Yöntem makalesi

Hastalık modelleme için insan 3D akciğer doku kültürleri (3D-LTCs) nesil

21.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58437

⸱

12 Şubat 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Comprehensive Pneumology Center, Ludwig-Maximilians-Universität and Helmholtz Zentrum Munich, 2German Center of Lung Research (DZL), 3Translational Lung Research and CPC-M bioArchive, Helmholtz Zentrum München, Comprehensive Pneumology Center Munich DZL/CPC-M, 4Department of Experimental Medical Science, Lung Bioengineering and Regeneration, Lund University, 5Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University, 6Stem Cell Centre, Lund University, 7Asklepios Fachkliniken Munich-Gauting, 8Department of Medicine, Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, biyolojik ve biyomedikal çalışmalarda 3D akciğer doku kültürleri modeli insan akciğer hastalıkları için oluşturmak için uygun özel dolu insan hassas kesim akciğer dilimleri rezeke hasta dokusundan hazırlanması için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Çeviri insan hastalık için yeni keşifler insan doku tabanlı modeller hastalığının göre stok miktarı sınırlıdır. 3D akciğer doku kültürleri (3D-LTCs) zarif temsil gibi kullanılan hassas kesim akciğer dilimleri (PCLS) ve biyolojik olarak son derece alakalı 3D hücre kültür modeli, son derece benzer biyomekanik kendi karmaşıklığı nedeniyle yerinde doku ve moleküler kompozisyon. Doku Dilimleme çeşitli hayvan modellerinde yaygın olarak uygulanır. 3D-LTCs insan PCLS elde edilen daha fazla mekanizmaları ve ilaçların insan dokusu içinde işlevsel etkileri daha iyi anlamak için yardımcı olabilir roman ilaçlara yanıt-e doğru çözümlemek için kullanılabilir. PCLS hazırlık cerrahi olarak rezeke akciğer doku örneklerinden akciğer lobektomi deneyimli, hastaların, peritumoral doku ve hastalıklı erişilebilirliğini artırır. Burada, biz insan PCLS cerrahi olarak rezeke yumuşak-elastik hasta akciğer dokusundan nesil için detaylı bir protokol tanımlamak. Özel resectates bronchoalveolar uzaya böylece akciğer yapısını koruyarak ve sonraki Dilimleme için çok önemlidir doku'nın sertliği artan kullanılmaya başlandı. 500 µm kalın dilim doku Block bir vibratome ile hazırlanmıştır. PCLS alınan biyopsi delikler karşılaştırılabilir doku örneklerin boyutu sağlamak ve daha fazla doku örneği miktarını artırmak. Oluşturulan akciğer doku kültürleri patofizyolojisi ve mekanizmaları, onun en iyi yönü (alt-) hücresel düzeyde fibrotik işlemler gibi farklı hastalıkların da dahil olmak üzere insan akciğer biyoloji çalışmalarda çeşitli uygulanabilir. 3D-LTC ex vivo modeli yüksek yararına in situ durumdaki insan akciğer 3D doku mimarisi, hücre türü çeşitlilik ve akciğer anatomisi yanı sıra doku bireysel hastaların değerlendirilmesi için potansiyel bakımından yakın onun temsilidir hangi daha fazla hassas tıp için yeni stratejiler geliştirmek uygundur.

Giriş

Kronik ve akut akciğer hastalıkları morbidite ve mortalite dünya çapında1önemli bir nedenidir. Obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH)2, şiddetli astım3, akciğer kanseri4 ve diffüz parenkima akciğer hastalıkları5gibi kronik akciğer hastalığı olan hastalar için iyileştirici tedaviler Şu anda kullanılabilir değil. Akciğer hastalıkları için hayvan modellerinde çalışmalar hastalık pathomechanisms6 anlayış derinleştirdi ve potansiyel yeni tedavi hedefleri7,8,9tanımlaması açmıştır olsa da, Bu modeller zaman insanlar10' a göre ilgili biyolojik ve fizyolojik farklılıklar sergilerler. Fare ve insan biyolojisi hem de anatomi, ex vivo 3D akciğer doku kültürü insan arasındaki bu farklılıkları aşmak için (3D-LTC) sistemleri Biyomedikal araştırma çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Bu 3D-LTC kültür sistemleri hassas kesim akciğer dilimleri (PCLS) temel alır. PCLS üretimi ex vivo kayma ve işlevsel ilişkiler tüm alveoller ve airways11, hem de interstitium, damarlara hücrelerinin incelenmesi için izin veren bir üçüncü kayma dimensionality analiz sağlar ve Mesothelium. Özellikle, PCLS ex vivo modelleri in situ olarak akciğer en işlevsel hücreleri içeren anlamına gelir, böylece yakından hücre yerel biyolojik ortamını temsil eden ve böylece sınırlı hücre-hücre ve hücre-matris etkileşim çoğu 2D üstesinden çok hücreli, hücre kültürü yaklaşıyor. Şu ana kadar ex vivo fare PCLS KOAH12, akciğer fibrozis13, akciğer kanseri14, viral enfeksiyon15,16, bronkopulmoner displazi17, gibi göğüs hastalıkları modellemek için kullanılan ve astım18. Ancak, yeni ilaç tedavileri insan akciğer hastalıklarında klinik deneylere araştırıldı hatırı sayılır bir oranda değil çevirmek için klinik etkinliği veya Emanet, onların eksikliği nedeniyle assumingly nedeniyle henüz insan arasında önemli farklılıklar ve fare biyoloji hastalığı19,20,ve21.

Birkaç yıl içinde insan PCLS büyük ölçüde ilaç ve kimyasallar akciğer toksisitesi değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak son zamanlarda, insan akciğer doku KOAH22,23, astım24ve akciğer fibrozis25, hastalardan patofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar takip kullanılmaya başlanmıştır. Tarafından rezeke hasta organ malzeme kullanarak ve PCLS üreten, bir büyük hastalık işaretlerinden temsil eden ve yerel hücresel çeşitlilik organ çoğunu bakımı bir karmaşık 3D doku çevre22 özetlemek. Ayrıca, çeşitli deneysel kurulumları uygulanan hastalıklı doku26,27,28,29karaciğer, bağırsak ve böbrek hastalığı gibi değişiklikler taklit etmek için gösterildi.

Ancak, akciğer dokusunun işleme çeşitli nedenlerden dolayı zor kalır. Sağlam doku, aksine yerel akciğer parankimi havalandırma daraltmak eğilimindedir ve daha düşük doku sertlik sergiler. Bu özellikler doku Dilimleme engel. Bu nedenle, havayolları ve düşük erime noktası özel alveoler boşlukla dolgu yerli akciğer yapısını korur ve fare ve insan akciğerleri30/ hassas kesme Dilimleme için gerekli sertliği sağlar. Araştırma amaçlı hibe insan akciğer resectates anatomik olarak, genetik ve fizyolojik açıdan son derece çeşitli, böylece sık sık yüksek arası hasta değişkenlik deneyler25gerçekleştirirken sunan onların doğası gereği vardır. Tüm lob veya tüm akciğer explants aksine, akciğer örnekleri aracılığıyla göğüs cerrahisi rezeke ille anatomik kesimleri izleyin ve, bu nedenle, özel bir hazırlık gerektirir. Bu makalede, insan PCLS rezeke akciğer dokusu ve onların sonraki ekimi ve deneysel kullanım modeli akciğer hastalığı için nesil için detaylı ve en iyi duruma getirilmiş bir protokol sağlar.

Protokol

İnsan dokusu kullanımı [Münih, Almanya (proje numarası 455-12)] Ludwig-Maximillian Üniversitesi Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Tümör içermeyen insan Akciğer rezeksiyonu Asklepios Biobank akciğer hastalıkları (Gauting, Almanya, proje numarası 333-10) için tarafından temin edilmiştir.

Not: İnsan PCLS üretim (Şekil 1) tüm yordamları steril laminar akış başlık altında yapılır.

1. hazırlanması aletleri ve malzemeler

  1. Aşağıda açıklandığı gibi özel ile akciğer dokusunun enflasyon için tüm malzemeleri hazırlayın.
    1. Yetiştirme ortamı hazırlamak: Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) F-12 L-Glutamine, HEPES, 10.000 IE penisilin, 10.000 IE streptomisin ve %0,1 (v/v) fetal Sığır serum ile desteklenmiştir.
      Not: Orta 37 ° C'de kullanılır
    2. Doku kağıt ile kaplı bir steril metal tepsi hazırlayın. Bir steril 15 cm hücre kültür tabak tepsiye yerleştirin.
    3. Hücre kültür çanak ekimi orta 15 mL ile doldurulması.
    4. %3 (w/v) özel çözüm düşük erime noktası özel en az 30 mL yetiştirme ortamının içinde uygun miktarda çözülerek hazırlayın.
    5. Bir mikrodalga çözümde kaynar kadar ısı. Özel çözüm 42 ° c su banyosu içinde ne yapıyorsun? Su banyosu içinde depolanan sıvı özel çözüm tutmak.
    6. Birkaç 50 mL konik tüpler ile sıvı özel dolu hazırlayın.

2. rezeke akciğer dokusu

  1. Mağaza taze tümör ücretsiz akciğer dokusunun lobektomi resectates hemen sonra adım 3 kadar 4 ° C'de DMEM F-12 ortamda rezeksiyonu.
  2. 4-8 h işleme önce soğuk iskemi zamanının fazla olamaz.

3. muayene ve seçim öncesinde özel doldurma rezeke doku

  1. Orta dokudan cımbızla kaldır. Doku, plevra, özellikle için herhangi bir hasar önlemek için cımbız, solunum yolları sadece doku ele.
  2. Doku kalitesi akciğer özel doldurma Tablo 1' de tanımlanan puanı ölçütlere göre puan.
  3. Doku'nın kalite 72 eşit veya yukarıda atılırsa adım 4'e geçin. Doku'nın kalite 60 atılırsa, devam özel doldurma ile daha fazla.
    Not: Doku puanı 60 ve 68 arasında özel doldurma ve doku Dilimleme hala makul sonuçlar doğurabilir ve deneme uzaması için nihai bir karara çalışmasına durumda yapılması gerekmektedir. Ancak, yukarıda belirtilen gereksinimleri, akciğer dokusu çoğunlukla özel doldurma başarısız.

4. akciğer doku enflasyon özel doldurarak

  1. Depolama ortamı dokudan kaldırın ve aşırı doku medyadan drenaj. Akciğer dokusu 1.1.2 içinde hazırlanan 15 cm kültür çanak içine aktarın.
  2. 1.1.3 üzerinden düşük erime noktası özel ile bir 30 mL şırıngaya doldur.
  3. Obturator kaldırarak bir periferik venöz kateter hazırlamak ve bir 30 mL şırınga bağlamak
  4. Bronş (mm içinde çap 0.5-3) doku sağlam bir bölümünü havalandırma doku tanımlamak (bkz. Şekil 2).
  5. Kanül seçili bronş Ekle (0,5-3 mm çapında).
  6. Yavaşça mümkün olduğunca kanül yavaşça ileri itin.
  7. Bronş kanül çevresinde forseps, ideal olarak aynı zamanda herhangi bir bitişik pulmoner arter sıkma ile kanül etrafındaki bronşiyal duvar sıkıştırarak kapatın.
  8. Ek diğer havayolları özel bu havayolları ile sızıntı önlemek için cerrahi bir kelepçe ile doldurmak.
  9. Doku kültürü çanak dan forseps ile kaldırın.
  10. El ile özel şırınga ile 0.3 mL/s daha hızlı dökün. Özel doldurma hızı yaklaşık olarak 0,05 ve 0.3 mL/s airways ve/veya atelectasis türdeş olmayan direnç nedeniyle arasında değişebilir.
  11. Dolgu ya da dokudan sızıntı özel yüksek direnç gözlenen tüm prosedürü adım 4.4 farklı bir bronş ile yeniden deneyin. Aşağıda açıklandığı gibi sorun gidermesi gerçekleştirmek.
    Not: Özel doldurma derecesi yüksek doku kateter konumunu ve özel doldurma kateter sonuçlarında küçük koni gibi bölgeler (*) (Şekil 2C) akciğer dokusunun derin penetrasyonu bağlıdır.
    1. Yüksek direnç durumunda uygun dolum (#) (2D rakam) dokusunun en bölgelerin kateter götürür konumlandırma deneyin.
    2. Fiş erken katılaşmış özel proksimal bronşlar veya diğer hava yolu tıkanıklıkları (ok) (2E rakam) doku eksik bir dolum için yol açabilir, bu kusurları doldurulmuş alanı ama bir dolgu yol açabilir gibi özel dolduruyor zorlamayın tıkalı doku parçaları.
    3. Cannulated bronş türetilmiş solunum ağaç rezeksiyon ve özel sıvı özel ( Şekil 2Foku) bir sabit sızıntı sonuçları doldurma sırasında hasar görmüşse havayolu sisteme daha fazla çevresel bir parçası kateter takın en az bir küçük parçası doku (*) (Şekil 2 g) doldurun. Ayrıca, hasarlı çevresel hava yolu cerrahi bir kelepçe (ok) (Şekil 2 H) ile kapatın.
  12. Akciğer dokusu tamamen doldurulana kadar özel geçerlidir. Bu doku yapısı ile hücreler için geri dönüşümsüz hasara neden olabilir gibi doku aşırı şişirmek değil.
  13. Dolgu için kullanılan bronş kelepçe hemen. Sıkma önce kanül kaldırın.
  14. Doku kültürü orta için özel katılaşma emin olmak 30 dk 4 ° C'de kuluçkaya.
  15. Rezeke doku birden fazla bronş girişi varsa, tüm doku parçaları özel ile doldurulur kadar 4.2-4.13 tekrarlayın.
  16. Dolu özel akciğer doku bölümleri Dilimleme kadar 4 ° C soğuk ortamda depolayın.

5. hassas kesim akciğer Dilimleme

  1. Bu sağlam ile özel dolu akciğer doku bölgeleri tanımlayın. Yavaşça hücre kültür çanak alt karşı cımbız ile basılı durumdayken sağlam dolgulu bölgeler çökecek değil.
    1. Bir tarafı hala plevra ile örtülmelidir ise 5.1, açıklanan bölgelerin tüketim 1-1.5 cm3 blok.
  2. Her bireysel doku blok vibratome sahibi bir cyanoacrylate tutkal kullanarak bağlantı kurmayı plevral yüzü takın.
    Not: Plevra biraz elastik ve bu nedenle vibratome bıçakla kesme engellemektedir. Doku tutucu yerleştirilir, plevra ile kesme çalışmasına engel olmayacak ve önemlisi, cyanoacrylate tutkal ve doku'nın parankimi tutkal en az difüzyon için izin arasında doğal bir bariyer oluşturur.
  3. Akciğer dokusu ile aşağıdaki ayarlarla vibratome dilim: kalınlığı: 500 µm, frekans: 100 Hz, genlik bıçak: 1,2 mm, 3-12 µm/s, doku sertlik üzerinde bağlıdır bıçak ileri hız. Dilimi düzgün kesme değil, yoksa doku blok titreşimle başlar bıçak çıkıntı hızını azaltın.
  4. Yavaşça dilimi o--dan vibratome tepsi forseps ile ekimi orta ile dolu bir 12-şey kalıbının kuyuya kaldırarak aktarın. Son olarak, standart hücre kültür koşullar altında bir kuluçka akciğer dilimleri kuluçkaya.
  5. Cyanoacrylate tutkal bu bölge doku bütünlüğünü tehlikeye olabilir beri doku blok 2-3 mm giderken stop Dilimleme dilimlenmemiş.

6. nesil PCLS yumruklar

  1. Akciğer dilimleri tek bir kuyudan bir boş 10 cm çanak aktarın.
  2. 4 mm biyopsi zımba bir PCLS üst yüzey için uygun yer ve saat yönünde ve saat yönünün tersine döndürme zımba taşımak başlar.
  3. Hücre kültür orta bir 96-şey plaka kuyu doldurun. Doku yumruklar forseps ile Asansör ve yumruklar bir 96-şey plaka kuyu aktarın. Son olarak, 1.1.1 içinde hazırlanan orta batık akciğer yumruklar kuluçkaya. bir hücre kültür kuluçka makinesine ((v/v) % 21 oksijen, 37 ° C'de % 5 (v/v) karbon dioksit ve % 95 nem) standart koşullar altında.

7. doku kültürü ve örnek hasat

  1. Kültür PCLS yumruklar bir kuluçka standart hücre kültür koşullar altında gecede.
  2. Kültür PCLS ve en fazla 120 saat sonra hücresel canlılığı ve işlevi sağlamak için onların nesil Seviyelendirilmiş koşul altında yumruk.
  3. Protein hem de RNA ürün toplama, PCLS yıkayıp, yumruk üç kez fosfat tamponlu tuz (PBS), onları cryovials aktarmak ve ek-sıvı azot kıpırdama.
  4. Örnek orta süpernatant kültürlü PCLS, salgılanan proteinler analiz için yumruk atıyor.
    1. Histolojik analizler için PCLS ve üç kez PBS ile yumruk yıkama ve 37 ° C'de 30 dk için kuluçka tarafından %4 paraformaldehyde ile düzeltmek Son olarak, PCLS 4 ° C'de daha da aşağı akım boyama için PBS içinde saklayın.

Sonuçlar

PCLS üretimi
PCLS nesil dört temel adım ayrılabilir: cerrahi akciğer doku rezeksiyon, özel doldurma, vibratome-PCLS üretimi ve PCLS kültür. Rezeke akciğer doku düşük erime noktası gerekli sertliği Dilimleme için akciğer doku ekler ve mimarisi ve yerel akciğer yapısını koruyan özel ile dolu. Not, PCLS üretimi son derece zaman alıcı, böylece sık sık gece DMEM F-12 orta dolu akciğer dokusunda depolanmasını ek bir adım dahil edilebilir ve PCLS üretimi ise ertesi gün başladı. Aşağıdaki deneysel kurulumuna bağlı olarak oluşturulan PCLS gecede standart hücre kültür deneysel koşullar uygulanabilmesi %0,1 (w/v) fetal Sığır serum içeren ortamda inkübe. 3D-LTCs uygun ve (gibi yüzey aktif protein salgılanması) hücresel işlevler için ilâ 120 h22 kültür koşullarında bu Protokolü (Şekil 1) özetlenen ve daha fazla geliştirme bunların en iyi şekilde sergiledi.

Özel doldurma
Özel dolgu için doku, periferik venöz kateter bağlı özel dolu şırınga 1.3 mm çapında bir kanül bronş kesme doku (Şekil 2A) yüzey içine eklenir. Bronşlar kez pulmoner arter yakın lokalizedir. Arterlerin ince duvarlar ve daraltma eğiliminde iken, bronşlar iyi görünür lümen sergiledi. Bağlı olarak doku'nın bütünlüğü, kateter solunum ağaç birçok nesiller boyunca akciğer çevre gelişmiş olabilir. Nüfuz bronş kanül cımbız (Şekil 2B) kullanarak mühürlendi. Pulmoner arter cımbız ile aynı anda sabitlenmiş. Daha sonra doku kaldırdı ve sıvı özel yavaşça airways telkin.

Kateter konumuna bağlı olarak, doku çoğunluğu sıvı özel (Şekil 2B) ile doldurulabilir. İsteğe bağlı olarak, koni tarafından nüfuz bronş havalandırılmış Long parankimi yansıtan parçaları akciğer dokusunun gibi özel (Şekil 2C) ile dolu. Her iki durumda da, sağlam dolu doku bölgeleri karakteristik paterni görülebilir: ilk olarak, doku önemli bir bölümünü dilimleri (Şekil 2B) dolu, ya da ikinci olarak, daha küçük alanlarını iyice çıkıntılı dolu doku bölgeleri ( görünür Şekil 2C). Özel pıhtı ya da diğer sebepler nedeniyle solunum yolları parçalarını engel yapıyorsanız, doku parçaları düzgün özel ile doldurulması değil. Böylece, sadece doku parçaları Dilimleme için geçerli olabilir. Sızdırmazlık özel yordamın doldurma sırasında durumunda parçaları dolgulu solunum ağacının delikli ve dolum akciğer dokusunun ancak neredeyse imkansız alır, dolgu ile bir daha periferik bronş, daha derin bir olası geçici çözümler içerir kanül nüfuz içine distal airways (Şekil 2 g), ya da sızıntı alanı (Şekil 2 H) potansiyel sıkma.

Hassas kesim akciğer Dilimleme
Doku blok uzunluğu ve genişliği 1-1.5 cm kadar tamamen katılaşmış özel ()Şekil 3Aile doluydu doku bölgelerden eksize-3B). Daha sonra bireysel doku blok vibratome (Şekil 3 c) doku tutucu yapıştırılmış. kalın PCLS oluşturulan, vibratome doku bloğunda ileri 3-12 µm/s. arasında hızıyla ilerliyordu ise 500 µm (şekil 3D-3F). Son olarak, PCLS hücre kültür %0,1 (w/v) fetal Sığır serum içeren ortamda batık ve standart hücre kültür koşulları, Seviyelendirilmiş adım 7 kültürlü.

İnsan 3D-LTC kültür, 48 saat sonra deneysel sonuçlar
Bir temsilci ayirt, Alsafadi ve ark.25tarafından daha önce açıklandığı bir boyama Şekil 4A-4 Cgösterilir. Fibronektin (kırmızı) ve ex vivo insan 3D-LTC korunmuş alveoler yapısında görüntüleme için izin verilen hücre çekirdeği (DAPI, mavi), Immunolabeling. İnsan fibrozis gibi değişiklikler 48 h sonuçlandı için insan tedavisinde profibrotic sitokin (dönüştürme büyüme faktörü beta 1, trombosit elde edilen büyüme faktörü AB, lipophosphatidyl asit ve tümör nekroz faktör alfa dahil olmak üzere) kokteyl ile PCLS yumruk atıyor 3D-LTCs. QPCR tarafından fibrozis ilgili ekstraselüler matriks bileşenleri kollajen türü 1 ve fibronektin genlerin 3D-LTC yumruklar içinde önemli bir indüksiyon profibrotic kokteyl (Şekil 4 d) ile tedavi üzerine gözlendi. Ayrıca, protein düzeyleri mezenkimal marker vimentin 3D-LTC yumruklar (Şekil 4E) tedaviden sonra 3 4 hastalarda upregulated bulundu.

PCLS süreci: doku rezeksiyonu, agaroz dolgusu, dilim hazırlama, kültür; Zaman çizelgesi diyagramı.
Şekil 1: iş akışı PCLS nesil. Tümör içermeyen alanları Akciğer rezeksiyonu iyice nedeniyle kendi doku bütünlüğü denetlenir. Doku daha fazla kullanım için uygun atılırsa (Puanlama açıklanmıştır Gereç ve yöntemler bölümünde ayrıntılı olarak), bu sonraki sıvı özel ile doludur. Doku blokları ile katılaşmış özel dolu daha sonra bir vibratome ile dilimlenmiş. Hücre kültürü ortamında batık, 3D-LTC kültürlü s 120 kadar onların nesil sonra. 3D-LTCs aşağı akım analizleri protein veya RNA ifade, Imaging canlı doku floresans yanı sıra doku fiksasyon sonra boyama ayirt içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Arter ve bronş diyagramı ile akciğer perfüzyon deney düzeneği, enjeksiyon sürecini gösterme.
Şekil 2: akciğer dokusu ile düşük erime noktası özel doldurma. Akciğer dokusu bir bronş akciğer atardamarı (Şekil 2A) bitişik eklendiği bir periferik venöz kateter ile cannulated. Cımbız kanül bronş içinde düzeltmek için ve pulmoner arter sıvı özel sızıntı önlemek için kelepçe için kullanılır. Sıvı özel 42 ° C'de 30 mL şırınga (Şekil 2B) akciğer dokusu içine dökülür. Proksimal konumlandırma (Şekil 2B) hacmin daha büyük bir doku doldurma sağlayacaktır ise distal kanül dolum sırasında konumlandırma dolu doku (Şekil 2C), küçük alanlarda neden olur. Solunum yolları herhangi bir engelleri azaltmak (Şekil 2E) olabilir cilt dokusunun dolu. Özel sızması durumunda, konumlandırma ve/veya sızıntı yan sıkma distal bir kanül sağlar uygun özel dolgu ()Şekil 2Fakciğer dokusunun-2 H). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Doku kesit alma işlemi; diyagram, doku bloğu hazırlama, mikrotom kesme, deney düzeneği.
Şekil 3: akciğer hassas kesme dilimleme. Başarılı bir şekilde özel dolu akciğer dokusunun bir parçası bir doku blok tüketim için kullanılır (1 cm x 1,5 cm x 1 cm) bir neşter (Şekil 3A) ile. Çıkarılan doku blok doku tutucu sonraki yapıştırılmış, ölçek çubuğu 1 cm (Şekil 3B) gösterir. Tercihen, doku, Şekil 3 ciçinde gösterildiği gibi doku tutucu yüzeyine plevral yüzeyi ile yapıştırılmış olan. 500 µm kalınlığında dilimler tarafından vibratome doku (şekil 3D ve 3E) göre 10 ° - 15 ° açılı Safir bir bıçakla kesilir. Kesme yordamı sonuç 2-3 cm3 büyük sağlam akciğer dilimleri, ölçek çubuk 5 mm (Şekil 3F) =. Ayrıca, bir biyopsi zımba kullanarak, küçük tekrarlanabilir yumruklamak çapı 4 mm ile oluşturulabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Hücre kültürü analizi; immünofloresan (AC), gen ekspresyonu (D) ve protein seviyeleri (E) karşılaştırması.
Şekil 4: 48h kültürünün sonra insan 3D-LTCs deneysel veriler. 4 mm çapında bir insan 3D-LTC yumruk immunostained (kırmızı), fibronektin ve DAPI (mavili) olduğunu ()Şekil 4A-4C). Ölçek çubukları 1000 µm. Şekil 4 c gösterir birleştirilen görüntüyü =. PCLS kantitatif RT-PCR tarafından analizini RNA COL1A1 ve FN1 gen ekspresyonu önemli artışlar tarafından profibrotic kokteyl25gösterir. Şekil 4E tüm protein lysates ile fibrotik kokteyl25tedavi edildi PCLS, bir immunoblot görüntüler. Profibrotic ile tedavi hasta numuneleri 1, 3 ve 4 faktörler sonra Vimentin ve β-aktin sondalama mezenkimal işaretleyici (vimentin) artan protein ifadesi gösterdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

ÖlçütPuan
Doku örneği sağlam plevral yüzeye sahiptir.20
Doku örneği macroscopically olduğu gibi kesik, ezici, kopma ve çarpıtmalar eksik gibi görünüyor.20
Doku örneği en az bir bronş çapında içerir > 1mm.20
Doku örneği Hayır değeri yer alır veya yalnızca az miktarda kan.4
Doku örneği tam ortamda saklanan ve atelectasis belirgin bir iz yok gösterir.4
Doku örneği son dört saat içinde rezeke.4
Doku örneği, en büyük çapı 5 cm daha büyüktür.4
Özetle puan edinildi:

Tablo 1: skor doldurma akciğer özel. Akciğer özel doldurma puanı (LAFS) ile sonraki vibratome tabanlı PCLS üretim için özel bir doku rezeksiyon doldurmak için başarı oranı ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Skor doku tarafından bir araya geldi kriterlerinin tüm noktaları özetliyor. Bir LAFS eşit veya 72 iyi özel özellikleri doldurma öngörür, özel dolgu dokusunun son derece olası bir başarısızlık bir puanı 60 altına öngörür.

Tartışma

Bu el yazması açıklanan protokol PCLS nesilden insan akciğer doku resectates sıvı özel ve sonraki vibratome Dilimleme ile doldurarak kapsar. Oysa bu organların doğasında sertliği doku herhangi bir değişiklik olmadan Dilimleme doğrudan izin dokusu dilimlerin nesil önce organlar, karaciğer ve beyin, gibi birkaç gösterilmiştir. Belirtmek gerekirse akciğer dokusunun ilk uygun hazırlık PCLS üreten en önemli adımdır. Özel dolgu akciğerin yönteminin seçimi, yumuşak ve esnek doğası stabilize etmek ve homojen ve tekrarlanabilir PCLS üretimi sağlamak için var. Büyük havayolları rezeke akciğer dokusu bozulmamış akciğer parankimi yanı sıra küçük airways erişim sağlamak için cannulated. Özel doldurma neredeyse imkansız hale getiriyor, sağlam bir plevra eksikliği neden akciğer doku akciğer Dilimleme için kullanışlı değildir çoğunlukla önemli bir nedendir. Prospektif, ilk olarak fonksiyonel deneyler decellularized iskele üzerinde gerçekleştirmek için tasarlanmış bir sentetik plevra başarılı özel dolgu bir bozulmamış plevra31eksikliği explants ulaşmak için potansiyel olarak uygulanabilir. Bir insan akciğer doku parçası olduğu gibi plevra ile sonuçlanan rezeksiyonu Dilimleme için doku blok oluşturmak için gereklidir. Rezeke doku daha tümör-Alerjik dokudan kanser rezeksiyonu nedeniyle tamamen bozulmamış loblar veya bütün akciğer explants akciğer nakli yapılan hastaların kullanılabilir.

Genellikle, iki sistem PCLS üretmek için kullanılır: Krumdieck doku dilimleyici15 ve titreşimli microtomes (vibratomes). Doku Dilimleyiciler PCLS 90 ° bu gemi sonunda keser bir metal damar yoluyla bir doku blok geçirerek dilimler oluşturur. Vibratomes oluşturmak PCLS bir titreşimli taşıyarak bıçak Krumdieck dilimleyiciye karşılaştırıldığında soğutmalı bir orta banyoda batık doku bağlantılı bir blok üzerinde yatay olarak giderek artan doku daha az kesme gücü. Bu ekimi önce dokusunun daha az sert tedavi olur. Öte yandan, vibratome kesme daha fazla zaman ve iş alıcı olduğunu. Elimizde, maksimum 100 PCLS veya 500 PCLS üretimini etkin Dilimleme vibratome bir günde, en deneysel çalışmalar için yeterli yumruk atıyor. PCLS çeşitli şekillerde kültürlü: (a) Trans-wells için böylece bir hava sıvı arabirim oluşturma, (ALI) sistemi, dinamik organ Kültür (DOC) (b) olarak bağlı, veya (c) hücre kültür orta standart hücre kültür koşulları, sular altında. Yukarıda açıklanan22,23,25PCLS ayrıntı ekimi yapıldı; Ancak, bunların kullanım dünyanın her yerinden çeşitli Labs'de arasında yetiştirme koşulları ortak bir standart yok. Özellikle, kültür zaman kritik olabilir: fare PCLS olduğu gibi SFTPC olumlu alveoler tip 2 hücrelerinin kaybı 144 h sonra ama 120 h22sonra görülmektedir. Buna ek olarak, metabolik aktivite fare22 ve insan PCLS25 120 h için kalır kararlı gibi görünüyor.

PCLS üretimi için birkaç teknik sınırlamaları vardır: resectates boyutunu ve sayısını değişiklik gösterir zaman içinde; alınan doku içinde olduğu gibi plevra varlığını bağlıdır, özel doldurma, verimliliğini PCLS üretimi son başarısını belirler; ve elde edilen (hastalıklı) akciğer dokusu içinde patolojik değişiklikler neden doku yıkımı PCLS hazırlık ile etkileşebilir. Hava yolu tıkanıklıkları ve fibrotik doku sağlam alveoler alanı eksik özel doldurma engel ve böylece fibrotik doku zorlu bir görev Dilimleme olun. KOAH veya Alfa-1-anti-tripsin eksikliği değil dayanabilir doldurma özel baskısı ve kopma alveoller ve mimari eserler yol açacak gibi hastalıklarda emphysematous doku olarak buldum. Bu gibi durumlarda, örneğin, %1 (w/v), düşük özel konsantrasyon kullanımı özel doldurma sırasında hız ve basıncı azaltmak yararlı olabilir. Genel olarak, doku hastalığı durumunu önemli ölçüde PCLS üretimi için doku kullanımını sınırlayabilirsiniz. Bu parametreler akciğer dokusundan üretilen PCLS miktarını belirlemek ve aynı zamanda bu PCLS üretmek için gereken süre. Ayrıca PCLS sınırlamaları daha fazla deneyler için normalleştirme adımları gerektirir boyutu veya doku içerik ile ilgili olarak farklı akciğer dilimleri arasında tutarsızlıklar vardır. Bu sorunu gidermek için aynı dilim benzer bölgelerinde biyopsi yumruklardan oluşturulabilir. Bu yordamı doku değişkenliği azaltmak ve ek bir yararı, deneyler için kullanılan PCLS örneklerin sayısını artırmak, apt.

Sonuç olarak, insan 3D akciğer doku kültürleri özel PCLS dolu akciğer fizyolojisi ve Hastalıkları Eğitim için karmaşık bir insan modeli sağlar. Protokol PCLS hazırlık rezeke akciğer dokusu ve onların ekimi ayrıntılı bir açıklamasını sağlar ve ayrıca özel doldurma insan Akciğer rezeksiyonu ve nasıl bunların üstesinden içinde sorunlarını ele alır.

Açıklamalar

Tüm yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Teşekkürler

Yazarlar Marisa Neumann için uzman teknik yardım için minnettarız. Tüm akciğer dokusu TBM-M biyo-Arşiv tarafından sağlanan lütfen. Bu eser akciğer araştırma (DZL), Helmholtz Derneği ve TBM araştırma okul hibe Almanca Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Vibratom Hyrax V50Zeiss-Hyrax
CU 65Zeiss-Vasofix
Braunü le 18 GB. Braun Melsungen AG4268130B
30 mL NORM-INJECTHenke Sass Wolf4830001000
Korumalı tek kullanımlık neşterler, sterilSwann-Morton
Loctite 406HenkelLOCTITE 406
Sentetik Tek Kristal SafirDelaware Elmas Bıçaklar-
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta F-12 Nutreient Karışımı (Jambon) + L-Glutamin + 15mM HEPESGibco31330-038
Penisilin StreptomisinGibco by Life Technologies15070-063
Özel işlem fetal sığır serumu (Sera Plus)Pan BiotechP30-3702
Tek Kullanımlık Biyopsi Punchpfm medikal48401
96 Kuyu, Siyah/Şeffaf, Doku Kültürü İşlem Görmüş Plaka, Kapaklı Düz Tabanlı, sterilFalcon / Corning353219
Agaroz, düşük jelleşme sıcaklığıSigmaA9414-100G

Kaynaklar

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
  2. Rosenberg, S. R., Kalhan, R., Mannino, D. M. Epidemiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Prevalence, Morbidity, Mortality, and Risk Factors. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine Med. 36 (4), 457-469 (2015).
  3. Hekking, P. P., et al. The prevalence of severe refractory asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (4), 896-902 (2015).
  4. Woodard, G. A., Jones, K. D., Jablons, D. M. Lung Cancer Staging and Prognosis. Cancer Treatment and Research. 170, 47-75 (2016).
  5. Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (4), 431-440 (2011).
  6. Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung: basic composition and alterations in chronic lung disease. European Respiratory Journal. 50 (1), (2017).
  7. Degryse, A. L., Lawson, W. E. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis. The American Journal of the Medical Sciences. 341 (6), 444-449 (2011).
  8. Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (6), 629-645 (2014).
  9. Sagar, S., Akbarshahi, H., Uller, L. Translational value of animal models of asthma: Challenges and promises. European Journal of Pharmacology. 759, 272-277 (2015).
  10. Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 41 (2), 57-73 (2015).
  11. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of beta2-adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  12. Skronska-Wasek, W., et al. Reduced Frizzled Receptor 4 Expression Prevents WNT/beta-Catenin-driven Alveolar Lung Repair in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 196 (2), 172-185 (2017).
  13. Lehmann, M., et al. Senolytic drugs target alveolar epithelial cell function and attenuate experimental lung fibrosis ex vivo. European Respiratory Journal. 50 (2), (2017).
  14. Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73(2014).
  15. Ebsen, M., et al. Infection of murine precision cut lung slices (PCLS) with respiratory syncytial virus (RSV) and chlamydophila pneumoniae using the Krumdieck technique. Pathology - Research and Practice. 198 (11), 747-753 (2002).
  16. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  17. Royce, S. G., et al. Airway Remodeling and Hyperreactivity in a Model of Bronchopulmonary Dysplasia and Their Modulation by IL-1 Receptor Antagonist. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (6), 858-868 (2016).
  18. Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (10), L1219-L1228 (2015).
  19. Zscheppang, K., et al. Human Pulmonary 3D Models For Translational Research. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
  20. Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Human & Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  21. Wang, L., et al. Differences between Mice and Humans in Regulation and the Molecular Network of Collagen, Type III, Alpha-1 at the Gene Expression Level: Obstacles that Translational Research Must Overcome. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 15031-15056 (2015).
  22. Uhl, F. E., et al. Preclinical validation and imaging of Wnt-induced repair in human 3D lung tissue cultures. European Respiratory Journal. 46 (4), 1150-1166 (2015).
  23. Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicology and Applied Pharmacology. 246 (3), 107-115 (2010).
  24. Banerjee, A., et al. Trichostatin A abrogates airway constriction, but not inflammation, in murine and human asthma models. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 132-138 (2012).
  25. Alsafadi, H. N., et al. An ex vivo model to induce early fibrosis-like changes in human precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), L896-L902 (2017).
  26. Westra, I. M., Oosterhuis, D., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut liver slices as a model for the early onset of liver fibrosis to test antifibrotic drugs. Toxicology and Applied Pharmacology. 274 (2), 328-338 (2014).
  27. Vatakuti, S., Schoonen, W. G., Elferink, M. L., Groothuis, G. M., Olinga, P. Acute toxicity of CCl4 but not of paracetamol induces a transcriptomic signature of fibrosis in precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 29 (5), 1012-1020 (2015).
  28. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Disease Models & Mechanisms. 8 (10), 1227-1236 (2015).
  29. Li, M., de Graaf, I. A., Groothuis, G. M. Precision-cut intestinal slices: alternative model for drug transport, metabolism, and toxicology research. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (2), 175-190 (2016).
  30. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  31. Wagner, D. E., et al. Design and Synthesis of an Artificial Pulmonary Pleura for High Throughput Studies in Acellular Human Lungs. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 184-195 (2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nsan Akci er DokusuHassas Kesim Akci er Dilimleri3B Akci er Doku K lt rleriVibratom ile KesmeAgaroz ile DoldurmaBiyopsi Pun lamamm nofloresan AnalizWestern BlottingqRT PCR AnaliziFibrozis Modelleme

İlgili makaleler