Burada PEG aracılı dönüşüm yöntemi kullanarak önceki proteinler ifade için bir protokol açıklayın. Kolay ifade ilgi protein ve protein yerelleştirme ve çeşitli deneysel koşullar için alma işlemini verimli soruşturma yöntemdir içinde vivo.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi
Bu makalede
Özet
Özet
Kloroplast bitkilerde fotosentez ve birçok sekonder metabolitler ve lipidler üretimi gibi çeşitli hücresel süreçler sorumlu bir önemli organel olduğunu. Kloroplast proteinler, çok sayıda bu çeşitli fizyolojik işlemlerini gerçekleştirmek için gerekir. Üzerinde kloroplast proteinlerin % 95'i sitozolik ribozomlara çeviri sonra çekirdek kodlanmış ve kloroplast sitozol üzerinden içine alınan. Böylece, uygun alma veya bu çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler kloroplast için hedefleme kloroplast yanı sıra bitki hücre düzgün çalışması için gereklidir. Çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler belirli kloroplast için hedefleme için sinyal sıraları içerir. Moleküler makine kloroplast veya sitozol lokalize bu sinyalleri tanımak ve alma işlemi taşımak. Protein alma veya kloroplast içinde vivoiçin hedefleme mekanizmaları araştırmak için Arabidopsis kloroplast protein içe aktarma işlemi çözümlemek için bir hızlı, verimli protoplast tabanlı yöntemi geliştirdi. Bu yöntemde, Arabidopsisyaprak dokulardan izole önceki kullanın. Burada, biz tarafından proteinler kloroplast alındığı mekanizması araştırmak için önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağlar.
Giriş
Kloroplast tesislerinde en önemli organelleri biridir. Kloroplast ana işlevleri fotosentez1taşımak için biridir. Kloroplast da yağ asitleri, amino asitler, nükleotit ve çok sayıda sekonder metabolitler1,2üretimi için birçok biyokimyasal reaksiyonlar yürütmek. Tüm bu tepkiler, proteinlerin farklı türleri, çok sayıda kloroplast gerektirir. Ancak, kloroplast genom sadece yaklaşık 100 gen3,4içerir. Bu nedenle, kloroplast onların proteinler çoğunluğu sitozol almanız gerekir. Aslında, çoğu kloroplast proteinler sitozol çeviri
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Arabidopsis bitkilerin büyüme
- 1 L Gamborg B5 hazırlamak B5 orta 3.2 g ekleyerek (B5) orta vitaminler, 20 g sükroz, yaklaşık 800 ml deiyonize su 2-(N-morpholino) etan sülfonik asit (MES) 0.5 g de dahil olmak üzere ve pH 5.7 ile potasyum hidroksit (KOH) için ayarlayın. Ekle daha deiyonize su getir toplam hacim 1 L. eklemek 8 g phytoagar ve otoklav 121 ° C'de 15 dakika için
- Aşağı 55 ° C serin ve temiz bir Bank, Petri kabına (9 cm çapında, yüksekliği 1,5 cm) içine B5 orta 20 – 25 mL dökün orta izin. Tabak 2 – 3 gün kuru, temiz film ile onları paketi ve onları kadar kullanmak bir buzdolabında saklayın.
- Arabidopsis thaliana steriliz....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İçe aktarma işlemi proteinlerin kloroplast iki yaklaşım kullanılarak incelenebilir: floresans mikroskobu ve immunoblot analizden sonra SDS-sayfa-aracılı ayırma. Burada, biz RbcS kullanılır-nt:GFP, bir füzyon oluşturmak için GFP erimiş transit peptid içeren RbcS 79 N-terminal amino asit kalıntıları kodlama. Proteinler kloroplast alındığında, yeşil floresans hedef protein RbcS sinyalleri-nt:GFP birleştirme ile klorofil auto-floresan, gelen kırmızı floresan sinyallerini floresans mikroskobu .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz protein ithal etmek içine kloroplast çalışmaya Arabidopsis önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağladı. Bu protein alma işlemi soruşturma için güçlü bir yöntemdir. Bu basit, çok yönlü teknik kloroplast için amaçlanan kargo proteinlerin hedefleme incelenmesi için yararlıdır. Bu yöntemi kullanarak, önceki yaprak dokuları tam olgun yaprakları çok erken arasında değişen birçok farklı büyüme aşamalarında bitkilerden elde Arabidopsis11,12 h.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser kooperatif araştırma programı destekler ile tarım bilim ve teknoloji geliştirme (Proje No için yapılmıştır PJ010953012018), Kırsal Kalkınma İdaresi ve ICT (No. 2016R1E1A1A02922014) ve Bilim Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı (Kore) hibe Kore.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| VİTAMİNLER İÇEREN GAMBORG B5 ORTAMI | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRAT | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, toz | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Mikro gözenek Cerrahi bant | 3M | 1530-0 | |
| Cerrahi bıçak paslanmaz No.10 | FEATHER | Kullanılamayan | |
| Konik Tüp, 50ml | SPL YAŞAM BİLİMLERİ | 50050 | |
| Makrozyme R-10 | YAKULT İLAÇ SANAYİ LTD. ŞTİ. | Kullanılamayan | |
| Selülaz ONOZUKA R-10 | YAKULT İLAÇ SANAYİ VE TİCARET SANAYİ | Kullanılamıyor | |
| ALBÜMIN, SIĞIR (BSA)VWR | 0332-100G | ||
| D-MANNITOL | SIGMA | M1902-1KG | |
| KALSİYUM KLORÜR, DİHİDRAT | MP BİYOMEDİKAL | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| CD-1 için ekran kapağı | SIGMA | S1145 | |
| CD-1 için Ekranlar | SIGMA | S3895 | |
| Petri Kabı | SPL YAŞAM BİLİMLERİ | 10090 | |
| Pastör pipeti | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATUVAR SANTRİFÜJ / TEZGAH ÜSTÜ | VİZYON BİLİMSEL | VS-5500N | |
| Sodyum klorür | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potasyum klorür | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLIKOZ, SUSUZ | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potasyum Hidroksit | DUKSAN | 40 | |
| Kalsiyum nitrat tetrahidrat | SIGMA | C2786-500G | |
| Poli (etilen glikol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnezyum klorür hekzahidrat | SIGMA | M2393-500G | |
| Tüp 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Mikroskop slaytları | MARIENFELD | 1000412 | |
| Mikroskop Kapak Camları | MARIENFELD | 101030 | |
| Sayma Haznesi | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Görüntüleme Mikroskobu | Carl Zeiss | Kullanılamıyor | |
| Mikro tüp 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2- Merkaptoetanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodyum Dodesil Sülfat (SDS), Proteomik Sınıf | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Saf Sınıf | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Ditiyotreitol), Biyoteknoloji Sınıfı | VWR | 0281-25G | |
| Bromofenol mavi sodyum tuzu ACS | VWR | 0312-50G | |
| Gliserol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Canlı Renkler AV Monoklonal Antikor (JL-8) | TAKARA | 632381 |
Kaynaklar
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
