Method Article

Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi

DOI:

10.3791/58441

⸱

December 10th, 2018

 ,  , 
1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada PEG aracılı dönüşüm yöntemi kullanarak önceki proteinler ifade için bir protokol açıklayın. Kolay ifade ilgi protein ve protein yerelleştirme ve çeşitli deneysel koşullar için alma işlemini verimli soruşturma yöntemdir içinde vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kloroplast bitkilerde fotosentez ve birçok sekonder metabolitler ve lipidler üretimi gibi çeşitli hücresel süreçler sorumlu bir önemli organel olduğunu. Kloroplast proteinler, çok sayıda bu çeşitli fizyolojik işlemlerini gerçekleştirmek için gerekir. Üzerinde kloroplast proteinlerin % 95'i sitozolik ribozomlara çeviri sonra çekirdek kodlanmış ve kloroplast sitozol üzerinden içine alınan. Böylece, uygun alma veya bu çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler kloroplast için hedefleme kloroplast yanı sıra bitki hücre düzgün çalışması için gereklidir. Çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler belirli kloroplast için hedefleme için sinyal sıraları içerir. Moleküler makine kloroplast veya sitozol lokalize bu sinyalleri tanımak ve alma işlemi taşımak. Protein alma veya kloroplast içinde vivoiçin hedefleme mekanizmaları araştırmak için Arabidopsis kloroplast protein içe aktarma işlemi çözümlemek için bir hızlı, verimli protoplast tabanlı yöntemi geliştirdi. Bu yöntemde, Arabidopsisyaprak dokulardan izole önceki kullanın. Burada, biz tarafından proteinler kloroplast alındığı mekanizması araştırmak için önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kloroplast tesislerinde en önemli organelleri biridir. Kloroplast ana işlevleri fotosentez1taşımak için biridir. Kloroplast da yağ asitleri, amino asitler, nükleotit ve çok sayıda sekonder metabolitler1,2üretimi için birçok biyokimyasal reaksiyonlar yürütmek. Tüm bu tepkiler, proteinlerin farklı türleri, çok sayıda kloroplast gerektirir. Ancak, kloroplast genom sadece yaklaşık 100 gen3,4içerir. Bu nedenle, kloroplast onların proteinler çoğunluğu sitozol almanız gerekir. Aslında, çoğu kloroplast proteinler sitozol çeviri

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Arabidopsis bitkilerin büyüme

  1. 1 L Gamborg B5 hazırlamak B5 orta 3.2 g ekleyerek (B5) orta vitaminler, 20 g sükroz, yaklaşık 800 ml deiyonize su 2-(N-morpholino) etan sülfonik asit (MES) 0.5 g de dahil olmak üzere ve pH 5.7 ile potasyum hidroksit (KOH) için ayarlayın. Ekle daha deiyonize su getir toplam hacim 1 L. eklemek 8 g phytoagar ve otoklav 121 ° C'de 15 dakika için
  2. Aşağı 55 ° C serin ve temiz bir Bank, Petri kabına (9 cm çapında, yüksekliği 1,5 cm) içine B5 orta 20 – 25 mL dökün orta izin. Tabak 2 – 3 gün kuru, temiz film ile onları paketi ve onları kadar kullanmak bir buzdolabında saklayın.
  3. Arabidopsis thaliana steriliz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İçe aktarma işlemi proteinlerin kloroplast iki yaklaşım kullanılarak incelenebilir: floresans mikroskobu ve immunoblot analizden sonra SDS-sayfa-aracılı ayırma. Burada, biz RbcS kullanılır-nt:GFP, bir füzyon oluşturmak için GFP erimiş transit peptid içeren RbcS 79 N-terminal amino asit kalıntıları kodlama. Proteinler kloroplast alındığında, yeşil floresans hedef protein RbcS sinyalleri-nt:GFP birleştirme ile klorofil auto-floresan, gelen kırmızı floresan sinyallerini floresans mikroskobu .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz protein ithal etmek içine kloroplast çalışmaya Arabidopsis önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağladı. Bu protein alma işlemi soruşturma için güçlü bir yöntemdir. Bu basit, çok yönlü teknik kloroplast için amaçlanan kargo proteinlerin hedefleme incelenmesi için yararlıdır. Bu yöntemi kullanarak, önceki yaprak dokuları tam olgun yaprakları çok erken arasında değişen birçok farklı büyüme aşamalarında bitkilerden elde Arabidopsis11,12 h.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser kooperatif araştırma programı destekler ile tarım bilim ve teknoloji geliştirme (Proje No için yapılmıştır PJ010953012018), Kırsal Kalkınma İdaresi ve ICT (No. 2016R1E1A1A02922014) ve Bilim Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı (Kore) hibe Kore.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
VİTAMİNLER İÇEREN GAMBORG B5 ORTAMIDuchefa BiochemieG0210.0050
SUCROSEDuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHYDRATDuchefa BiochemieM1503.0250
Agar, tozJUNSEI24440S1201
Mikro gözenek Cerrahi bant3M1530-0
Cerrahi bıçak paslanmaz No.10FEATHERKullanılamayan
Konik Tüp, 50mlSPL YAŞAM BİLİMLERİ50050
Makrozyme R-10YAKULT İLAÇ SANAYİ LTD. ŞTİ.Kullanılamayan
Selülaz ONOZUKA R-10YAKULT İLAÇ SANAYİ VE TİCARET SANAYİKullanılamıyor
ALBÜMIN, SIĞIR (BSA)VWR0332-100G
D-MANNITOLSIGMAM1902-1KG
KALSİYUM KLORÜR, DİHİDRATMP BİYOMEDİKAL0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
CD-1 için ekran kapağıSIGMAS1145
CD-1 için EkranlarSIGMAS3895
Petri KabıSPL YAŞAM BİLİMLERİ10090
Pastör pipetiHILGENBERG3150102
LABORATUVAR SANTRİFÜJ / TEZGAH ÜSTÜVİZYON BİLİMSELVS-5500N
Sodyum klorürJUNSEI19015S0350
Potasyum klorürSIGMAP3911-1KG
D-GLIKOZ, SUSUZBIO BASICGB0219
Potasyum HidroksitDUKSAN40
Kalsiyum nitrat tetrahidratSIGMAC2786-500G
Poli (etilen glikol)SIGMAP2139-2KG
Magnezyum klorür hekzahidratSIGMAM2393-500G
Tüp 13ml, 100x16mm, PPSARSTEDT55.515
Mikroskop slaytlarıMARIENFELD1000412
Mikroskop Kapak CamlarıMARIENFELD101030
Sayma HaznesiMARIENFELD650030
Axioplan 2 Görüntüleme MikroskobuCarl ZeissKullanılamıyor
Mikro tüp 1.5mlSARSTEDT72.690.001
2- MerkaptoetanolSIGMAM3148-250ML
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS), Proteomik SınıfVWRM107-500G
TRIS, Ultra Saf SınıfVWR0497-5KG
DTT (DL-Ditiyotreitol), Biyoteknoloji SınıfıVWR0281-25G
Bromofenol mavi sodyum tuzu ACSVWR0312-50G
GliserolJUNSEI27210S0350
Canlı Renkler AV Monoklonal Antikor (JL-8)TAKARA632381

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Import ChloroplastsProtoplast IsolationFluorescence MicroscopyImmunoblotting AnalysisChloroplast Protein TargetingArabidopsis ProtoplastsProtein Import AssayGFP Fusion ProteinCentrifugation ProtocolsSucrose Gradient

Related Articles