Yöntem makalesi

İndüksiyon düşük Serum koşullar altında kalp Progenitor hücreler endotel farklılaşma

DOI:

10.3791/58370

⸱

7 Ocak 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital and University of Basel, 2Division of Cardiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı bir endotel farklılaşma tekniği kalp progenitör hücreler için açıklar. Bu özellikle serum konsantrasyonu ve hücre tohum yoğunluğu endotel farklılaşma potansiyeli etkilemesi üzerinde duruluyor.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak progenitör hücre (TBM) kalp yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra yaralanma için tedavi potansiyeli olabilir. Yetişkin memeli kalbinde, içsel TBM'leri son derece kıt, ama genişletilmiş TBM'leri hücre tedavisi için yararlı olabilir. Yeteneklerini denetimli bir biçimde tanımlanmış ve etkin iletişim kuralları kullanılarak çeşitli kardiyak soy ayırt etmek için onların kullanmak için bir önkoşuldur. Ayrıca, vitro genişleme, üzerine TBM'leri hastalardan izole veya preklinik hastalık modelleri hastalığı mekanizmaları incelenmesi için verimli araştırma araçları sunabilir.

Mevcut çalışmalar farklı işaretleri TBM'leri tanımlamak için kullanın. Ancak, tüm bunların hangi preklinik bazı çalışmalar translasyonel etkisini sınırlar insanlarda, ifade edilir. Ne olursa olsun yalıtım tekniği ve marker ifade tabidir farklılaşma protokolleri için standart genişleme ve TBM astar hücre terapisi amaç için izin verir. Burada biz tarif endotel farklılaşma TBM'leri. fare ve sıçan TBM'leri iki farklı altgrupları kullanarak TBM'leri astar düşük fetal Sığır serum (FBS) konsantrasyon ve düşük hücre yoğunluğu koşullar altında kolaylaştırır, bir daha o laminin olduğunu göstereceğiz fibronektin aşağıdaki protokol altında bu amaçla daha uygun substrat: 2-3 gün içinde takviyeleri de dahil olmak üzere orta multipotency korumak için sonra kültür ve % 3,5 ile FBS, TBM laminin üzerinde numaralı seribaşı < % 60 izdiham ve kültürlü içinde Ek içermeyen orta FBS (% 0,1) düşük konsantrasyonlarda farklılaşma endotel farklılaşma orta önce 20-24 saat ile. TBM türdeş olmayan bir nüfus olduğundan, serum konsantrasyonları ve kuluçka süreleri ilgili TBM subpopulation özelliklerine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Göz önüne alındığında bu, teknik diğer türleri TBM için de uygulanabilir ve potansiyel ve farklılaşma ve nasıl onlar hastalığı ile ilgili hastalık modellerden izole TBM'leri kullanırken etkilenen mekanizmaları araştırmak için yararlı bir yöntem sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda yapılan çalışmalarda yetişkin memeli kalp1,2,3' te ikamet kardiyak progenitör hücre (TBM) varlığını desteklemek ve TBM'leri Kalp zedelenmesini4sonra, hücre tedavisi için yararlı bir kaynak olabilir 5. Buna ek olarak, genişletilmiş TBM'leri uyuşturucu tarama için verimli bir model sağlayabilir ve modellerinin nadir kardiyomiyopatiler hastalarda veya ilgili hastalık izole zaman hastalık mekanizmaları araştırma6,7.

Yetişkin yürekten izole TBM'leri sahip kök/progenitor hücre özellikleri1,2,3,8 multipotent, oldukları gibi klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar, ve kendini yenilemesinin kapasitesine sahiptir. Ancak, birçok farklı (alt) nüfus dahil olmak üzere, farklı yüzey marker profillerini, örneğin, c-kit, ani kalp durması-1 ve diğerleri, sergilenmesi veya farklı yalıtım teknikleri (Tablo 1) tarafından alınan TBM'leri vardır. Bazı kültür ve farklılaşma protokollerine kurulan1,2,8,9,10,11,12oldunuz. 13,14,15,16,17,18. Bu protokoller çoğunlukla büyüme faktörü ve hangi kültürü çalışmalarının amacı göre ayarlanır ve bunun sonuçları ve sonuçları da farklılaşma verimliliği dahil olmak farklılıkları için açabilir serum içerik ile ilgili olarak değişir.

İmleç tabanlı yalıtım teknikleri:

TBM bir belirli yüzey marker ifade1,2,8,9,10,11,12,13 tarihinde bağlı izole olabilir ,14,15,16,17,18. Önceki çalışmalar, c-kit ve ani kalp durması-1 ikamet TBM'leri1,11,14,19,20yalıtmak için en iyi işaretleri olabilir öneririz. Bu işaretleri hiçbiri TBM için gerçekten özel olduğundan, kombinasyonları farklı işaretleri genellikle uygulanır. Örneğin, c-kit21seviyesinin düşük TBM'ler hızlı ise, c-kit Ayrıca mast hücreleri22, endotel hücreleri23ve hematopoetik kök/progenitor hücreler24de dahil olmak üzere diğer hücre tiplerine göre ifade edilir. Ek bir sorun tüm işaretleri tüm türler arasında ifade edilir olmasıdır. Ani kalp durması-1, fare ama insan25içinde ifade için durum böyle. Bu nedenle, yalıtım işaretleri bağımsız iletişim kuralları kullanılarak klinik çalışmalarda ve insan numuneleri kullanılarak çalışmalar içinde görüş-in avantajlı olabilir.

Marker bağımsız yalıtım teknikleri:

TBM tecrit, öncelikle yüzey marker ifade bağımsız olan ama (Ayrıca bkz: Tablo 1) gerektiği gibi belirli işaret-pozitif subfractions ardışık seçime göre rafine birkaç önemli teknikler vardır. (1 yan nüfus (SP) tekniği aslında hematopoetik kök hücre ATP-bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılar27tarafından sızma DNA boya Höchst 3334226 yeteneği dayanan ilkel bir popülasyondaki karakterize. Kardiyak SP hücreler farklı gruplar tarafından izole ve işaretleri raporları2,8,13,14arasında bazı küçük farklılıklar ile çeşitli ifade etmek için bildirdi. (2) koloni oluşturan birim fibroblast hücreleri (CFU-Fs) başlangıçta belirlediğiniz dayalı mezenkimal stromal hücre (MSC) üzerinde-fenotip gibi. İzole MSCs koloni oluşumu ikna etmek için bulaşık sırası kültürlü. Bu koloni oluşturan-MSC benzeri CFU-Fs yetişkin yürekten ayrılmış olabilir ve kardiyak soy15ayırt etmek yeteneğine sahiptirler. (3) Cardiosphere kaynaklı hücreler (CDC) doku biyopsisi yetiştirilen hücre kümeleri elde tek hücrelerdir veya28,29,30,31explants. Son zamanlarda bu çoğunlukla CD105 gösterildi+/CD90-/c-kit- hücre kesir sergileyen cardiomyogenic ve rejeneratif potansiyel32.

Burada, SP-TBM'leri fareler izole kullanarak, biz bir protokol endotel lineage önceki çalışmada sıçan TBM'leri ve fare SP-TBM'leri33verimli indüksiyon için sağlar. Protokol kültürüne özgü uyarlamalar ve genişleme tekniği ile ilgili hücre yoğunluğu, orta sınıf ve substrat serum içeriğini içerir. Sadece fare SP-TBM'leri uygulanabilir ancak farklı TBM'leri amaç için bir endotel kaydedilmiş bir TBM yükseltecek üzerinden bir kader anahtarı ikna etmek için o içinde görüş-in bu hücreler veya kullanımları için mekanik vitro çalışmalar nakli olmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare kullanımı için hücre izolasyon amaçlı ve bakım ve kullanmak, Laboratuvar hayvanları ve İsviçre hayvan koruma kanunu ile Kılavuzu olduğunu ve Swiss Kanton yetkilileri tarafından kabul edildi.

Not: Ani kalp durması-1+/CD31 yalıtım- SP-TBM'leri fare kalp aslında yapıldı olarak yukarıda açıklanan34 bazı değişikliklerle. Malzemeler ve kullanılan reaktifler için Malzemeler tablobakın. Tüm deneyler için kardiyak SP-TBM'leri fareler izole güçlendirilmiş, pasajlı ve hücre satırı gibi vermez. Pasajlar 7-20 Bu çalışma için kullanılmıştır.

1. doku hazırlık

Not: tüm deneylerin fare kullanma yönergeleri ve yönetmeliklere göre yapılmalıdır. Bu protokol dört fareler kullanır. 100 mm çapında çoğu kültür plakaları P100 açıklanan ve 60 mm çapında çoğu kültür plakaları P60 iletişim kuralı aşağıdaki bölümleri için olarak açıklanmaktadır.

  1. Her fare 200 mg/kg Fentobarbital intraperitoneally enjekte (IP) ve tamamen onun yanıt pinching baştan aşağı kontrol ederek anestezi kadar bekleyin.
  2. % 70 etanol ile göğüs silin. Cilt ve torasik duvarın göğüs boşluğuna maruz makasla kesme.
  3. Kalp forseps ile kaldırın ve makas kullanarak tabanında kesti. Soğuk fosfat tamponlu tuz (PBS) (3-5 kalpler P100 başına) ya da bir iki kalpleri P60 başı P100 25 mL (5 mL için P60) ile kalbinde koymak.
  4. Kan boşluklar (Şekil 1A) dışarı çıkarmak için forseps ile kalp pompa.
  5. P100 25 mL (5 mL için P60) ile kalbinde yıkama soğuk PBS koymak. Küçük makas kullanarak kulakçık kaldırın. Kalp iki boyuna parçalar halinde kesilmiş ve yine buz gibi PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60) yıkayın.
  6. Parçaları yeni P100 25 mL (5 mL P60 için) soğuk PBS ile aktarın. Parçaları küçük makas (Şekil 1B) kullanarak daha küçük parçalar halinde kesin. 1 mg/mL collagenase B Hank'in dengeli tuz solüsyonu içinde (HBSS) seyreltilmiş bir damla ekleyin ve küçük parçalar steril jilet (Şekil 1 c) ile iyice kıyma.

2. sindirim

  1. 10 mL (P60 için 2.5 mL) 1 mg/mL collagenase B çözümü adım 1.6 yemek için ekleyin.
  2. Kıyılmış kalp parçalar halinde bir eğik (yaklaşık 30 °) içeren collagenase B çözüm koymak 37 ° C kuluçka (Şekil 1 d) P100 (veya P60).
  3. En fazla 30 dk kıyılmış kalp adet kuluçkaya; Art arda onları kuluçka (Şekil 1E) sırasında bir Pasteur pipet her 10 min geçen lunaparkçı.
    Not: Bu, toplam adım 1.3 için kuluçka 30 dk aşmayacak şekilde önemlidir.

3. filtrasyon

  1. Soğuk HBSS %2 ile desteklenmiş, 10 mL (5 mL P60 için) eklemek FBS kıyılmış ve homojenize kalbi paramparça.
    Not: HBSS % 2 FBS quenches collagenase B aktivite ile desteklenmiştir.
  2. Sindirilmemiş doku ve 470 x g , santrifüj (RT) (Şekil 1F, sarı filtreleri) Oda sıcaklığında 5 min için kaldırmak için 100 µm filtresi ile kalp adet filtre.
  3. Süpernatant atın ve Pelet 5 mL (P60 için 3 mL) kırmızı kan hücre lizis arabellek resuspend ve zaman zaman buz üzerinde sallayarak ile 5 min için Pelet kuluçkaya.
  4. 10 mL (5 mL P60 için) PBS (lizis reaksiyonu önlemek için) eklemek ve kalan cardiomyocytes (Şekil 1F, mavi filtreler) dahil olmak üzere büyük hücreleri dışlamak için 40 µm filtreden örnek filtre.
  5. Santrifüj tüpü, 470 x g (olmadan fren) RT, 5 min için kapasitesi. Süpernatant atmak ve pelet 1 mL % 10 da dahil olmak üzere DMEM resuspend FBS.
  6. Bir aliquot bir hemasitometre ile hücreleri saymak. Hücrelerin % 10 da dahil olmak üzere DMEM ile resuspend FBS, 1 x 106 hücre/mL bir son hücre konsantrasyonu amaçlayan.
    Not: Yaklaşık 5 x 106 cardiomyocyte ve eritrosit tükenmiş hücreleri fare tahmin edilebilir.
  7. Hücreleri iki tüpler (Şekil 2) içine dağıtmak: Höchst 33342 verapamil ile; boyama için 1,5 mL tüp AEkle tüp B, Höchst 33342 boyama için 18,5 mL ekleyin ve leke ve akış sitometresi tarafından (adım 4.1 ve 4.2) kardiyak SP hücreleri sıralamak için devam edin.

4. kardiyak SP hücreleri tarafından akış sitometresi sıralanması

Not: Verapamil Höchst sızma tedavisine direnç (MDR) ABC ışınlama aktivitesi engelleyerek engeller. Höchst 33342 yaşayan hücrelerde DNA içeriği ile ilişkili olan gibi hücre döngüsü algılamak için kullanılan bir DNA'ya bağlanıcı boya var. Höchst-33342-ekstrüzyon hücreler her iki emisyon kanal Höchst düşük bölümünde görünür (450 nm, Höchst mavi; 650 nm, Höchst kırmızı), diğer bir deyişle, bir kenara Höchst-adı "yan nüfusları" vererek istinat "ana nüfus",. SP hücreler hücreleri yaratıcı özellikleri ile zenginleştirilmiş ve kökenlerinin dayanıklı ABC taşıyıcılar (MDR1 ve ABCG2 gibi) yüksek bir ifade gösterir. Höchst 33342 iletişim kuralı aşağıdaki bölümleri için Höchst olarak bulunmakta. Işığa duyarlı malzemeler için ideal sonuçları korumak önemlidir.

  1. Verapamil ile Höchst ile boyama
    1. Verapamil (ile son bir konsantrasyon 83,3 µM) ve Höchst (5 µg/106 hücre son bir konsantrasyon ile) hücre ekleyin. Tüp Aiçin Verapamil ve Höchst tüp Biçin sadece Höchst kullanın. 90 dakika (37 ° C'de) bir su banyosunda kuluçkaya ve tüpler her 20 dk (Şekil 1G) dönmek.
    2. 470 x g RT. atma süpernatant, 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve her Pelet HBSS (1 x 106 hücre/mL) resuspend.
    3. 1.5 mL aliquot tek stainings ve tüp B (Şekil 2) negatif kontrol için al: (i) floresein isothiocyanate (FITC)-Birleşik anti-ani kalp durması-1; (II) allophycocyanin (APC)-Birleşik anti-CD31; (III) nonstained hücreleri (negatif kontrol).
      Not: İzotip denetimleri burada yalıtım Protokolü ayarlamak için kullanılır.
    4. A ve B kanalları ve 470 x g RT, 5 min için de tek boyama ve negatif kontrol aliquots Höchst ve verapamil yıkama için santrifüj kapasitesi.
    5. Süpernatant atmak ve granül tüp A ve (III) HBSS 250 µL negatif kontrol resuspend ve sıralama kadar buz karanlıkta tut.
    6. Tüp B Pelet HBSS 200 µL ve Pelet (ı, II), HBSS 100 µL tek boyama aliquots resuspend. FITC Birleşik anti-ani kalp durması-1 (0.6 µg/107 hücreleri) ve APC Birleşik anti-CD31 (0,25 µg/107 hücreleri) ekleyin. Buz üzerinde 30 dk için granül kuluçkaya ve onları zaman zaman karanlıkta sallamak.
    7. HBSS 2 mL tüpler için ekleyin. 470 x g RT., 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi
    8. Süpernatant atın ve 1 mL HBSS ve yukarıda olarak santrifüj ile tüm parçaları resuspend. Supernatants atın. Tek boyama aliquots Pelet HBSS 200 µL içinde resuspend. Tüp B Pelet HBSS (20 x 106 hücre/mL) resuspend.
    9. Buz üzerinde örnekleri tutmak ve sıralama kadar ışıktan korunan.
  2. Akış sitometresi ile sıralama
    1. Steril 1,5 mL tüpler 500 µL % 2 de dahil olmak üzere HBSS ile sıralama hazırlamak FBS.
    2. Ölü hücreleri dışlamak için 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0.15 µg/106 hücreleri) 10 dakika buzda hücrelerle leke.
    3. Aşağıdaki ayarları kullanarak kalp SP sıralamak: 350 nm (UV) uyarma kullanarak Höchst heyecanlandırmak, toplamak 450/50 nm bant geçiren filtresi (Höchst mavi) ve 670/30 nm bant geçiren filtresi (Höchst kırmızı) ile floresan emisyon ve 100 µm meme boyutunu ve basınç kullanın 15 psi.
    4. 5 x 105 olaylar için sıralama örnekleri ve negatif kontrol, verapamil kontrol ve tek boyama için 1 x 105 olayları analiz için kayıt örnekleri.
      Not: SP olduğunu yaklaşık % 0.5 - kalp %2 (Şekil 1 H) ama olabilir laboratuvarları ve yalıtır arasında değişmektedir. Ani kalp durması-1+/CD31- kesir % 1-11 toplam kalp SP (Şekil 1I) % civarındadır ancak laboratuvarları ve yalıtır arasında değişebilir. Ani kalp durması-1+/CD31- SP-TBM'leri SP-TBM'leri iletişim kuralı aşağıdaki bölümleri için olarak yazılır.

5. birincil izole SP-TBM'leri kültürünün

Not: Bu protokol için medya üç farklı türde kullanılmıştır. Onlar orta 1 (Noseda vd.göre) denir 8, Orta 2 ve orta 3 ve are açıklanan kendi kompozisyon ile ilgili Malzemeler tablo .

  1. 1-37 ° C kullanmadan önce Orta kadar sıcak ve sakin santrifüj ile 4 ° c 4 ° C ve 470 x g 6 min için sıralama tüpler santrifüj kapasitesi ve orta 1 hücrelerde resuspend.
  2. Hücreleri orta 1 4 mL ile gaz geçirgen bir P60 yemek koymak. Hücreleri % 70-%80 izdiham gelinceye orta her 3 d değiştirin.
    Not: Adım 5.2 yaklaşık 2-3 hafta sürebilir.

6. genişleme ve SP-TBM'leri farklılaşma

  1. Hücre kültürü
    1. 3 x 105 SP-TBM'leri orta 1'bir T75 şişesi 8 ml kültür.
    2. SP-TBM'leri %5 CO2 37 ° C'de % 70-%80 izdiham kadar her 2-3 d orta değişen kuluçkaya.
      Not: Cep numarasını kullanılan TBM'leri türünü, katlama zaman ve hücre boyutunu göre değiştirilmesi gerekir.
  2. SP-TBM büyüme ve canlılığı farklı serum konsantrasyonları altında
    1. Kültür T75 şişeler 8 mL orta 1 ile 2-3 d için SP-TBM'ler. Dikkatli bir şekilde orta Aspire edin ve sıcak (37 ° C) HBSS yavaşça 5 mL ile durulayın.
    2. Tripsin-EDTA 5 mL 5 min hücre kuluçka için hücrelerle tedavi, orta tripsin etkinliği durdurmak için 1 5 mL ekleyin ve hücre süspansiyon 15 mL tüp aktarın.
    3. 470 x g RT., 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi
    4. Orta 1 veya orta 2'yi (lineage indüksiyon orta) ve plaka 2.5 x 105 SP-TBM'leri P60 yemekleri ile farklı serum konsantrasyonları içeren orta 3 mL hücrelerde resuspend.
    5. Orta Orta 1 veya orta 2 kültür 2 d sonra adım 6.2.4 ölü hücreleri koleksiyonuna bir 15 mL tüp için çanak toplamak.
    6. Trypsinize olduğu gibi adım 6.2.2 yapışık hücreleri ve hücre süspansiyon adım 6.2.5 15 mL tüp içine toplamak. 840 x g RT., 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi
    7. Süpernatant Aspire edin ve hücre sayımı için 1 mL orta 1 veya orta 2 ekleyin. SP-TBM'leri ile trypan mavi (% 0,4) ve Kont trypan mavi pozitif (ölü) ve trypan mavi-negatif () hücrelerin leke.
      Not: Hücre canlılığı (adım 6.2.7) Toplam cep numarası ile ilgili olarak trypan-mavi negatif hücre sayı olarak verilir.
  3. İndüksiyon endotel farklılaşma
    1. (6-de) kültür plaka 10 µg/mL laminin (LN) veya fibronektin (FN) ile precoat.
      1. 10 µg/mL LN veya FN ile F12 Orta (veya PBS) içeren bir substrat çözeltisi olun. Her şey için 2 mL substrat çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de 30 dk plaka korumak
      2. Plaka çözümden Aspire edin ve istimal o kadar her şey için PBS 2 mL ekleyin.
    2. Adım 6.1.2 hücrelerden ortamından Aspire edin, yavaşça 5 mL sıcak (37 ° C) HBSS yıka, onları tripsin-EDTA 5 mL 5 min hücre kuluçka için ile tedavi, orta tripsin etkinliği durdurmak için 1 5 mL ekleyin ve hücre süspansiyon 15 mL tüp aktarın.
    3. 470 x g RT. aspiratı süpernatant, 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve Orta 2 hücre sayımı için ekleyin.
    4. Başına tohum 8 x 104 hücre Orta 2 3 mL ile kaplı plaka üzerinde iyi ve 20-24 h. değişiklik orta için 37 ° C'de orta 3 için 3 mL devam et.
      Not: Düşük serum konsantrasyonu içeren orta kullanmanızı öneririz — ve takviyeleri olmadan — ilk 20-24 h için. Biz kullanma önerilen < % 60 cep izdiham (yani, adım 6.3.4 cep numarası vardır bağlı olarak hücre boyutu ve büyüme hızı ayarlanabilir).
    5. 21 d için hücreleri kültür ve her 3 d orta değiştirin.
    6. Onları von Willebrand gibi endotel bir marker ile boyama farklılaşmış hücreler endotel doğası doğrulayın faktörü (vWF) ve performans gösteren floresans mikroskobu.
      1. PBS 1 mL hücrelerle yıkama ve % 3.7 formaldehit RT. 2 min için hücreleri tamir
      2. 30 dk için %0,1 Triton X GKD2O (veya PBS) içeren hücreleri permeabilize ve % 10 keçi serum RT. 1 h için ile blok
      3. Anti-von Willebrand faktör antikor (1: 100) 4 ° C'de 48 h hücrelerle kuluçkaya
      4. 3 hücreleri yıkama x ile PBS, 1 mL 10 dk her zaman için. Onları karanlıkta RT, 1 h için Alexa Fluor 546 keçi Anti-tavşan ikincil antikor ile (1:500) kuluçkaya.
      5. 10 dk her, yıkama tekrar 3 x 1 mL PBS ile. Karanlıkta RT, 5 min için 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI; 1:500) ile hücre çekirdeği leke.
      6. 3 hücreleri yıkama x, her, 5 min için PBS 1 mL ile. Hücreleri dağ ve onları 4 ° C'de depolayın
        Not: Adım 6.1 ve 6,3 kodlamayla koşulları (substrat, orta, tamamlayıcı reaktifler ve FBS konsantrasyon) Şekil 3' te açıklanmıştır.
  4. Tüp oluşumu tahlil
    1. Bir membran matris (Örneğin, Matrigel, bundan böyle matris anılacaktır) hazırlamak plaka.
      1. 4 ° C'de matris gecede çözülme.
      2. Kat 100 µL buz Matrix ile bir 96-şey plaka.
        Not: Herhangi bir kabarcıklar matris önlemek önemlidir. Tabakları matrisin jellification önlemek için buz kaplı olması gerek.
      3. Plaka için 30 dk 37 ° C'de korumak.
    2. (Adım 6.3.5 tamamlandıktan sonra) hücreleri ortamından Aspire, yavaşça 5 mL sıcak (37 ° C) HBSS de hücrelerle durulama ve hücre kuluçka 5 min için tripsin-EDTA ile tedavi. Orta tripsin etkinliğini durdurur ve hücre süspansiyon 15 mL tüp aktarmak için 3 ekleyin.
    3. 470 x g RT. aspiratı süpernatant, 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, 1 mL orta 3 ve damlalıklı yavaşça ekleyin.
    4. Hücreleri bir 35 µm hücre süzgeç ile filtre hücreleri toplanır.
    5. Hücreleri saymak ve 2 x 103 4 x 103 hücreleri orta 3 100 µL her matris kaplı de temel olarak belirler. Plaka 16 h hücre kuluçka 37 ° C'de tutun.
    6. Alan parlak mikroskop vasıl 2 X büyütme ile fotoğrafını çek.
      Not: eksik bir trypsinization söz konusu olduğunda en fazla 7-8 dk tripsin-EDTA için pozlama süresi uzatmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare SP-TBM yalıtım:

Bu çalışmada, biz ise fare TBM'leri sonuçlarından değiştiren ve izni (Şekil 8)33ile önceki bir rapordan eklendi SP fenotip göre izole fare TBM kullanılır.

Hücre çoğalması yüksek ve en düşük hücre yoğunluğu altında ve farklı Serum konsantrasyonları ile:

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı avantajları:

Bu iletişim kuralı bir TBM endotel farklılaşma tekniği sağlar. Bulduğumuz bir düşük serum konsantrasyonu ve düşük hücre yoğunluğu endotel farklılaşma, mademki LN FN bu koşullar altında daha bir daha uygun substrat kanıtladı verimliliğini artırabilirsiniz. Biz TBM'leri iki ayrı türü kullanılır: fare hangi izole ve genişletilmiş bir hücre satırı benzeri şekilde ve fare SP-TBM'leri kullanılan, TBM,. Özellikle, protokol her iki türü için uygulanabilir TBM'leri. mevcut ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Vera Lorenz deneyler ve personel Biyomedikal bölümü (DBM), üniversite ve Üniversite Hastanesi Basel akış sitometresi tesisinden sırasında ona yardımcı destek için teşekkür ederiz. Bu eser Stay-on parça programından Basel Üniversitesi (için Michika Mochizuki) tarafından desteklenmiştir. Gabriela M. Kuster İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (grant sayı 310030_156953) hibe tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kültür ortamı< / güçlü >
Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortamı (IMDM)ThermoFisher# 12440
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) / Besin Karışımı F12 JambonMerck#D8437
Penisilin-Streptomisin (P / S)ThermoFisher# 15140122
Fetal Sığır Serum (FBS)Hiklon#SH30071%3.5 (soy indüksiyonu için %0.1)
L-Glutamin ThermoFisher#25030Nihai konsantrasyon 2 mM
GlutatyonMerck#G6013
Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)Peprotech#AF-100-15
Rekombinant Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (FGF)Peprotech#AF-100-18B
B27 TakviyesiThermoFisher#17504044
Kardiyotrofin 1 Peprotech#250-25
TrombinDiagontech AG, İsviçre#100-125
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#14170
%0.05 Tripsin-EDTAThermoFisher#25300
T75 ŞişesiSarstedt#83.3911
Endotelyal farklılaşma   
Endotel Hücre Büyüme Ortamı (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Ham'ın F-12K (Kaighn'in) OrtaThermoFisher#21127
Laminin Merck#L2020
Fibronektin Merck#F4759ddH2O
6 Kuyulu PlakaFalcon#353046
Formaldehit ÇözeltisindeSeyreltin Merck#F1635PBS'de Diluite 1:10 (% 3.7 nihai konsantrasyon)
Triton X-100Merck# 93420ddH2O
Normal Keçi Serumu içinde% 0.1 (% 10)ThermoFisher#50062Z
Anti-von Willebrand Faktör antikoruAbcam#ab69941:100 in %10 keçi
serumu Keçi anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher#A110101:500 in %10 keçi serumu
4 ',6-diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür (DAPI)ThermoFisher#622471:500 içinde ddH2O 
SlowFade Antifade KitiThermoFisher#S2828
BX63 geniş alan mikroskobuOlympus
Tüp oluşumu
96 Kuyu PlakasıŞahin# 353072
Süzgeç Kapaklı 5 ml Yuvarlak Alt BoruFalcon# 352235
Matrigel Büyüme Faktörü AzaltılmışCorning# 354230
IX50 geniş alan mikroskobuOlympus
Sca-1 + / CD31- kardiyak yan popülasyon izolasyonu34< / sup> 
Reaktifler
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.ev hastane eczanesi# 9077862Çalışma çözeltisi: 200 mg / kg
Fosfat Tamponlu Salin (PBS) CaCl2 (-), MgCl2 (-)ThermoFisher# 20012
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) CaCl2 (-), MgCl2 (-), fenol kırmızısı (-)ThermoFisher# 14175HBSS 500 mL +% 2 FBS hazırlayın  Kollajenaz B aktivitesini söndürmek için 
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM) 1g/L D-Glikoz, L-Glutamin, PiruvatThermoFisher#331885DMEM Hazırlayın +% 10 FBS  + 25 mM HEPES + Hoechst stanining
Penisilin-Streptomisin için P / S  (P/S)ThermoFisher#15140122
HEPES 1 MThermoFisher#15630080Son konsantrasyon 25 mM
Fetal Sığır Serumu (FBS)Hyclone#SH30071
RBC LysisBuffer (10X)BioLegend#420301/100mLddH2O'da 1X'e seyreltin ve 0.2 & mikrodan süzün; m filtresi
Kollajenaz BMerck# 11088807001HBSS'de nihai konsantrasyon 1 mg / mL, 0.2 & mikrodan süzülür; m filtre
bisBenzimide H33342 Trihidroklorür (Hoechst)Merck#B2261ddH2O Verapamil-hidroklorür ve nbsp'de 1 mg / mL hazırlayın
;Merck#V4629Nihai konsantrasyon 83.3 & mikro; M 
APC Sıçan Anti-Fare CD31BD Biosciences# 5512620.25 ve mikro; g / 10 < > 7 < / sup > hücreleri
FITC Sıçan Anti-Fare Ly-6A / E (Sca-1)BD Biosciences# 5574050.6 ve mikro; g / 10 < sup> 7 < / sup> hücreleri
7-Aminoaktinomisin D (7-ADD)ThermoFisher#A13100.15 ve mikro; g / 10 < > 6 < / sup > hücreler
APC sıçan IgG2a k İzotip KontrolüBD Biosciences# 5539320.25 ve mikro; g / 107< / sup>cells
FITC Sıçan IgG2a k İzotip KontrolüBD Biosciences# 5546880.6 ve mikro; g/107cells
Malzeme
İğneler 27GTerumo#NN-2719R
İğneler 18GTerumo#NN-1838S
Tek Kullanımlık Şırıngalar 1 mL sterilCODAN#62.1640
Transferpipet 3,5 mLSarstedt#86.1171.001
Hücre Süzgeç 40 ve mikro; m maviBD Biosciences #352340
Hücre Süzgeci 100 & m sarıBD Biosciences#352360
Lumox Tabağı 50Sarstedt#94.6077.305
Kültür Yemekleri P100Corning#353003
Kültür Yemekleri P60Corning#353004
Mouse
LineAge> Yetiştirme< / güçlü >
C57BL / 6NRj / erkekevde 12 hafta
< güçlü > Ürün Adı< / güçlü >< güçlü > Şirket< / güçlü >< güçlü > Katalog No.< / güçlü >
< güçlü > Reaktifler< / güçlü >
Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortamı (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)/Besin Karışımı F12 JambonMerck#D8437
Penisilin-Streptomisin  (P/S)ThermoFisher# 15140122
Fetal Sığır Serumu (FBS)Hiklon#SH30071
L-Glutamin ThermoFisher# 25030
GlutatyonMerck#G6013
B27 TakviyesiThermoFisher# 17504044
Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)Peprotech#AF-100-15
Rekombinant Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (FGF)Peprotech#AF-100-18B
Kardiyotrofin 1 ve nbsp;Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, İsviçre # 100-125
Endotel Hücre Büyüme Ortamı (EGM) -2 BulletKitLonza#CC-3162
Ortam bileşimlerine genel bakış. Bu bilgilerden bazıları yukarıda verilenle aynıdır, ancak Ortam 1-3'ün bileşimine göre sıralanmıştır. < / güçlü >
< güçlü > Ürün Adı< / güçlü> < güçlü >Orta 1 < sup>8 < / sup>< / güçlü > <güçlü >Orta 2 < / güçlü >< güçlü > Orta 3< / güçlü >
< güçlü >Reaktifler< / güçlü >< güçlü > Kültür< / güçlü >< güçlü > Soy indüksiyonu< / güçlü >< güçlü > Endotel diff.
Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium (IMDM)35%35
%Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)/Besin Karışımı F12 Jambon%65%65
Penisilin-Streptomisin  (P/S)%1 %1
Fetal Sığır Serumu (FBS)%3.5&; % 0.1
L-Glutamin 2 mM2 mM
Glutatyon0.2 nM0.2 nM
B27 Takviyesi1.3
Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)6.5 ng/mL
Rekombinant Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (FGF)13 ng/mL
Kardiyotrofin 1 0.65 ng/mL
Trombin0.0005 U/mLKite dahil olan tüm gerekli bileşenler
Endotel Hücre Büyüme Ortamı (EGM)-2 BulletKitKite dahil olan tüm gerekli bileşenler
%

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
  2. Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
  3. Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255(2012).
  4. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  5. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
  6. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
  7. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
  8. Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930(2015).
  9. Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
  10. El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
  11. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
  12. Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
  13. Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
  14. Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
  15. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
  16. Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
  17. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  18. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
  19. Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
  20. Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
  21. Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
  22. Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
  23. Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
  24. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  25. Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  27. Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
  28. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
  29. Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195(2009).
  30. Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669(2011).
  31. Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
  32. Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).
  33. Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
  34. Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
  35. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  36. Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre TerapisiSoy Ba l lLaminin SubstratT p Olu umuFloresan MikroskopiH cre Yo unlu uKollagenaz Sindirimi

İlgili makaleler