Yöntem makalesi

Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi

DOI:

10.3791/58441

⸱

10 Aralık 2018

 ,  , 
1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada PEG aracılı dönüşüm yöntemi kullanarak önceki proteinler ifade için bir protokol açıklayın. Kolay ifade ilgi protein ve protein yerelleştirme ve çeşitli deneysel koşullar için alma işlemini verimli soruşturma yöntemdir içinde vivo.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kloroplast bitkilerde fotosentez ve birçok sekonder metabolitler ve lipidler üretimi gibi çeşitli hücresel süreçler sorumlu bir önemli organel olduğunu. Kloroplast proteinler, çok sayıda bu çeşitli fizyolojik işlemlerini gerçekleştirmek için gerekir. Üzerinde kloroplast proteinlerin % 95'i sitozolik ribozomlara çeviri sonra çekirdek kodlanmış ve kloroplast sitozol üzerinden içine alınan. Böylece, uygun alma veya bu çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler kloroplast için hedefleme kloroplast yanı sıra bitki hücre düzgün çalışması için gereklidir. Çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler belirli kloroplast için hedefleme için sinyal sıraları içerir. Moleküler makine kloroplast veya sitozol lokalize bu sinyalleri tanımak ve alma işlemi taşımak. Protein alma veya kloroplast içinde vivoiçin hedefleme mekanizmaları araştırmak için Arabidopsis kloroplast protein içe aktarma işlemi çözümlemek için bir hızlı, verimli protoplast tabanlı yöntemi geliştirdi. Bu yöntemde, Arabidopsisyaprak dokulardan izole önceki kullanın. Burada, biz tarafından proteinler kloroplast alındığı mekanizması araştırmak için önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kloroplast tesislerinde en önemli organelleri biridir. Kloroplast ana işlevleri fotosentez1taşımak için biridir. Kloroplast da yağ asitleri, amino asitler, nükleotit ve çok sayıda sekonder metabolitler1,2üretimi için birçok biyokimyasal reaksiyonlar yürütmek. Tüm bu tepkiler, proteinlerin farklı türleri, çok sayıda kloroplast gerektirir. Ancak, kloroplast genom sadece yaklaşık 100 gen3,4içerir. Bu nedenle, kloroplast onların proteinler çoğunluğu sitozol almanız gerekir. Aslında, çoğu kloroplast proteinler sitozol çeviri4,5,6sonra alınmak üzere gösterilmiştir. Bitki hücreleri proteinler sitozol kloroplast için almak için belirli mekanizmaları gerektirir. Her ne kadar son birkaç yıldır bu protein alma mekanizmaları araştırdık, ancak, biz hala tam olarak onları moleküler düzeyde anlamıyorum. Burada, biz önceki hazırlanması ve exogenously önceki genlerinde ifade için detaylı bir yöntem sağlar. Bu yöntem protein alma kloroplast ayrıntılı içine temel moleküler mekanizmaları elucidating için değerli olabilir.

Protein alma birçok farklı yaklaşımlar kullanarak okudu olabilir. Bu yöntemlerden birini vitro protein alma sistem7,8kullanımını gerektirir. Bu yaklaşım, vitro-çevrilmiş protein öncüleri arıtılmış kloroplast vitroile inkübe ve protein alma tarafından SDS-sayfası western blot Analizi tarafından takip analiz edilebilir. Bu yaklaşımın avantajı olduğunu protein alma her adım kloroplast içine ayrıntılı olarak incelenecektir. Bu nedenle, bu yöntem yaygın protein alma moleküler makine bileşenleri tanımlamak için ve sırası bilgi için transit peptidler incelemek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, başka bir yaklaşım önceki yaprak dokuları üzerinden kullanımını içeren geliştirilmiş ve yaygın olarak protein alma kloroplast9,10içine eğitim için kullanılır hale. Bu yaklaşımın avantajı önceki vitro sistemi daha sağlam hücreleri olan yakın bir hücresel ortamı sağlamaktır. Böylece, protoplast sistem bize bu işlem, ilişkili sitozolik olaylar ve sinyalleri hedefleme özgüllüğü belirleme gibi birçok ek yönlerini ele sağlar. Burada, protein ithal etmek içine kloroplast çalışmaya önceki kullanımı için detaylı bir protokol mevcut.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Arabidopsis bitkilerin büyüme

  1. 1 L Gamborg B5 hazırlamak B5 orta 3.2 g ekleyerek (B5) orta vitaminler, 20 g sükroz, yaklaşık 800 ml deiyonize su 2-(N-morpholino) etan sülfonik asit (MES) 0.5 g de dahil olmak üzere ve pH 5.7 ile potasyum hidroksit (KOH) için ayarlayın. Ekle daha deiyonize su getir toplam hacim 1 L. eklemek 8 g phytoagar ve otoklav 121 ° C'de 15 dakika için
  2. Aşağı 55 ° C serin ve temiz bir Bank, Petri kabına (9 cm çapında, yüksekliği 1,5 cm) içine B5 orta 20 – 25 mL dökün orta izin. Tabak 2 – 3 gün kuru, temiz film ile onları paketi ve onları kadar kullanmak bir buzdolabında saklayın.
  3. Arabidopsis thaliana sterilize 1 mL % 70 (v/v) etanol içinde 2-3 dk. için sürekli sallayarak bir santrifüj tüpü (e-tüp) ile tohum süpernatant kaldırmak, 1 mL %1 (v/v) sodyum hipoklorit çözeltisi ekleyin ve sürekli olarak 2-3 dk. için sallamak hazırlamak 100 -150 tohumu Petri kabına başına.
    1. Supernatants kaldırmak ve tohumlar 1 mL distile su ile yıkayın. 4 x bu adımı yineleyin. Steril tohum tohum çimlenme eşitlemek 3 gün boyunca 4 ° C'de yerleştirin.
  4. Bir micropipette kullanarak B5 plakalar üzerine 100 – 150 tohumları ekmek ve cerrahi bant ile plaka mühür.
  5. 2 hafta boyunca 100 µmol·m-2·s-1 ışık şiddeti, %70 bağıl nem ve 20 ° C sıcaklık 16 h/8 h açık/koyu döngüsü ile bir büyüme odada bitkiler büyümek.

2. plazmid hazırlanması

Not: Dönüşüm için yüksek saflıkta plazmid kullanılmalıdır; bir ticari plazmid arıtma kiti kullanılması önerilir.

  1. Plazmid arındırmak (RbcS-nt:GFP) bir DNA izolasyon kit kullanarak. DNA konsantre için etanol yağış bir 1,5 mL tüp içinde gerçekleştirmek ve DNA Pelet 100 µL distile su içinde çözülür. Bir spektrofotometre 260 kullanarak plazmid konsantrasyonu belirlemek nm. Plazmid son bir konsantrasyon için seyreltik ~ 2 µg / µL. tutmak plazmid-20 ° C kadar kullanmak.

3. önceki yalıtım

  1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
    1. % 0.25 (w/v) macerozyme, %1.0 (w/v) cellulase, 400 mM D-mannitol, 8 mM kalsiyum klorür (CaCl2), % 0,1 (w/v) Sığır serum albumin (BSA), içermesi için enzim çözüm hazırlamak ve 5 mM MES. KOH ile 5.6 pH ayarlayın.
      1. Selüloz asetat filtre ünitesi ile 0,45 mikron gözenek boyutu kullanarak enzim çözüm filtre. 50 mL konik boru ve tutmak-20 ° C'de enzim çözümde aliquot 25 mL Oda sıcaklığında (RT) enzim çözüm çözülme ve de sadece kullanmadan önce karıştırın.
    2. % 21 (w/v) sükroz çözüm 21 g sükroz 100 ml deiyonize su ve basınçlı kap çözülerek çözüm hazırlamak.
    3. 154 mM sodyum klorür (NaCl), 125 mM CaCl2, 5 mM potasyum klorür (KCl), 5 mM glikoz ve 1.5 mM MES içermesi için W5 çözüm hazırlamak. 5.6 KOH ve otoklav çözüm pH ayarlayın.
    4. 400 mM D-mannitol, 15 mM magnezyum klorür (MgCl2), içermesi için MaMg çözüm hazırlamak ve 5 mM MES. 5.6 KOH ve otoklav çözüm pH ayarlayın.
    5. PEG çözüm yapmak için 1 M D-mannitol ve 1 M Kalsiyum nitrat hisse senedi çözümleri hazırlayın. Otoklav bu çözümler.
  2. Hasat 2 hafta yıllık bitkilerden dokulardan sağlam yaprak ~ 1-2 B5 plakaları bir cerrahi bıçak ve yer kullanarak hasat yapraklarını içine 50 mL konik enzim çözüm içeren 25 mL tüp. Yatay olarak döner bir shaker içinde belgili tanımlık karanlık nazik ajitasyon ile enzim çözüm ve yaprak dokuları içeren konik tüp yerleştirin. 8 – 12 h yaprak dokuların tam sindirim için alır.
  3. 8 – 12 h kuluçka sonra (yaprak dokulardan yayımlanan önceki içeren) enzim çözüm 140 µm gözenek boyutu ile bir kafes ile taze bir petri içine dökün. Dikkatle protoplast içeren enzim çözüm 15 mL % 21 (w/v) sükroz çözeltisi üzerine katman ve 98 x g 10 dk bir sallanan-kova rotor en düşük hızlanma ve yavaşlama ayarları için de santrifüj kapasitesi.
  4. Pasteur pipet kullanarak, özenle önceki en üst katmanı (enzim çözüm) arayüz enzim çözüm ve sukroz çözüm arasında bir 50 mL konik tüp 30 mL W5 çözeltisi içeren transfer. Bu tüp 51 x g 6 dk, santrifüj kapasitesi. Bu aşamada, önceki Pelet konik tüp alt olacak.
  5. Özenle önceki Pelet bozmadan bir pipet kullanarak süpernatant atmak. 25 mL W5 çözeltisi ekleyin ve hafifçe önceki resuspend. Protoplast çözüm 4 ° C buzdolabında en az 1 h için istikrar için kuluçkaya.

4. Polietilen glikol kullanarak protoplast dönüştürme

  1. % 40 hazırlamak PEG çözüm PEG 8000 in 4 g, 1 M mannitol çözüm 4 mL, 1 mL 1 M Ca (NO3)2ve 1,8 mL distile su 50 mL konik tüp içine ekleyerek ve iyice karıştırın. PEG bir mikrodalga fırında 20-30 s. yer için % 40 Isıtma tarafından dağıtılması aşağı soğutma için RT PEG çözüm.
    Not: PEG çözüm her zaman taze hazırlanmalıdır % 40. Eğer önceki tamamen buzdolabında 4 ° C kuluçka sırasında pelleted değil, 46 x g de malzeme için 2 dk santrifüj kapasitesi.
  2. Süpernatant dikkatle ama tamamen kaldırmak ve MaMg çözüm konsantrasyonu 5 x 106/mL vermeye protoplast Pelet ekleyin.
    Not: Mikroskop altında görüntülenen bir hemasitometre tarafından işgal sayısı belirlenebilir.
  3. Plazmid DNA her boş 13 mL yer 10 µg yuvarlak-tüp alt ve 300 µL protoplast çözüm bir pipet kullanarak ekleyin.
    Not: Pipet ucu sonu kesilmelidir. Önceki örnek zaman protoplast içeren çözüm önceki aynı sayıda her tüpün eklenir böylece şu pipetting önce resuspended.
  4. Plazmid DNA tüpler hafifçe döndürerek önceki ile karıştırın ve hemen 300 µL % 40 eklemek bir pipet kullanarak PEG çözüm. Yavaşça ama tamamen tüpler döndürerek mix ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya; Tüp neredeyse Yatay eğimli ve defalarca döndürün.
  5. 1 mL W5 çözeltisi ekleyip yavaşça ama tamamen tüp el ile benzer bir şekilde döndürerek karıştırın. Örnek oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
  6. İki kez daha 1,5 mL ve 2 mL W5 çözeltisi, sırasıyla kullanarak bu adımı yineleyin. İçin 30 dk W5 çözüm son eklenmesinden sonra kuluçkaya.
  7. 46 x g 4 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve 2 mL W5 çözeltisi ekleyin. Yavaşça ama tamamen karıştırın. Bir Karanlık Oda 22 ° C'de kuluçkaya.

5. Protein ithal etmek içine kloroplast Analizi

Not: PEG aracılı dönüşümü önceki, kuluçka süresi aralığından 8 24 saat sonra.

  1. Floresans mikroskobu
    1. Yer 10 µL bir pipet ile kesilmiş bir uç ve dikkatli bir şekilde kullanarak slayt camına protoplast çözümünün önceki zarar görmesini önlemek için coverslip ile kapak.
    2. Yer uyarma/emisyon filtre ile donatılmış bir floresan mikroskop aşaması slaytta yeşil flüoresan protein (GFP) ve klorofil auto-floresan gözlemlemek için ayarlar.
    3. Esir alma imge ile soğutmalı şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera ve işlem görüntüleri sahte renk görüntüler üretmek için bir görüntü düzenleme yazılımı kullanarak.
  2. Toplam Protein çıkarma ve Immunoblotting
    1. Denatürasyon arabellek % 2.5 (w/v) sodyum dodecylsulfate (SDS) ve %2 (v/v) 2-mercaptoethanol içeren hazır olun.
      Not: Protein alma kloroplast içine anti-GFP antikor kullanarak üzerinden immunoblot analysis işleme transit peptid derecesini ölçerek sayısal.
    2. Önceki bir santrifüj tüpü ve 4 dk 46 x g, santrifüj içine aktarın.
    3. Süpernatant kaldırın ve 80 µL denatürasyon arabelleği ekleyin. 5 için şiddetle girdap s ve SDS örnek arabellek (250 mM Tris-Cl (pH 6.8), 0,5 M DTT, % 10 (w/v) SDS, %0.05 (w/v) Bromophenol mavi ve % 50 (v/v) gliserol) x 5 ekleyin. Mix iyi ve 10 dakika kaynatın.
    4. Bu protein örnek standart SDS-sayfa ve anti-GFP antikor ile immunoblotting tabi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İçe aktarma işlemi proteinlerin kloroplast iki yaklaşım kullanılarak incelenebilir: floresans mikroskobu ve immunoblot analizden sonra SDS-sayfa-aracılı ayırma. Burada, biz RbcS kullanılır-nt:GFP, bir füzyon oluşturmak için GFP erimiş transit peptid içeren RbcS 79 N-terminal amino asit kalıntıları kodlama. Proteinler kloroplast alındığında, yeşil floresans hedef protein RbcS sinyalleri-nt:GFP birleştirme ile klorofil auto-floresan, gelen kırmızı floresan sinyallerini floresans mikroskobu ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz protein ithal etmek içine kloroplast çalışmaya Arabidopsis önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağladı. Bu protein alma işlemi soruşturma için güçlü bir yöntemdir. Bu basit, çok yönlü teknik kloroplast için amaçlanan kargo proteinlerin hedefleme incelenmesi için yararlıdır. Bu yöntemi kullanarak, önceki yaprak dokuları tam olgun yaprakları çok erken arasında değişen birçok farklı büyüme aşamalarında bitkilerden elde Arabidopsis11,12 h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser kooperatif araştırma programı destekler ile tarım bilim ve teknoloji geliştirme (Proje No için yapılmıştır PJ010953012018), Kırsal Kalkınma İdaresi ve ICT (No. 2016R1E1A1A02922014) ve Bilim Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı (Kore) hibe Kore.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
VİTAMİNLER İÇEREN GAMBORG B5 ORTAMIDuchefa BiochemieG0210.0050
SUCROSEDuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHYDRATDuchefa BiochemieM1503.0250
Agar, tozJUNSEI24440S1201
Mikro gözenek Cerrahi bant3M1530-0
Cerrahi bıçak paslanmaz No.10FEATHERKullanılamayan
Konik Tüp, 50mlSPL YAŞAM BİLİMLERİ50050
Makrozyme R-10YAKULT İLAÇ SANAYİ LTD. ŞTİ.Kullanılamayan
Selülaz ONOZUKA R-10YAKULT İLAÇ SANAYİ VE TİCARET SANAYİKullanılamıyor
ALBÜMIN, SIĞIR (BSA)VWR0332-100G
D-MANNITOLSIGMAM1902-1KG
KALSİYUM KLORÜR, DİHİDRATMP BİYOMEDİKAL0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
CD-1 için ekran kapağıSIGMAS1145
CD-1 için EkranlarSIGMAS3895
Petri KabıSPL YAŞAM BİLİMLERİ10090
Pastör pipetiHILGENBERG3150102
LABORATUVAR SANTRİFÜJ / TEZGAH ÜSTÜVİZYON BİLİMSELVS-5500N
Sodyum klorürJUNSEI19015S0350
Potasyum klorürSIGMAP3911-1KG
D-GLIKOZ, SUSUZBIO BASICGB0219
Potasyum HidroksitDUKSAN40
Kalsiyum nitrat tetrahidratSIGMAC2786-500G
Poli (etilen glikol)SIGMAP2139-2KG
Magnezyum klorür hekzahidratSIGMAM2393-500G
Tüp 13ml, 100x16mm, PPSARSTEDT55.515
Mikroskop slaytlarıMARIENFELD1000412
Mikroskop Kapak CamlarıMARIENFELD101030
Sayma HaznesiMARIENFELD650030
Axioplan 2 Görüntüleme MikroskobuCarl ZeissKullanılamıyor
Mikro tüp 1.5mlSARSTEDT72.690.001
2- MerkaptoetanolSIGMAM3148-250ML
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS), Proteomik SınıfVWRM107-500G
TRIS, Ultra Saf SınıfVWR0497-5KG
DTT (DL-Ditiyotreitol), Biyoteknoloji SınıfıVWR0281-25G
Bromofenol mavi sodyum tuzu ACSVWR0312-50G
GliserolJUNSEI27210S0350
Canlı Renkler AV Monoklonal Antikor (JL-8)TAKARA632381

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
  4. Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
  5. Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
  6. Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
  7. Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
  8. Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
  9. Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
  10. Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
  11. Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
  12. Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
  13. Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
  14. Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
  15. Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
  16. Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein Import ChloroplastsProtoplast IsolationFluorescence MicroscopyImmunoblotting AnalysisChloroplast Protein TargetingArabidopsis ProtoplastsProtein Import AssayGFP Fusion ProteinCentrifugation ProtocolsSucrose Gradient

İlgili makaleler