Yöntem makalesi

Burun beyin ilaç dağıtım değerlendirmek için inhalasyon anestezi altında burunici yönetim için yeni Yöntemler

DOI:

10.3791/58485

⸱

14 Kasım 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Nihon University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, deneysel hayvan için kararlı burunici Yönetimi'nin altında inhalasyon anestezi en az fiziksel stres ile iki roman yöntemleri açıklanmaktadır. Biz de beyin radiolabeled [14C] kullanarak burun beyin yolu üzerinden ilaç dağıtım seviyelerinde kantitatif değerlendirilmesi için bir yöntem tarif-suda çözünen oluştururlar, bir modeli substrat olarak inulin.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etkilerinin yönetim terapötik ajanlar, kan - beyin bariyerini circumvents burun beyin teslimi için olası bir yol olarak bildirilmiştir. Ancak, kantitatif analiz hem de en iyi yönetim koşulları ile ilgili olarak ve rejimleri araştırmalar burun beyin teslimat için dozaj kaç rapor edilmiştir. Kemirgenler kullanarak burun beyin yolu mekanizmaları üzerinde araştırma sınırlı sürüyor burun beyin vasıtalarının aday ilaçlar için tasarlama açısından önemli bir engeli temsil eder.

Bu konuda biraz ilerleme kazanmak için geliştirilen ve istikrarlı burunici yönetim inhalasyon anestezi altında iki yeni yöntem için deneysel hayvan değerlendirilir. Biz aynı zamanda radyo etiketli [14C] kullanarak burun beyin yolu üzerinden beyin ilaç dağıtım seviyelerinde değerlendirilmesi için bir yöntem tarif-inulin (Moleküler ağırlığı: 5.000) suda çözünen oluştururlar, bir modeli substrat olarak.

Başlangıçta, biz hayvanlara istikrarlı anestezi altında güvenilir yönetim gerçekleştirmek için bize etkin geçici olarak açılabilir maske kullanan bir pipet-tabanlı burunici Yönetim Protokolü geliştirilmiştir. Bu sistemle, [14C]-inulin beyne az deneysel hata ile teslim.

Daha sonra mucociliary izni (MC) etkilerini en aza indirmek için geliştirilmiştir yemek borusu yoluyla hava yolu taraftan ters cannulation gerektiren bir burunici Yönetim Protokolü geliştirdik. Bu teknik yol açtı [14C] anlamlı olarak daha yüksek düzeylere-inulin, kantitatif olfaktör ampul, cerebrum ve soğanı, pipet yöntemi daha tespit edildi. Bu saklama burun boşluğunda uyuşturucu çözümün önemli ölçüde MC bir yönün nazal kavite içine şırınga pompa kullanarak etkin yönetim tarafından artış olmuştur çünkü gibi görünüyor.

Sonuç olarak, bu çalışmada geliştirilen burunici yönetiminin iki yöntem farmakokinetik Rodents değerlendirmek için son derece yararlı teknikleri beklenebilir. Ters cannulation yöntemi, özellikle burun beyin teslim ilaç adaylarının tam potansiyelini değerlendirmek için yararlı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptidler, oligonucleotides ve antikorlar gibi biomedicines Şu anda hiçbir iyileştirici tedavi var ateşe dayanıklı merkezi sinir sistemi bozuklukları için yeni tedavi ajanı olarak potansiyel uygulama için kabul edilir. Ancak, çoğu biomedicines suda çözünen oluştururlar olduğundan, intravenöz veya sözlü yönetimi ile beyin içine kandan teslimat kan - beyin bariyerini (BBB) empedans nedeniyle son derece zor olur.

Son yıllarda, burunici yönetim BBB1,2,3,4,5önler terapötik ajanlar, burun beyin teslimi için olası bir yol olarak bildirilmiştir. Ancak, kantitatif analiz burun beyin yolu teslim6ile ilgili görece az sayıda rapor edilmiştir. Ayrıca, hemen hemen hiçbir rapor kurulan en uygun yönetim koşulları ve birimi gibi dozaj rejimleri edilmiştir kez, zaman dönemleri ve hız, burun beyin teslim araştırmalar için. Yukarıda belirtilen eksiklikleri için aşağıdaki nedenlerden atfedilen: etkilerinin Yönetim (i) bir en iyi yöntem fareler için kurulacak henüz ve (ii) etkilerinin yönetim pipetting tarafından genel olarak kullanılan, genellikle karakterize mucociliary izni (MC) nedeniyle hayvanlar arasında görülmemelidir varyasyon tarafından böylece sık sık belirli bir ilacın gerçek burun beyin teslim potansiyel underestimations için önde gelen.

İnhalasyon anestezi isoflurane kullanarak (başlatma: %4, bakım: % 2) ile bir inhalasyon kemirgen için maske azaltılması amacı ile yaygın kullanımı kazanmıştır veya cerrahi ile ilişkili ağrı ortadan kaldırarak gerçekleştirilen deneysel hayvanlar üzerinde. Maskelerinin kullanımı nispeten basit tipik ilaç idaresi deneysel hayvan subkutan, mayi ve intravenöz yolları üzerinden inhalasyon anestezi altında gerçekleştirmek yapar. Ancak, burunici yönetimi söz konusu olduğunda, maskeyi geçici olarak ilaç idaresi için hayvanlardan kaldırılması gerekir. Bakım altında %2 ile isoflurane, hayvanlar genellikle uyandırmak hızla inhalasyon anestezi. Yönetim birim doz başına büyük olduğunda, bu yemek borusu içine burun boşluğundan akmaya uyuşturucu çözüm neden olabilir ve bu nedenle tek bir büyük doz küçük burunici yönetim için birden çok daha küçük dozlarda içine bozuk aşağı gerekebilir hayvanlar. Yinelenen yönetim için maske kaldırma ve sürekli burun boşluğuna teslimat için yeterli süre burunici yönetim gerektirir olduğu fareler anesteziden yönetim işlemi sırasında uyandırmak yüksek bir olasılık. Bu çok zor burunici Yönetimi'nin altında istikrarlı bir anestezik durumu gerçekleştirmek yapar ve muhtemelen burun beyin teslimat kemirgenler arasında gözlenen görülmemelidir değişimine katkıda bulunur.

Bu çalışmada, bu nedenle en az fiziksel stres deneysel hayvanlar üzerinde empoze iki roman yöntemi, istikrarlı burunici Yönetimi'nin altında inhalasyon anestezi, geliştirdi. Birinci yontem için biz burunici yönetimi inhalasyon anestezi sırasında sağlayan geçici olarak açılabilir maske kullanılır. Maskeyi açılabilir parçası yönetim zamanlama uyarınca bir pipet kullanarak kararlı burunici yönetimini kolaylaştırmak için kullanılan bir silikon tak içermektedir. İkinci yöntem için bir kanül cerrahi burun boşluğuna yemek borusu geçmek eklenmiş ve böylece ilaç çözüm doğrudan ve güvenli bir biçimde istikrarlı inhalasyon altında nazal kavite içine teslim bir şırınga pompa sonra buna bağlıydı anestezi. Önemli ölçüde MC etkilerini en aza indirerek, uyuşturucu retentively burun boşluğunda geliştirilmiş olacaktır çünkü bu yöntem uyuşturucu teslim burun beyin rota üzerinden beyin içine geliştirebilirsiniz. Buna ek olarak, uyuşturucu dağıtım düzeyleri (% enjekte doz/g beyin için) radyo etiketli [14C] kullanarak beyin kantitatif değerlendirilmesi için bir yöntemi açıklamak-inulin [molekül ağırlığı (MW): 5.000], suda çözünen bir modeli substrat olarak oluştururlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu hayvan çalışma (#AP17P004) Nihon Üniversitesi hayvan bakım ve kullanım Komitesi (Tokyo, Japonya) tarafından onaylanmış yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışmada (#17-0001) Nihon Üniversitesi Eczacılık Okulu radyoizotop Merkezi tarafından kabul edildi.

1. hayvanlar inhalasyon anestezi altında burunici yönetim için kullanılan

  1. Deneysel fareler altında 12-h açık/koyu döngüsü (ışık üzerinde saat 8 ' de – 8:00 arası), paslanmaz çelik kafeslerde tutulan 23 ± 1 ° C, nem % 50 ± % 10 ve gıda ve su ad libitum erişim, kontrollü bir sıcaklık ile ev.
  2. Deneme önce fareler % 2 isoflurane, % 4'lük bir konsantrasyon aşağıdaki başlangıcında inhalasyon yolu ile anestezi. Anesthetization gerekli düzeyde yüzey keşfetmiş kaybolması için kontrol ederek onaylayın.

2. yönetim çözümü hazırlanması

  1. Bir yönetim çözümü [14C] hazırlamak-fosfat tamponlu tuz çözeltisi içinde sulandrarak tarafından inulin (50 mikron, fare başına 0.5 μCi/mL) ve 4 ° C'de kadar kullanmak.

3. burunici idareleri fareler için

  1. Geçici olarak açılabilir solunum maskesi kullanarak micropipette Yöntem (resim 1)
    Not: Bu teknik Frey ve ark. tarafından kurulan bir micropipette etkilerinin yönetim iletişim kuralı'nı bir değişiklik olduğunu. 3
    1. Fareler üzerinde bir corkboard sırtüstü pozisyonda onların bacaklarda % 2 isoflurane (Şekil 1A) ile inhalasyon anestezi altında taping tarafından tamir et.
    2. Toplam hacmi 25-μL yönetim çözümü için her fare fareler inhalasyon anestezi altında (Şekil 1B ve C) sabit iken alternatif olarak sol ve sağ burun deliklerin 1-2 μL dozlar ile 30-s aralıklarla yönetmek.
    3. Not: atık anestezik gaz maskesi açıldığında ve pasif yolla (atık anestezik gaz Canister) (duman hood, zor kanallı Biyogüvenlik kabini, vakum, vb) etkin yöntemlerle yaşlandırma ne zaman yumuk
  2. Cannulation ters m yemek borusu yoluyla hava yolu taraftan alınan (Şekil 2)
    Not: Bu teknik etkilerinin emme protokolü için rats Takoyakushi vd tarafından kurulan bir değişiklik olduğunu. 7
    1. Fareler üzerinde bir corkboard sırtüstü pozisyonda onların bacaklarda % 2 isoflurane ile inhalasyon anestezi altında taping tarafından tamir et.
    2. Boyun saç tıraş ve bir alkol durulama tarafından takip betadin veya klorheksidin uygulaması aracılığıyla hazırlandı.
    3. Trakea ve yemek borusu küçük bir insizyon attım (1.5 cm) yaptıktan sonra forseps ile cilt altındaki boğaz genişleterek makasla ortaya çıkarmak.
    4. Bir kesik (1 mm) makas kullanarak borusunda olun.
    5. Bir kanül Ekle (iç çapı: 0,58 mm, dış çap: 0.965 mm) için 1.2 cm uzunluğunda ve solunum maskesi iç kanül karşı tarafındaki diğer ucuna iliştirin.
    6. Makas kullanarak borusunda bir kesi (1 mm) yapmak, bir kanül Ekle (iç çapı: 0,28 mm, dış çapı: 0,61 mm) için doğru burun boşluğuna arka kısmı 1.4 cm uzunluğunda ve (Şekil 2A ve B) ligate.
      Not: Yordamlar 3.2.2-3.2.4 × 10 büyütmede stereoskopik mikroskop altında yapılmıştır.
    7. Bir iğne (27G × 1/2) bir yönetim çözümü ile dolu bir 1-mL şırınga ekleyin ve programlanabilir bir mikro-şırınga pompa bağlayın.
    8. Yukarıda 3.2.5 (Şekil 2C), yemek borusu içine eklenen kanül iğneye takın.
    9. 25 μL [14C] toplam hacmi yönetmek-inulin çözüm sabit bir hızda (5 μL/dk) (Şekil 2C ve 2D).

4. kantitatif deney suda çözünen oluştururlar radyo etiketli kullanarak ([14C]-inulin)

  1. Anestezi altında deneysel fareler başını kesmek ve beyni zarar vermemesi için bakım sırasında makas kullanarak kendi craniums ve medulla oblongata tarafındaki açın.
  2. Dikkatle tüm beyin kafatası üzerinden bir mikro spatula kullanarak scooping ayıklayın.
  3. Yer bir filtre kağıdı üzerinde buz üzerinde depolanan bir petri serum fizyolojik solüsyonu ile nemlendirilmiş.
  4. Ayıklanan beyin üzerinde ıslatılmış Süzgeç kağıdı yerleştirin.
  5. En az [14C] etkisini ortadan kaldırmak için tuzlu çözüm ile ıslatılmış bir pamuk bez ile beyin yüzeyine kalarak kan yok etmek-inulin kan beyin yüzeyinde.
  6. Beyin hızla incelemek ve onları üç parçaya bölün: olfaktör ampul, cerebrum ve soğanı (pons dahil).
  7. Beyin örnekleri doku solubilizer 50 ° c için 1 h yerleştirin.
  8. Sıvı mercek kokteyl 10 μL beyin örnekleri için ekleyin.
  9. 25 μL aliquot mercek uygulanan çözüm radyoaktivite belirlemek için bir mercek şişe kokteyl içinde çözünmüş yönetim çözümünün aktarın.
  10. Disintegrations [14C] dakika radyoaktivite beyin örnek başına ölçmek ([14C] Xbeyin) ve uygulanan çözüm ([14C]inç dozX) uygun bir ile donatılmış bir sıvı mercek Counter 3H ve 14C. Crossover Düzeltme

5. veri analizi

  1. Aşağıdaki denklemi kullanarak uyuşturucu dağıtım düzeyleri (%) enjekte doz (kimlik %) için Hesapla:
    ID % ⁄g beyin = ([14C] Xbeyin/ [14C]dozX) × 100,
    nerede Xbeyin (dpm/g beyin) [14C] miktarı - inulin ölçülen beyin dokusunda ve Xinç doz (dpm/25 μL çözüm) [14C] konsantrasyonu ise - inulin çözümde burunici yönetimi için kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 3 gösterir [14C]-inulin düzeyleri (kimlik % ⁄g beyin) olfaktör ampul (A), cerebrum (B) ve (C) mevcut çalışmada değerlendirildi burunici yönetim iki tür kullanılarak elde soğanı. Pipet etkin yöntem teslim [14C] kullanarak burunici yönetim-inulin açılabilir solunum maskeleri (Şekil 1) kullanarak beyin içine. İnhalasyon anestezi altında nicel sonuçlar deneysel görülmemelidir varyasyon eksikliği düşük stan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlaçlar burun beyin teslimini bu yolu BBB atlar bir doğrudan ulaşım yol gösterdiği için merkezi sinir sistemi bozuklukları üzerinde belirgin bir etkisi olması bekleniyor. Üç farklı burun beyin yolları tarihi8' e rapor edilmiştir. İlk Olfaktör mukoza burun mukozasında üzerinden ön için Olfaktör sinir geçer Olfaktör sinir yoludur. Ikinci solunum mukoza burun mukozasında üzerinden arka beyin, beyin sapı ile trigeminal sinir geçirir trigeminal sinir yoludur. Üçüncü Beyin bos üzerinden boyunca dağıtılı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kısmen özel üniversite araştırma marka projeden MEXT tarafından desteklenen; bir Grant-in-Aid bilim (JSP'ler); tanıtımı için Japonya toplumdan bilimsel Research (C) (17 K 08249 [için T.K. ve TS]) için bir hibe için [için T.K.] [için T.S.] Biyokimya ilerleme ve Takeda Bilim Vakfı için Hamaguchi temelden kooperatif araştırma. Biz Bay Yuya Nito ve Bayan Akiko Asami deneyler onların değerli teknik yardım için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ddY fareJaponya SLC, Inc.Erkek, 4-6 hafta, 20-30 g
İzofluranPfizerv002139
İzofluran kurulumuSHINANO imalat LTD. ŞTİ.SN-487-OTAir, SN-489-4
İzofluran maskesiSHINANO imalat LTD. ŞTİ.Küçük kemirgenler için
İzofluran maskesi (açılabilir tip)SHINANO manufacturing CO., LTD.Özel siparişler
Anestezi KutusuSHINANO imalat LTD. ŞTİ.SN-487-85-02
Hayvan deneyleri makası-1NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.B-27H
Hayvan deneyleri makası-2NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.B-13H
Cımbız-1GÜZEL BİLİM ALETLERİ A.Ş.11272-30Dumont #7 Dumoxel
Cımbız-2NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.A-12-1
Kanül tüpü (PE-50)Becton, Dickinson ve Şirketi.5069773İç Çap: 0.58 mm, Dış Çap: 0.965 mm
Kanül tüpü (SP-10)NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.KN-392İç Çap: 0.28 mm, Dış Çap: 0.61 mm
Tıraş MakinesiMARUKAN, LTD.DC-381
Stereoskopik mikroskopOlympus CorporationSZ61
İğne 27G 1/2 inç 13 mmTERUMO CORPORATIONNN-2738R
1 mL şırıngaTERUMO CORPORATIONSS-01T
Şırınga pompasıNörobilimNE-1000
Selüloz membranToyo Roshi Kaisya, Ltd.
Mikro spatulaShimizu Akira Inc.91-0088
Mikropipet (0,5-10 uL)Eppendorf AGZ368083
Pipet çipiEppendorf AG0030 000.811
BantTimeMed Etiketleme Sistemi, Inc.T-534-RFareyi sabitlemek için
[14< / sup>C] -İnülinAmerikan Radyoaktif Etiketli Kimyasallar A.Ş.ARC0124A0.1 mCi / mL
EtOHWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd.054-00461
Sıvı sintilasyon sayacıPerkin Elmer Yaşam ve Analitik Bilimler A.Ş.Tri-Carb 4810TR
00011090

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakane, T., Yamashita, S., Yata, N., Sezaki, H. Transnasal delivery of 5-fluorouracil to the brain in the rat. Journal of Drug Targeting. 7 (3), 233-240 (1999).
  2. Illum, L. Transport of drugs from the nasal cavity to the central nervous system. European Journal of Pharmaceutical Science. 11 (1), 1-18 (2000).
  3. Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery bypasses the blood-brain barrier to target therapeutic agents to the central nervous system and treat neurodegenerative disease. BMC Neuroscience. 9 (Suppl 3), S5(2008).
  4. Chapman, C. D., et al. Intranasal treatment of central nervous system dysfunction in humans. Pharmaceutical Research. 30 (10), 2475-2484 (2012).
  5. Kanazawa, T. Development of non-invasive drug delivery system to the brain for brain diseases therapy. Yakugaku-Zasshi. 138 (4), 443-450 (2018).
  6. Kozlovskaya, L., Abou-Kaoud, M., Stepensky, D. Quantitative analysis of drug delivery to the brain via nasal route. Journal of Controlled Release. 189, 133-140 (2014).
  7. Hirai, S., Yashiki, T., Matsuzawa, T., Mima, H. Absorption of drugs from the nasal mucosa of rat. International Journal of Pharmaceutics. 7 (4), 317-325 (1981).
  8. Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advances in Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2011).
  9. Lalatsa, A., Schatzlein, A. G., Stepensky, D. Strategies to deliver peptide drugs to the brain. Molecular Pharmaceutics. 11 (4), 1081-1093 (2014).
  10. Kanazawa, T. Brain delivery of small interfering ribonucleic acid and drugs through intranasal administration with nano-sized polymer micelles. Medical Devices. 8, 57-64 (2015).
  11. Kanazawa, T., et al. Enhancement of nose-to-brain delivery of hydrophilic macromolecules with stearate- or polyethylene glycol-modified arginine-rich peptide. International Journal of Pharmacology. 530 (1-2), 195-200 (2017).
  12. Kamei, N., et al. Effect of an enhanced nose-to-brain delivery of insulin on mild and progressive memory loss in the senescence-accelerated mouse. Molecular Pharmaceutics. 14 (3), 916-927 (2017).
  13. Suzuki, T., Oshimi, M., Tomono, K., Hanano, M., Watanabe, J. Investigation of transport mechanism of pentazocine across the blood-brain barrier using the in situ rat brain perfusion technique. Journal of Pharmaceutical Science. 91 (11), 2346-2353 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Burundan Beyne letimTers Kan lasyonRadyoetiketli n linBeyin Da l m AnaliziOlfakt r BulbSerebrumMedulla OblongataMukosiliyer Temizlik

İlgili makaleler