir, ama aynı zamanda protein kompleksleri arasındaki dinamik etkileşimler incelemek için bir araç sağlar. Yöntem mitokondrial solunum protein kompleksleri, analiz için geliştirilmiştir ama beri en iyi duruma getirilmiş ve thylakoid protein kompleksleri diseksiyon için geliştirilmiş. Burada, biz değişken fotosentetik protein kompleksleri ve onların etkileşimlerde Arabidopsis thalianaanalizi için detaylı güncel iletişim kuralı sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyük multisubunit protein kompleksleri photosystem PSI ve PSII, Cyt b6f ve ATPaz koordine NADPH ve ATP üretimi fotosentetik ışık reaksiyonlarda. Daha yüksek bitki kloroplast içinde kompleksleri appressed grana ve appressed stroma thylakoids oluşan bir yapısal olarak heterojen membran yapıdır thylakoid zarının içinde yer alır. Mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez (BN-sayfa) büyük multisubunit protein kompleksleri onların yerli ve biyolojik olarak aktif biçimde analizinde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Yöntem mitokondrial membran protein kompleksleri1diseksiyon için kuruldu, ancak sonra thylakoid membran ağ3protein kompleksleri ayrılması için özelleştirilmiş. Yöntem (i) tek tek thylakoid protein kompleksleri için yapısal analizi, (ii) yerli protein kompleksleri Hofstede belirlemek için ve (iii) protein kompleksleri genel organizasyonu analizi için arıtma için uygundur çevre ipuçları değiştirme üzerine.

Ayrılık öncesinde protein kompleksleri genellikle hafiftir ve protein kompleksleri doğal yapısını korumak dikkatle seçilmiş Nonyonik deterjanlar ile membran etkilenmezsiniz. Deterjanlar içeren hidrofobik ve hidrofilik siteleri ve form istikrarlı micelles bir belirli konsantrasyon, yukarıda adı verilen bir kritik micellar konsantrasyonu (CMC). CMC sonuçlarının lipid-lipid etkileşimleri bozulma ve protein kompleksleri solubilization üzerinde deterjan konsantrasyonu artan. Deterjan seçimi protein kompleksi ilgi kararlılığını ve deterjan solubilization kapasitesine bağlıdır. Rutin olarak kullanılan deterjanlar α/β-Lauryl-maltoside ve digitonin içerir. Protein kompleksleri içinde onların yerli durum solubilization çözünmez malzeme Santrifüjü tarafından kaldırılır. Yüksek bitkilerde thylakoid membran yapısı içinde son derece heterogenic ve bazı deterjanlar (Örneğin, digitonin), seçmeli olarak membran3yalnızca belirli bir kısmını solubilize. Bu nedenle, protein kompleksi kuruluş ya da protein kompleksleri arasındaki etkileşimler ayırdetmek için bu her zaman klorofil içeriği ve klorofil a/b belirleyerek seçilen deterjan solubilization kapasitesini belirlemek önemlidir verim ve temsil thylakoid (sub) etki alanı, sırasıyla, solubilized kısmını değerlendirmeye süpernatant sayısına oranı. Büyüme-ışık iklime alıştırılacağı bitkilerin sağlam thylakoids klorofil a/b oranı genellikle yaklaşık 3, ise chl bir / b değeri thylakoid kesirler zenginleştirilmiş grana birinde veya stroma thylakoids düşer (~ 2.5 altında) veya (~ 4.5) toplam değerini aşıyor thylakoids, anılan sıraya göre.

Protein kompleksleri için negatif yük sağlamak için Coomassie parlak mavi (CBB) boya solubilized örneğe eklenir. Şarj kayması nedeniyle protein kompleksleri anot doğru göç ve molekül ağırlığı ve şekil göre bir Akrilamid (AA) degrade olarak ayrılır. Etkili ve yüksek çözünürlüklü ayırma doğrusal akrilamid konsantrasyon gradyanı kullanılarak elde edilir. Onlar kendi boyut bağımlı gözenek boyutu sınırına ulaşıncaya kadar Elektroforez sırasında protein kompleksleri anot doğru göç. (İ toplam akrilamid polyacrylamide jel gözenek büyüklüğüne bağlıdır /bis- akrilamid konsantrasyonu (T) ve (II) cross-linker bis- akrilamid monomer konsantrasyonu (C) göre toplam monomerleri4. BN-sayfa ile boşanmadan sonra protein kompleksleri daha fazla onların bireysel protein alt ikinci boyut (2D) - SDS - sayfa tarafından alt. Burada, thylakoid membran protein kompleksleri BN-/ 2D SDS-sayfa tarafından çözümlenmesi için detaylı bir protokol açıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlanması BN jel1,2,3

  1. Jel tekeri plakalı 8 cm x 10 cm (dikdörtgen cam ve çentikli alümina plaka) 0,75 mm mesafe tutucular kullanarak üretici yönergelerine göre ayarlayın.
  2. Bir degrade karıştırıcı bir heyecan tabağa yerleştirin ve bir tüp tarafından peristaltik pompa ile bağlayın. Bir şırınga iğnesi tüp diğer ucunu takın ve cam ve alüminyum plaka arasında iğne yerleştirin. "Ağır" (H) için yer manyetik karıştırıcı-odası.
  3. %3.5 (v/v) ve (v/v) % 12.5 15 mL konik santrifüj tüpleri çözümlerinde Akrilamid (AA) ayırma jel degrade için hazırlamak (bkz. Tablo 1tariflerde). Zamansız polimerizasyon önlemek için çözümler hazırlarken santrifüj tüpleri buz üzerinde tutun.
    Dikkat: Akrilamid nörotoksik ve kanserojen, aşınma koruyucu elbise ve eldivenler var.
  4. % 5 APS ve TEMED doğru çözümler degrade Mixer pipetting önce ekleyin. Damlalıklı H-Odası % 12.5 çözümü.
    1. Hava kabarcıkları "light" (L) ve H-odası L odasına girmek çözüm sağlayan iki odaları bağlanma Vana açarak bağlanma kanal kaldırın. Çözüm izleri H-odasına geri Vana ve damlalıklı kapatın.
    2. Son olarak, damlalıklı L-odası % 3,5 çözümü.
  5. Manyetik karıştırıcı geçiş (heyecan hız kritik değildir, ancak uygun ağır ve hafif çözümler karıştırma emin olmalısınız), vanaları açın ve peristaltik pompa geçin. Cam ve alüminyum plaka arasında akmaya jel çözümleri sağlar, debisi yaklaşık 0.5 mL/dk olmalı. İğne sıvı her zaman olmalı, cam levha bir bant ile üst kısmındaki eklenebilir.
  6. Ne zaman H ve L chambers boşluk, onları Ultrasaf Su ile doldurun ve yavaşça jel yüzeyi yerleşimi için su sağlar. Jel polimerizasyon 1-2 saat civarında RT. alır.
  7. %3 akrilamid çözüm hazırlamak (bkz. Tablo 1' deki tarifi) istifleme için RT. damlalıklı polimerli ayrılık jel üstüne yığın jel jel (yığın jel döküm önce jel yüzeyi overlaying su kaldırmak) ve bir örnek jel tarak yer Cam ve alüminyum plaka kaçınarak hava kabarcıkları arasında.
    1. 30-60 dk RT. Kaldır tarak yavaşça Ultrasaf Su altında az polimerize olanak sağlar. 4 ˚C, jel saklayın.
      Durma noktası. Jel 4 ˚C bir kaç gün saklanabilir. Jel kuyuları ve jel yüzey kurutma önlemek için nemli ortamlarda tutulmalıdır.

2. Thylakoid Solubilization1,2,3

Not: Tüm adımları çok loş ışık altında yapılmalıdır. Örnekleri ve arabellekleri buz üzerinde tutun.

  1. Buz gibi 25BTH20G arabellek son klorofil konsantrasyonu 1 mg/ml ile izole thylakoids oranında seyreltin. İçin klorofil 2D-BN-SDS-sayfa analizi yaklaşık 4-8 µg / örnek uygundur.
    Not: deneylerde kullanılan thylakoids (için protokol thylakoid yalıtım, bkz:3) taze yaprakları yalıtılmış olması gerekir
  2. Eşit miktarda deterjan arabellek, Yani, % 2 β-DM (w/v) veya % 2 eklemek digitonin (w/v). Thylakoid örnek için deterjan karışımı yavaşça damlalıklı ucu ile ve hava kabarcıkları yapmaktan kaçının. Son deterjan % 1 ve thylakoids 0,5 mg Chl/mL olan bölgedir.
    1. Thylakoids 2 dakika buz (β-DM) veya RT sürekli nazik bir rocker/shaker (digitonin) karıştırma ile 10 dakika solubilize.
      Not: Digitonin ve β-DM genellikle thylakoid protein kompleksleri solubilization için kullanılır. Diğer non-iyonik deterjanlar kullandıysanız, deterjan konsantrasyon ve solubilization saat önce optimize edilmiş olması gerekir. Genellikle deterjan konsantrasyon aralığı üzerinden % 0.5-%5 (v/v).
      Uyarı: Toksik, aşınma koruyucu elbise ve eldivenler Digitonin olduğunu
  3. İnsolubilized malzeme Santrifüjü 18.000 x g 4 ˚C, 20 dk için de çıkarın.
  4. Yeni bir 1,5 mL tüp süpernatant nakletmek ve 1/10 (v/v) CBB arabelleği için örnek eklemek.
    Not: thylakoid membran protein kompleksleri genel kompozisyon incelendiğinde, verim ve çözündürüldükten kesir temsil thylakoid etki alanını belirleme önerilir. Solubilized malzeme verim belirlemek için (CBB eklemeden önce) için yeni bir tüp süpernatant ile 5 µL al ve Chl içerik ve Chl ölçmek bir / b oranı5.

3. BN-sayfa1,2,3

  1. Jel bir dikey elektroforez sistemi (Örneğin, Hoefer SE 250) için ayarlayın. Üst arabellek odası mavi katot arabellek ile doldurun (bkz. Tablo 1) ve anot arabellek alt arabellek odasına dökün.
  2. Thylakoid örnek (Örneğin, 5 klorofil µg) kuyu yükleyin.
  3. Elektroforez başlayın ve yavaş yavaş voltajı artırmak: 75 V 30 dk için 30 dk için 100 V, 125 V 30 dk, 150 V 1 h için ve 175 V kompleksleri kadar ayrılmış tamamen. Koşmak, jel + 4˚C, soğuk bir oda kullanma ya da jel sıcaklık soğutma sistemi ile ayarlama.
    Not: örnek açık yaklaşık üçte biri jel göç mavi katot arabellek açık katot arabellek için değiştirmiş olursunuz.
  4. Elektroforetik çalıştırdıktan sonra jel ile görüntü arşivleme için bir photoscanner inceden inceye gözden geçirmek.

4. 2D-SDS-SAYFA

  1. Dikey elektroforez sistemi (jel boyutu 16 cm x 20 cm) bir araya getirin. 1 mm boşluk ekleyiciler kullanın.
  2. 2D-tarak (tek büyük şerit ve molekül ağırlığı işaretçi için bir standart iyi için iyi) ile standart SDS jel (% 12 akrilamid, 6 M üre, Tablo 2' deki bkz: tarifi) hazırlayın.
  3. Lane BN-jel keser ve bir (5 mL) tüpe yerleştirir. Laemmli arabellek (%5 β-mercaptoethanol içeren) 2 mL ekleyin ve nazik RT. sallayarak ile 45 dk için şerit kuluçkaya
  4. Örneğin, ayırıcı, üstünde tepe-in hava kabarcıkları kaçınarak jel yardımıyla ile lane yerleştirin.
  5. Damlalıklı 5 µL molekül ağırlığı işaretçisini filtre kağıdı ve yer iyi standart kağıt dar bir parçası üzerinde.
  6. BN-jel şerit ve marker kağıt imzalamaya, (içinde tampon çalıştıran) % 0.5 özel jel şerit üzerine dökün ve kuvvetlendirmek için izin.
  7. Elektroforez standart protokolleri göre gerçekleştirin. Elektroforetik çalıştırdıktan sonra proteinler ile Örneğin, Sypro Ruby leke veya gümüş göre6boyama görselleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 ' deki temsilcisi bir 2D-BN/SDS-sayfa sistemi digitonin ve β-DM-çözündürüldükten thylakoid protein kompleksleri ayrılması ve kendi detaylı protein alt birimi kompozisyon göstermektedir. Çözündürüldükten digitonin thylakoids ( Şekil 1Aüst üstte Yatay jel) protein karmaşık desen içerir PSII-LHCII-PSI megacomplex, iki büyük PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomer (m), PSII m/Cyt b6f, (L...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotosentetik enerji dönüşüm makine thylakoid membran gömülü büyük multisubunit protein kompleksleri oluşur. Bu iletişim kuralı için çözümleme-in bitki thylakoid protein kompleksleri Arabidopsis thaliana BN sayfalı 2D-SDS-sayfa ile kombine ile gelen temel yöntemi açıklanır. Protokolü de thylakoid protein kompleksleri gelen tütün ve ıspanak thylakoids çözümlenmesi için uygundur, ama ufak değişiklikler gerektirebilir.

Membran protein kompleksleri solubilization için Nonyonik deterjanlar ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma mali biyokütle (SE2B) Marie Skłodowska-Curie hibe sözleşmesine (675006) Finlandiya Akademisi (proje numaraları 307335 ve 303757) ve güneş enerjisi tarafından desteklenmiştir. İletişim kuralı başvuru3dayalı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6-aminokaproik asit (ACA)Sigma-AldrichA2504
BisTrisSigma-AldrichB4429
SükrozSigma-AldrichS0389
Akrilamid (AA)Sigma-AldrichA9099Dikkat: Nörotoksik!
n-dodesil-β-D-maltosidSigma-AldrichD4641
TrisinSigma-AldrichT0377
TrisSigma-AldrichT1503
SDSVWR442444H
ÜreVWR28877.292
GliserolJ.T. Baker7044
Sodyum Florür (NaF)JT Baker3688
EDTA disodyum tuzuJT Baker1073
DigitoninCalbiochem300410Dikkat: Toksik!
Pefabloc SCRoche11585916001
Serva Coomassie Blue GServa35050
β-merkaptoetanolBio-Rad1610710
APS (Amonyum persülfat)Bio-Rad161-0700
TEMED (Tetrametiletilendiamin)Bio-Rad1610801
(N,N'-Metilen)-Bis-AkrilamidOmnipur2610
GlisinFisherG0800
Önceden Boyanmış Protein İşaretleyici, Geniş Aralık (7-175 kDa)New England BiolabsP7708
Falcon, Konik Santrifüj Tüpleri 15 mlCorning352093
10 x 8 cm plakalı çift jel tekerlekHoeferSE215
Gradyan yapıcı SG5Hoefer
0,75 mm T-ara parçalarHoeferSE2119T-2-.75
Numune jel tarağı, 0,75 mmHoeferSE211A-10-.75
Mighty Small SE250 dikey elektroforez sistemiHoeferSE250
IPC pompasıIsmatec
Güç kaynağı, PowerPac HVBio-Rad164-5097
SantrifüjEppendorf5424R
Rocker-ShakerBiosanBS-010130-AAI
br/> PROTEAN II xi HücreBio-Rad1651813
<

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fotosentetik Elektron Transfer ZinciriProtein Kompleks PurifikasyonuDigitonin SolubilizasyonuBeta DM Solubilizasyonu2 SDS PAGE AnaliziCoomassie Brilliant Blue TamponuSUPRO Ruby BoyasK tle Spektrometrisi Analizi

İlgili makaleler