Yöntem makalesi

Birden çok kemirgen beyin aynı anda Cryosectioning

DOI:

10.3791/58513

⸱

18 Eylül 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Child Health, University of Arizona College of Medicine, 2Department of Biological Sciences, University of Bath, 3BARROW Neurological Institute at Phoenix Children's Hospital, 4Phoenix Veteran Affairs Healthcare System, 5Department of Basic Medical Sciences, University of Arizona College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, donma ve beyin dokusu birden çok hayvanlardan tek beyin işleme için zaman kazandıran bir alternatif olarak bölüm için bir protokol mevcut. Bu immünhistokimya sırasında boyama değişkenliği azaltır ve zaman cryosectioning ve görüntüleme azaltır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histoloji ve immünhistokimya mikroskopik anatomi görselleştirmek ve proteinlerin biyolojik doku içinde yerelleştirmek için analiz rutin yöntemleri vardır. Neuroscience, yanı sıra diğer bilimsel alanları bir bolluk, bu teknikleri kullanılır. İmmünhistokimya slayt monte doku veya serbest yüzer bölümleri üzerinde yapılabilir. Slayt monte numune hazırlama bir zaman yoğun bir süreçtir. Aşağıdaki protokol için Megabrain adında bir teknik cryosection ve mount beyin dokusu tek bir donmuş blok birden çok beyin birleştirerek 90 %'e kadar geçen süre azalır. Ayrıca, bu teknik turda büyük bir histochemical çalışma boyama arasında görülen değişkenliği azaltmak. Geçerli teknik kemirgen beyin dokusu içinde aşağı akım immunohistokimyasal analizleri kullanarak için optimize edilmiş; Ancak, cryosectioning kullanan farklı bilimsel alanlar için uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, iletişim kuralı için birden çok kemirgen aynı anda aşağı akım immunohistokimyasal yordamlar için beyin cryosection için geliştirilen Megabrain dediğimiz bir roman yöntemi mevcut. Tek slaytları içeren birden fazla hayvan dokudan üretimi için bir Megabrain sağlar. Bu teknik, aynı anda 9 yetişkin fare hemisferlerin veya 5 Yetişkin tam beyin, koronal bölümleri kesmek için en iyi duruma getirilmiş. Bu nedenle, en büyük immunohistokimyasal çalışmalar veya slayt monte beyin dokusu üzerinde hayvan büyük bir kohort yapılan diğer analizler uygulanabilir bir tekniktir.

İmmünhistokimya belirli antikor protein anlamak ve kendi ifade ve hücresel değişiklikler belirli doku1,2,3' te karakterize ilgi karşı kullanımını gerektirir. İmmünhistokimya kullanımı nörolojik araştırma, beyin4hücresel ve moleküler anlamada yardım diğer bilimsel disiplinler arasında yaygındır. Büyük ölçekli çalışmalar birçok hayvan ve beyin bölümleri içeren kaynak ve zaman yoğun olabilir. Bu nedenle, Megabrain gelişimi çok yönlü bir mantığı var: süresini azaltmak için montaj ve sonuç olarak daha az reaktifler kullanırken doku, boyama cryosectioning geçirdim. Ayrıca, yeteneği süreci hızlandırmaya ve aynı birden çok beyin leke yuvarlak bazı parçalar, bir sınırlama immünhistokimya3boyama arasında değişkenlik hafifletmeye yardımcı olur. Buna ek olarak, bir Megabrain kesit bireysel donmuş kemirgen beyin kesit için alternatif bir zaman tasarrufu ve doku hayvanlar veya bile tedavi grupları arasında hızlı karşılaştırma mikroskobu teknikleri tarafından sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Megabrain tekniği bütün ve hemisected beyin erkek yetişkin C57Bl6 fareler5, juvenil Sprague-Dawley rat ve 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) takip x ile derin transcardially edildi yetişkin Sprague-Dawley rats kullanarak optimize edilmiştir % 4 paraformaldehyde6tarafından. Benzer sonuçlar diğer suşları, fare ve sıçan, her iki cinsiyette ve farklı yaş içinde gerçekleştirilebilir. Bu el yazması için verileri oluşturmak için çalışma Juvenil Sprague-Dawley rat kullanılan ve Arizona Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi ve deneysel hayvanlar için bakım kılavuzu ve laboratuvar kullanım göre için bakım Hayvanlar7.

1. Cryoprotection derin beyin

  1. Aşağıdaki başarılı transcardial perfüzyon6, tam beyin6,8 hayvanlardan toplamak ve 24 h için PBS içinde %4 paraformaldehyde 25 mL şişe içine yerleştirerek sonrası düzeltme.
    Uyarı: Toksik mendil sabitleştirici Paraformaldehyde olduğunu; özenle hallederim. Paraformaldehyde onun konsantrasyon ve cilt kimyasal duman başlık içinde tanımlayan özel olarak etiketlenmiş bir atık kaba aktarın ve kimyasal güvenlik tarafından veya düzgün bertaraf kadar kabine kimyasal atık deposunda personeli eğitimli.
  2. Bir duman başlık, 24 saat geçtikten sonra beyin %4 paraformaldehyde bir spatula kullanarak kaldırın. Beyin flakon (yaklaşık 24 h) altına batar kadar beyin yaklaşık 20 mL 1 x Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS) % 15 sükroz çözümün bir şişe içine aktarın.
  3. Beyin flakon (yaklaşık 24-48 h) altına batar kadar bu beyin yaklaşık 20 mL % 30 sükroz çözeltisi 1 x TBS içinde bir şişe aktarın.

2. beyin donma

  1. 500 mL Cam kabı Kuru buzun içinde buz kovası bir yatak üzerinde yerleştirin. İsopentane (2 metil-bütan) 300-400 mL Cam kabı dökün.
  2. -45 ° C ile -50 ° c arasında ulaşmak için isopentane sıcaklığını izin Yakından izlemek ve bu sıcaklık aralığı yordamı sabit tutarak bir termometre ile korumak. Sıcaklık okuma orta alt veya yan tarafında, kabı değil müessir süre ve çözüm alınır emin olun.
  3. Benchtop üzerinde kalıp katıştırma tek kullanımlık doldurun (malzeme listesini görmek) en uygun kesme sıcaklık dolu yaklaşık 1/2 (Ekim; Tablo malzemelerigörmek) bileşik. Ekim hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. Herhangi bir hava kabarcığı çıkarıp bir spatula veya iğne ile varsa.
  4. İlk beyin % 30 sükroz şişe bir spatula ile kaldırın. Bu noktada, ya da beyin bütün veya hemisect çalışma tasarımına bağlı olarak dondurmak.
    1. Hemisected beyin hemisferlerin ayırmak için doku ile temiz bir kesme yapmak için yeni bir jilet kullanın. Çalışma için gerekli değil, beyincik ve olfaktör ampuller Bu aşamada kaldırın. Beyincik çalışma için gerekli değilse, bu düz bir alan beyin ayakta kalıp içine yardım için beynin arka sonunda kesmek için önerilmektedir. Çalışma sadece doku yerelleştirilmiş bir bölgeden gelen gerektiriyorsa, bir kemirgen beyin matris bilinen koordinatlarına göre beyin engellemek için kullanılabilir.
  5. Beyin sistemi adlandırma bir sayısal ver. Şekil 1' de gösterildiği gibi bir diyagram çizin. Megabrain kalıp pozisyonu 1 olarak hangi beyin donmuştun yönünü hızlı tanımlaması yardım etmek için bir boşluk bırakarak pozisyonu 2, içinde bulundukları ilk beyin numarasını yazın.
  6. Künt forseps veya cımbız kullanarak, beynini pozisyonu 1 yerleştirilmesi için alın. İlk yukarı bakacak şekilde kesilecek yan beyinle gelecek şekilde yönlendirin. OKT'yi beyne uygun konumda bağımsız olarak standları kadar konumunu ayarlamak için cımbız kullanarak indirin.
  7. 2.3-2.5 kalan beyin/3 – 10 pozisyonda donmuş hemisferlerin için adımları yineleyin. Beyin/hemisfer simetrik bir düzen konumlandırma kaçının.
  8. Megabrain kalıp tüm 9 beyinlerinde gözden geçirin. Bir kez beyin bağımsız olarak, dik ve düzgün yönlendirilmiş OCT'de ( Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi) ayakta duruyorlar, (üst beyin kaplıdır kadar) daha fazla OCT kalıp için ekleyin. Yine, Ekim hiçbir görünür hava kabarcıkları olduğundan emin olun.
  9. Forseps forseps kısmen OCT (Şekil 3A) sular altında olmak değil sağlanması kalıp, köşesinde tutmak için kullanın. Kalıp seviyesini korumak için dikkatli olmak isopentane (-50 ° C-45 ° C) içine kalıp alt böylece alt üçüncü kalıp batık. Burada herhangi bir kabarcıklar OCT'de doku (Şekil 3B) uzakta ve yüzeye yükselmeye izin vermek için basılı tutun.
  10. Sonra 30 s, alt tüm kalıp isopentane ve serbest bırakmak--dan Megabrain bırakarak forseps, içine sular altında en az 3 dakikadır (Şekil 3 c). Bu kalıp, düzeyi, tutulur, böylece beyin dik ve eşit uzaklıkta kalır emin olun (şekil 3D).
  11. 3 dakika sonra beyin (Şekil 3E) isopentane üzerinden kullanımı içeren dondurulmuş, kalıp kaldırmak için forseps OCT gömülü.
  12. Hemen, kalıp ve içeriğini alüminyum folyo sarma ve hayvan numaraları veya Megabrain kimliği ile etiketleyin. Donmuş Megabrain doku çözdürme önlemek için mümkün olduğunca idareli dokun.
  13. Bu Megabrain şimdi-20 ° C-dondurucu transfer ve en az 24 saat boyunca saklanır.
    Not: Burada Protokolü duraklatılmış ve Megabrain-ebilmek var olmak stok cryosectioning gerçekleşir kadar donmuş.

3. Megabrain Cryostat kesit hazırlanması

  1. Cryostat kabin sıcaklığı-19 ° C'ye ayarla Devam etmeden önce bu sıcaklık ulaşacağından emin olun. Kesit boyunca, kabin sıcaklığı-18 ° C ile -20 ° c arasında kalmasını sağlamak
  2. Megabrain-20 ° C dondurucudan alıp cryostat yerleştirin. Ayrıca, uygun boyut boyutları ve iki ince uçlu boya fırçaları chuck cryostat yerleştirin. Megabrain ve chuck cryostat cryostat sıcaklığa gelmek en az 15 dakika bırakın.
  3. Uygun şekilde etiket Megabrain kimlik numarası ve slayt numarası ile slaytlar. Bu slaytları bir slayt üzerinde daha sıcak (35-45 ° C) yatıyordu.
  4. Megabrain alüminyum folyo dan paketini açmak. Dikey olarak kalıp kalıp (Şekil 4A), Ekim bloğunun kolayca kaldırılmasına olanak köşeleri kesmek için jilet kullanın.
  5. İnce bir tabaka (yaklaşık 3 mm kalınlığında), Ekim chuck dağıtmak.
  6. Hızlı bir şekilde, parmak ve OKT arasında en az kişiyle, chuck, istenilen yönde Megabrain yerleştirin. Büyük forseps çözdürme en aza indirmek için bu adım için de kullanılabilir. Bölüm, Megabrain bırakın başlamadan önce chuck cryostat OCT tamamen dondurmak izin vermek 15-20 dakika içinde monte edilebilir.
  7. Bir kez temel katmanın, Ekim dondurdu, OCT Megabrain kenarlarına etrafında 2 mm kalın bir tabaka uygulayın ve bu chuck üzerine taraftan yakalamak izin. Bu Chuck Megabrain sağlanmasına yardımcı olur. Yine, devam etmeden önce monte Megabrain chuck cryostat OCT dondurmak izin vermek 15-20 dk içinde bırakın.
  8. Bir tıraş bıçağı taraf veya alt Chuck (Şekil 4B) herhangi bir aşırı OCT kaldırmak için kullanın.

4. Cryosectioning Megabrain

  1. Başlamadan önce en az 20 mL 1 x PBS içeren bir ölçek erişilebilir olduğundan emin olun.
  2. Chuck, Megabrain ile cryostat (Şekil 4B) chuck kafasına içine monte getirin.
  3. Cryostat istediğiniz kalınlıkta kesmek için ayarlayın. Geçerli metodoloji 50 µm bölümlerine 10 µm için optimize edilmiştir.
  4. Trim OKT ve doku koleksiyonu (Şekil 4 c) için istenen beyin bölgesi ulaşmak için gerektiği gibi doku.
  5. Doku toplamak, sahne alanı'nda aittir dek anti-roll plaka indirin ve tek bir bölüm almak için cryostat ne zaman hazır. Yavaş yavaş kesitli Megabrain anti-roll plakasına bağlı olmayan ve sahneden Şekil 4 ddüşmek değil dikkatli olmak anti-roll plaka kapalı kaldırın).
  6. Yavaşça boya fırçaları düz cryostat sahne alanı'nda (Şekil 5A) yalan kadar Megabrain bölümüne göz önüne sermek için kullanın. (Gerekirse, OCT haddeleme önlemek için boya fırçaları kullanarak düz tutun).
  7. Daha sıcak slayttan slayt kaldırmak ve slayt etiket tarafı aşağı, Megabrain bölüm bölüm slayda sopa izin sahnede üzerinde gezdirin.
  8. Hızlı bir şekilde slayttaki her doku Bölüm 1 x PBS bir damla uygulamak ve bunlar onlar düz fırça kadar kurumasına izin verme (bkz. Adım 4,9).
  9. Herhangi bir doku kabarcıkları dışarı fırça ve düz slayt üzerinde (5B rakam) yalan söylüyor bu yüzden doku açılmak için 1 x PBS daldırma ince uçlu fırça kullanın. Değil beyin bölümleri konumunu değiştirmek ve böylece diğer doku bölümlerine göreli konum kaybetmek için dikkat ediniz. Gözyaşları önlemek için itina ile doku işlemek. Periferik alan bir coverslip ve boyama bazı protokoller PAP kalem uygulama için gerekli olarak beyin bölümlerini slayt, kenarları uzak tutun.
  10. Slayda geri slayt daha sıcak ve kuru 45 dk. doku üzerinde yerleşme toz önlemek için gerektiğinde kapak koyun. Kuru bir kez, içinde slaytları-80 ° c kadar kullanmaya devam etmenize depolama.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yordam için olumlu bir sonuç hiçbir kabarcıklar veya gözyaşları içinde donmuş yönde düz slaytta yatıyor dokudur. Doku bölümler nedeniyle beyin OCT'de ve iyi gösterim olarak Şekil 1' deki gösterdiği iyi yerleşimini ayrı ve kolayca tanımlanabilir eşit aralıklandırılmış. Beyin dokusuna benzer yaş hayvanlardan toplanan ve doku düzgün Ekim uyumlu varsayılarak, bir slayt üzerinde toplanan bölümleri beyin bölgeleri hayvanlar arasında karşılaştırılması izin benzer...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Megabrain ve çevresi sıcaklığı sürekli çözdürme ve doku yeniden donma önlemek için takip gerekir Bu yordam sırasında düşünülmelidir. Beyin sadece-20 ° C dondurucudan için 3 kez olarak bu değindi 's ve daha sıcak bir dalgalanan sıcaklık, doku cryostat sol Tammy'nin ve refreezes, bir jöle gibi doku ve anormal doku bütünlüğü10neden her zaman kaldırılabilir. Bu nedenle, Megabrain tek seferde kesmek için en iyi yöntemdir.

Doku fiksasyon ve cryoprotection buz kristal oluşumu ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCH misyon destek fonları bu el yazması bildirilen araştırma desteklenen. Yazarlar Daniel Griffiths rakamlar kullanılan fotoğraf çekmek teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT bileşiği (12 vakası)Fisher Scientific14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Tek Kullanımlık Gömme KalıplarıFisher Scientific18-41
Fisherbrand Yüksek Hassasiyetli Düz Geniş Güçlü Nokta Cımbız/ForsepsFisher Scientific12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Sintilasyon Şişeleri ile Polipropilen KapakFisher Scientific03-337-23
Sükroz, poli şişe 2,5 kgFisher ScientificS2-212Hem %15 hem de %30 sükroz konsantrasyonlarının oluşturulması gerekir.
2-Metilbütan (Sertifikalı), Fisher ChemicalFisher ScientificO3551-4
PYREX Uzun Formlu BeherlerFisher Scientific02-546E
Fisherbrand Genel Amaçlı Cam İçi Sıvı Kısmi Daldırma Termometreleri (-50 ila +50 &°; C)Fisher Scientific13-201-642
Fisherbrand  Scoopula SpatulaFisher Scientific14-357Q
STANLEY Tıraş Bıçağı Grainger4A807
Edge-Rite Mikrotom bıçaklarıFisher Scientific14-070-60
Mikroskop slaytları (1" don) - beyazFisher Scientific22-034-979
Gibco  PBS (Fosfat Tamponlu Salin) 10x, pH 7.2Fisher Scientific70-013-032Kullanmadan önce 1X 'ye seyreltin
15 parça ince boya fırçalarıAmazonB079J12ZRV
PAP kalemiabcamab2601
Chuck Şekil 4'te gösterilen bir laboratuvar teknisyeni tarafından özel olarak yapılmıştır, ancak benzer boyutlar ticari olarak diğer şirketlerden sipariş edilebilir.Elektron Mikroskobu BilimleriEMS065

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
  2. Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology? Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
  3. Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
  4. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  5. Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
  6. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  7. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).
  8. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  9. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).
  10. Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
  11. Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Megabrain Tekni iDoku Montajmm nohistokimyaOCT G mmezopentan dondurmaLam Haz rlamaBeyin Kesit AlmaHistolojik Analiz

İlgili makaleler