Yöntem makalesi

Bir zebra balığı embriyo Model In Vivo görselleştirme ve Staphylococcus aureus Intravital analiz Biomaterial ilişkili enfeksiyon

DOI:

10.3791/58523

⸱

7 Ocak 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu da çalışmanın bir zebra balığı embriyo modeli içinde vivo görselleştirme ve enfeksiyonu floresans mikroskobu göre zaman içinde biomaterial ilgili intravital analizi için açıklar. Bu model içinde vivo biomaterial ilişkili enfeksiyonların çalışmak için fare modelleri gibi memeli hayvan modelleri tamamlayan gelecek vaat eden bir sistemdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enfeksiyonu (BAI) biomaterial ilgili Biyomalzeme/tıbbi cihazlar başarısızlığın önemli bir nedenidir. Staphylococcus aureus BAI önemli patojenler biridir. Fare modelleri pahalı ve zaman alıcı ve bu nedenle yüksek üretilen iş analizi için uygun değildir gibi geçerli deneysel BAI memeli hayvan modelleri. Böylece, roman hayvan modelleri BAI içinde vivo soruşturma için tamamlayıcı sistemler olarak istenilen. Mevcut çalışma, zebra balığı embriyo model içinde vivo görselleştirme ve floresan mikroskopi üzerinde dayalı Biyomalzeme huzurunda bakteriyel enfeksiyon intravital çözümleme geliştirmek amaçlanmıştır. Buna ek olarak, provoke makrofaj yanıt incelenmiştir. Bu amaçla, floresan protein ifade S. aureus ve transgenik zebra balığı embriyo onların makrofajlar floresan proteinler ifade kullanılan ve bakteriler tek başına veya birlikte mikroküreler kas içine enjekte etmek için bir prosedür geliştirilmiştir doku embriyo. Zaman içinde canlı embriyolar bakteriyel enfeksiyon ilerleme izlemek için mikroskobik floresan bakteri Puanlama basit fakat güvenilir bir yöntem geliştirdi. Mikroskobik Puanlama sonuçları ile 20'den fazla koloni oluşturan birim (CFU) bakterilerin tüm embriyoların bakterilerin olumlu bir floresan sinyal verdiğini gösterdi. Biyomalzeme olası etkilerini enfeksiyon üzerinde çalışmaya, biz CFU numaralarını S. aureus ve 10 µm polistren mikroküreler (PS10) olmadan embriyo modeli Biyomalzeme olarak belirledi. Ayrıca, ObjectJ proje dosya "Zebra balığı-Immunotest ImageJ içinde faaliyet" S. aureus enfeksiyon ve PS10 olmadan zaman içinde floresans yoğunluğunu ölçmek için kullanılır. Her iki yöntem sonuçlarından S. aureus daha yüksek sayıda embriyo mikroküreler, biomaterial huzurunda bir artan enfeksiyon duyarlılık gösteren olmadan içinde mikroküreler ile enfekte embriyo gösterdi. Böylece, bu da çalışmanın potansiyel zebra balığı embriyo modelinin BAI burada geliştirilen Yöntemler ile çalışmaya gösterir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tıbbi cihazlar ("Biyomalzeme" anılacaktır) çeşitli giderek modern tıpta dinlenme ya da insan vücudu parçaları1değiştirmek için kullanılır. Ancak, Biyomalzemeler implantasyonu enfeksiyona, implant ameliyatta önemli bir komplikasyonu olan bir biomaterial ilişkili enfeksiyon (BAI) adı verilen bir hasta açmaları. Staphylococcus aureus ve Staphylococcus epidermidis iki en yaygın bakteriyel türler BAI2,3,4için,5,6sorumlu vardır. Biyomalzeme formu bir yüzey bakteriyel biyofilm oluşumu için duyarlı implante. Ayrıca, yerel bağışıklık yanıtı bakteriyel temizleme azaltılmış etkinliğini neden implante Biyomalzeme tarafından dengesiz. Bakteri hastalık ilk izni esas olarak nötrofil, güçlü bir eklenen huzurunda bakterisidal kapasitesi azaltılmış veya biomaterial7implante infiltre tarafından gerçekleştirilir. Ayrıca, sonra nötrofil ilk akını kalan bakteri phagocytose ama etkili olamaz doku sızmak makrofajlar onları intracellularly, kombine varlığı bir sonucu olan sinyal dengesiz bağışıklık nedeniyle öldürmek biomaterial ve bakteri8. Böylece, Biyomalzemeler varlığı bakteri9,10,11,12,13 ve biyofilm oluşumu implante hücre içi yaşama kolaylaştırabilir Biyomalzeme4,14. Sonuç olarak, BAI başarısızlık yol ve implante Biyomalzeme, yenisiyle değiştirme için ek maliyeti2,15ile artan morbidite ve mortalite ve uzun süreli hastanede neden gerekir.

Anti-BAI stratejileri artan sayıda gelişmiş2,16,17davranıyorsun. İn vivo ilgili hayvan modellerinde bu stratejileri etkinliğinin değerlendirilmesi esastır. Ancak, geleneksel deneysel BAI hayvan modelleri (örneğin, fare modelleri) genellikle pahalı, zaman alıcı ve bu nedenle yüksek üretilen iş birden fazla stratejileri18test için uygun değildir. Son konak hücreleri ve bakteriler kollarındaki/floresan etiketlemeyi dayalı biyo-optik görüntüleme teknikleri geliştirilmesi tek küçük hayvanlarda BAI ilerleme ve ana bilgisayar-patojen/konak-malzeme etkileşimleri sürekli izlenmesi için izin verebilir Fareler18,19,20,21gibi. Ancak, bu teknik oldukça karmaşık ve henüz emekleme aşamasında, ve birkaç sorunu BAI18kantitatif analiz için ele alınması gerekir. Örneğin, bir yüksek meydan doz bakteriyel kolonizasyon görselleştirmek için gereklidir. Ayrıca, ışık saçılma ve Adsorpsiyon memeli test hayvanları da olmalıdır dokularda bioluminescence/floresan sinyallerin18,19,21ele. Bu nedenle, zaman içinde intravital görselleştirme ve kantitatif analiz için izin roman, uygun maliyetli hayvan modelleri BAI içinde vivo çalışmak için değerli tamamlayıcı sistemlerdir.

Zebra balığı (embriyo) ana bilgisayar-patojen etkileşim ve enfeksiyon Patogenez mikobakteriler22, Pseudomonas aeruginosa23, gibi çeşitli bakteri türlerinin dissekan için çok yönlü bir içinde vivo aracı olarak kullanılmıştır Escherichia coli24, Enterococcus faecalistir25ve stafilokoklar26,27. Zebra balığı embriyo optik şeffaflık, nispeten düşük bakım maliyeti ve memeliler28,29son derece benzer bir bağışıklık sistemi bulundurma gibi pek çok avantajı var. Bu son derece ekonomik, canlı model organizma intravital görselleştirme ve analiz enfeksiyon ilerleme ve ilişkili ana bilgisayar yanıt-e doğru28,29zebra balığı embriyo yapar. Görselleştirme hücre davranış içinde vivo, transgenik zebra balığı satırlarının bağışıklık hücreleri (, makrofajlar ve nötrofiller) farklı tipleri ile izin ve hatta fluorescently etiketli hücre altı yapıları ile geliştirilen28 ,29. Ayrıca, zebra balığı yüksek üreme oranı yüksek üretilen iş test sistemleri otomatik robot enjeksiyon, otomatik floresans miktar ve RNA dizisini analiz27, geliştirme imkanı sağlar 30.

Bu da çalışmanın, floresans görüntüleme teknikleri kullanarak biomaterial ilişkili enfeksiyon için bir zebra balığı embriyo model geliştirmek amaçlanmıştır. Bu amaçla, zebra balığı embriyo Kas dokusuna biomaterial mikroküreler huzurunda bakteri (S. aureus) enjekte etmek için bir yordam geliştirdi. Biz başka bir yerde başka bir S. aureus zorlanma10,31için açıklandığı gibi inşa edilmiştir S. aureus RN4220 ifade mCherry floresan protein (S. aureus- mCherry), kullanılır. Transgenik zebra balığı hattı (mpeg1: UAS/Kaede) Kaede makrofajlar32 ve mavi flüoresan polistren mikroküreler yeşil flüoresan protein kullanılan ifade. Bir önceki çalışmada, mikroküreler kas içi enjeksiyon biomaterial implantasyon taklit zebra balığı embriyo içine uygun33olduğunu göstermiştir. Kantitatif BAI ilerlemesini ve zaman içinde tek embriyo içinde ilişkili hücre infiltrasyonu, biz ki "ObjectJ" (bir eklenti ImageJ) içinde floresans yoğunluğunu ölçmek için ameliyat "Zebra balığı-Immunotest" proje dosyası olarak çözümlemeye ikamet eden bakteri ve mikroküreler33enjeksiyon yeri çevresinde infiltre makrofajlar. Buna ek olarak, biz koloni oluşturan numaralarını tespit Biyomalzeme olası etkilerini enfeksiyon üzerinde çalışmaya birimleri (CFU) varlığı ve yokluğu mikroküreler embriyo içinde bakteri. Bizim çalışmada burada geliştirilen Yöntemler ile zebra balığı embriyo biomaterial ilişkili enfeksiyonların içinde vivo çalışmak için umut verici, yeni bir omurgalı hayvan modeli olduğunu gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için yetişkin zebra balığı yerel hayvan refahı düzenlemeleri ile uyumlu yerel hayvan refahı Komitesi tarafından onaylanmış gibi korumaktır. Embriyo ile deneyler 2010/63/AB Direktifi göre yapıldı.

1. "Salt bakteri" ve bakteri-mikroküreler süspansiyonlar hazırlanması

Not: MCherry floresan protein (S. aureus- mCherry) ifade S. aureus RN4220 zorlanma kullanılır. S. aureus RN4220 zorlanma virülans regülatör gen agrA (aksesuar gen düzenleyici A)34mutasyona uğramış ve bu nedenle nispeten düşük virülans zebra balığı embriyo modelinde olabilir. Diğer S. aureus suşları veya diğer bakteriyel türler BAI için kullanılabilir.

  1. S. aureus RN4220 bakterilerden tryptic soya agar kültürü plakaları 10 µg/mL kloramfenikol ile desteklenmiş 4-5 kolonileri alın ve 10 mL tryptic soya suyu 10 µg/mL ile desteklenmiş orta-Logaritmik büyüme aşamasında için bakteri kültürü kloramfenikol 37 ° C'de sallayarak altında.
    1. Kültür sırasında steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 620 adlı bir optik yoğunluk (OD) ölçüm için bir küvet (1 cm genişlik) 900 µL bakteriyel süspansiyon 100 µL seyreltik nm (OD620). OD620 0.4-0.8 ulaşıncaya kadar bakteri kültürü.
      Not: 0.1 OD620 3.0 x 10 için genellikle karşılık gelir7 CFU/mL S. aureus. Bir inoculum orta Logaritmik büyüme aşamasında bakterilerin OD620 0.4-0.8 arasında olduğunu. Kültür için farklı dönemlere diğer türler ve bakteri suşları için gerekli olabilir.
  2. Bakteri 3.500 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi ve 1 ml steril PBS pelleted bakteri yeniden askıya alma. Daha sonra bakteri steril PBS 2 kere ile yıkama ve sonunda 1.1 mL % 4 (w/v) polyvinylpyrrolidone40 (PVP40) çözeltisi PBS içinde yer alan bakteriler yeniden askıya alma.
  3. Girdap Bu bakteriyel süspansiyon ve steril PBS OD620 ölçüm için bir küvet içinde 900 µL süspansiyon seyreltik 100 µL. PVP40 çözüm ile bakteri süspansiyon konsantrasyon ayarlayın. Bu "Sadece bakteri" askıya alınmasıdır.
  4. Biyomalzeme serbestçe bakteriyel süspansiyon ile karıştırmak için seçilebilir. Bu da çalışmanın, ticari Polistiren (PS) mikroküreler (mavi floresan, 10 µm) kullanılır. Bir bakteri-mikroküreler süspansiyon üretmek için mikroküreler, 1000 x g, oda sıcaklığında 1 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve mikroküreler "Salt bakteri" süspansiyon (PVP40 çözüm) yeniden askıya.
  5. Bakterilerin varlığı ve yokluğu mikroküreler yaklaşık olarak eşit dozlarda enjekte için bakteri-mikroküreler süspansiyon konsantrasyon üçte ikisi (olmadan "Sadece bakteri" süspansiyon konsantrasyon olması gerekir mikroküreler). Bu PVP40 çözüm 0.5 hacmi ile bakteri-mikroküreler süspansiyon sulandrarak elde edilir. Süspansiyonlar vortexing tarafından karıştırın. Not, bu oran S. aureusiçin (2/3) tespit. Ayrıca S. epidermidisiçin uygundur, ancak bu oran aynı zamanda diğer bakteriyel türler ve diğer boyutları (daha 10 µm) veya şekilleri Biyomalzeme (daha mikroküreler) enjekte edilir geçerli olup olmadığını kontrol etmelerini rica ederiz.
  6. Aşağıdaki gibi 10 kat seri dilutions kantitatif kültürü ile bakteri-mikroküreler "Sadece bakteri" süspansiyon konsantrasyon denetleyin: süspansiyonlar iyi-plaka ve seri olarak 10 µL aliquots, aktarma tarafından seyreltik 96 için transfer 100 µL süspansiyon steril PBS 90 µL içine. Yinelenen 10 µL aliquots özel plakalar üzerinde su katılmamış ve seyreltilmiş süspansiyonlar, plaka, Plaka 37 ° C'de gecede kuluçkaya, kolonilerin sayımı ve bakteri (koloni oluşturan birimler. sayıda hesaplamak CFU).

2. yetiştirme, hasat ve bakım zebra balığı embriyolar

  1. Genel yordamlar açıklanan önceki35,36 için Hayvancılık, hasat ve bakım zebra balığı embriyolar, aşağıda açıklanan değişiklikleri ile izleyin. Vahşi türü Tupfel uzun fin (TL) zebra balığı veya seçili transgenik satırın zebra balığı bir ailenin çapraz (burada, Mpeg1: Kaede) ışığı yanar sonra yumurta üretmek için yetişkin kadın ikna etmek için eklendi bir net ile tank, sonra yetişkin üretilen yumurtadan ayrı..
  2. Ertesi gün embriyo toplamak ve uygun olmayan saydam olmayan olanları atın. E3 orta37 yılında yaklaşık 60 embriyo Petri kabına (100 mm çapında) başına tutmak ve 28 ° C'de kuluçkaya Ölü ve anormal embriyo kaldırmak ve E3 orta günlük yenileyin.

3. enjeksiyon iğneler hazırlanması

  1. Cam microcapillary iğneler bir micropipette çektirme aleti kullanarak enjeksiyon için hazır olun. Kullanma ertesi gün koyma: ısı: 772, çekme: 100, vel: 200, zaman: 40, gaz: 75.
  2. İğne ucu iğne ile bir ölçek çubuğu vizörün içinde hafif bir mikroskop kullanarak bir dış çapı yaklaşık 20 µm (için 10 µm mikroküreler), bulunduğu pozisyonda forseps ile bölünürler. Hayatta kalma embriyoların uzlaşma olacak gibi bir çok büyük açılış boyutu iğnelerle kaçının.
    Not: Açılış daha küçük veya daha büyük, boyutuna ve biyomalzeme enjekte edilir şeklinde olmak seçmiş olabilirsiniz. Literatürde, iğneler yaklaşık 50 µm bir açılış ile kullanarak enjeksiyonları embriyo hayatta kalma38önemli bir azalma neden olduğu bildirilmiştir.

4. zebra balığı embriyo içine enjeksiyon "Salt bakteri" veya bakteri-mikroküreler süspansiyon

  1. Isı özel çözüm (1-% 1,5 (wt) demi-su) kullanarak bir mikrodalga fırın ve 100-mm Petri kabına dökün. Özel çözüm üstüne plastik kalıp şablon enjeksiyonları kolaylaştırmak uygun pozisyonlarda embriyo yerleştirme özel girintilerine oluşturmak için Petri kabına yerleştirin. Oda sıcaklığında kuluçkaya ve kalıp çıkarmak ne zaman özel çözüm katılaşmış.
  2. 3 d sonrası döllenme embriyo bir 100 mm %0.02 (w/v) 3-aminobenzoic asit (Tricaine) onları uyuşturan içeren kabında yerleştirin. 5 dk sonra enjeksiyon için bir yönde hizalamadan ve %0.02 (w/v) Tricaine içeren E3 orta ile overlaid özel plaka embriyo transfer. Mpeg1 için: Kaede transgenik satırı ilk uyuşturan embriyo E3 orta içeren %0.02 (w/v) tricaine. Sonra embriyo yeşil flüoresan proteinler stereo floresan mikroskop kullanarak ifade seçin.
  3. Microloader pipet ucu kullanarak "Salt bakteri" veya bakteri-mikroküreler süspansiyon yaklaşık 10 µL iğneyle yükleyin. İğneyi mikro-enjektör için bağlı bir micromanipulator üzerine monte. Enjektör burada (bakınız tablo malzemeler), kullanımı aşağıdaki ayarları 2-3 nL enjeksiyonu için kullanılan için: Basınç: 300-350, geri dönüş basıncı: 0, saat: 2 ms.
    Not: Mikro-enjektör için ayarlar kullanılan enjektör bağlıdır. Enjektör ayarları enjeksiyonları Biyomalzeme diğer şekilleri veya boyutları ile karışık bakteri için ayarlanması gerekebilir.
    1. Aynı açılması için "Yalnızca bakteri" süspansiyon ve bakteri-mikroküreler süspansiyon enjeksiyon ile iğne kullanın. İğne kırık veya tıkanmış, her zaman yeni bir iğne daha fazla enjeksiyon için değiştirin.
  4. İğne iğne ve embriyoların vücut arasında bir açı 45-60 ° lik embriyo altında ışık mikroskobu (Şekil 1), kas dokusunun içine yerleştirin. İğne pozisyon doku yavaşça ileri geri taşıyarak ayarlayın. Mikro-enjektör için bağlı bir ayak pedalı kullanarak embriyo enjekte.
  5. Sonra enjeksiyon floresan bakterilerin embriyoların bir stereo floresan mikroskop altında başarılı enfeksiyon için puan. Embriyo attı negatif (görünür floresan bakteri veya hiçbir görünür floresan mikroküreler) atmak. 48-şey plakaları E3 ortamda tek tek embriyo korumak. Orta günlük yenileyin.

5. kırma embriyolar, mikroskobik Puanlama ve bakterilerin kantitatif kültürü

  1. Tüm embriyoların mikroskobik hemen sonra enjeksiyonları ve embriyoların rastgele kantitatif kültürü için seçilene dek sonraki her gün başlayan bir stereo floresan mikroskop kullanarak floresan bakteri varlığı için puan.
  2. Rastgele birkaç canlı virüslü embriyo (5-6 da çalışmanın içinde) kısa bir süre sonra enjeksiyon seçin ve bunları ayrı ayrı ayrı 2 mL mikrotüpler steril ipuçlarını kullanarak aktarabilirsiniz. Orta kaldırın, yavaşça steril PBS ile embriyo bir kez yıkamak ve steril PBS 100 µL ekleyin.
  3. Her şişe için 2-3 steril zirkon boncuk (2 mm çapında) ekleyin ve homogenizer kullanarak embriyo ezmek ( Tablo malzemelerigörmek) s. 30 için 3500 devirde kültür homogenate kantitatif 1.3 adımda anlatıldığı gibi.
    Not: Diğer homogenizers farklı ayarlar gerektirebilir.
  4. Rastgele birden fazla embriyo adım 5.3 göre kantitatif kültürü için enjeksiyon sonra sonraki günleri seçin.

6. floresans mikroskobu enfeksiyon ilerleme ve zebra balığı embriyo provoke hücre infiltrasyonu

  1. 4.2. adımda açıklandığı gibi embriyo uyuşturan. Bir PBS - %2 (wt) metil selüloz çözeltinin 500 µL içine %0,02 (w/v) Tricaine ile E3 ortam içeren bir Petri kabına pipet. Embriyo metil selüloz çözümde yer ve düz ve yatay tutun.
    Not: Metil selüloz çözüm "hangi viskozite, nedeniyle geçici olarak embriyolar görüntüleme için en iyi yönde hareketsiz bir tutkal", olarak kullanılır.
  2. Kullanım stereo floresan mikroskop parlak alan, mCherry, yeşil flüoresan protein (GFP) ve UV ile donatılmış aynı en iyi duruma getirilmiş ayarları (örneğin, yoğunluğu, kazanç ve pozlama süresi), 160 x büyütme altında görüntü bireysel embriyolar için filtreler . Öyle ki enjeksiyonu ile doku hasarları parlak alan filtresi kullanarak odakta odak düzlemi ayarlayın. Z-yığın derinliği 10 µm ve adım 3 ardışık resim kayıt için sağlayan 5 mikron boyutunda ayarlamak.
  3. Görüntü tek tek embriyo 5 h kadar 2 gün sonrası Enjeksiyon sonrası enjeksiyon üzerinden günde bir kez. Ölü embriyo (kalp atışı veya kısmen bozulmuş embriyo) daha fazla görüntüleme ve çözümleme için hariç. 48-şey plakaları E3 ortamda tek tek embriyo korumak. Orta günlük yenileyin.

7. enfeksiyon ilerleme ve nesne J proje dosyası "Zebra balığı-Immunotest" kullanarak provoke hücre infiltrasyon floresans yoğunluğunu kantitatif analiz

  1. "Zebra balığı-Immunotest" ve detaylı manuel bağlantısından yükleyin: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, bir önceki çalışmada33içinde açıklandığı gibi. Kısaca, "Zebra balığı-Immunotest" görüntü J. freeware program kapsamında çalışma, ile analiz için görüntü açın Yüklenen her görüntü içinde el ile temel embriyo gözlenen doku hasar üzerinde enjeksiyon yeri işaretleme.
    Not: İşaretli sitesi "Tarafından zebra balığı-Immunotest" merkezi noktası olarak floresans tepe 50 µm bir mesafede tespit etmek için kullanılır. Algılanan floresans tepe daha sonra floresans ölçüm için standart alan (çapı 100 µm) merkezi olarak kullanılır.
  2. "Hesaplama" nesne J menü floresan ölçüm için birden fazla kanal, varsa, tüm görüntüler için otomatik olarak çalıştırmak için tıklatın. Verileri verme ve uygun istatistik test yöntemleri tarafından analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu da çalışmanın zebra balığı embriyo uygulanabilirliği enfeksiyonu biomaterial ilgili soruşturma için bir roman omurgalı hayvan modeli olarak değerlendirildi. Mikroenjeksiyon tekniği farklı bakteri türleri zebra balığı embriyo enfeksiyon22,26,27,30,36neden enjekte etmek yaygın olarak kullanılmış. Şekil 1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enfeksiyonu (BAI) biomaterial ilgili ciddi bir klinik komplikasyondur. Önlenmesi ve tedavisinde BAI geliştirmek için yeni anlayışlar BAI içinde vivo patogenezinde daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Ancak, geçerli BAI hayvan modeller fare modelleri gibi pahalı, emek yoğun ve karmaşık cerrahi tekniklerde uzmanlaşmış personel eğitim gerektirir. Bu nedenle, bu modeller yüksek üretilen iş analizi için uygun değildir. Zebra balığı embriyo bir roman omurgalı hayvan modeli olarak BAI içinde vivo, tamamlayıcı için soruşturma i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada mali Biyomedikal malzeme (BMM) programı IBIZA project tarafından desteklenen ve ortak Flamanca ekonomik işler Bakanlığı tarafından finanse. Yazarlar Prof. Dr. Graham Lieschke Monash Üniversitesi, Avustralya'dan zebra balığı mutant satır sağlamak için teşekkür etmek istiyorum (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Triptik soya agarBD Difco236950AMC'de medya hazırlama ünitesi
Triptik soya suyuBD Difco211825
Polivinilpirolidon40ApplichemA2259.0250
10 & mikro; m çaplı polistiren mikro kürecikler (mavi floresan)Yaşam teknolojisi/ThemoFisherF8829
Cam mikrokılcal damar (1 mm OD x 0,78 mm ID)Harvard Aparatı30-0038
Mikropipet çektirme aletiSutter Instrument IncAlevli p-97
Işık mikroskobu LM 20LeicaMDG33 10450123
3-aminobenzoik asit (Trikain)Sigma-AldrichE10521-50G
Agaroz MPRoche11388991001
Stereo floresan mikroskop LM80LeicaMDG3610450126
Microloader pipet uçlarıEppendorf5242956.003
M10 standlı mikromanipülatör M3301World Precision Instruments00-42-101-0000
FemtoJet ekspres mikro enjektörEppendorf5248ZO100329
Microtrube 2 mL ppSarstedt72.693.005
Zirkonya boncuklarBiyo-bağlantı11079124ZX
MagNA lyserRoche41416401
MSA-2 plakaları (Mannitol Tuz Agar-2)Biomerieux43671Chapmon 2 orta
Metil selüloz 4000cpSigma-AldrichMO512-250G
KloramfenikolSigma-AldrichC0378
Gyrotory çalkalayıcı (bakteri üremesi için)New Brunswick ScientificG10
Zebra balığı kuluçka makinesiVWRIncu-line
KüvetlerMARKA 759015
SantrifüjHettich-ZentrifugenROTANTA 460R
SpektrometrePharmacia biotechUltrospec® 2000
ForcepsSigma-AldrichF6521-1EA
48 kuyu plakasıGreiner bio-one677180
96 kuyu plakasıGreiner bio-one655161
Petri kabıFalcon353003
Petri kabıBiomerieuxNL-132
ImageJUygulanamazUygulanamazbağlantı: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0PrizmaUygulanamaz

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
  2. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10(2012).
  3. Otto, M. Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
  4. Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
  5. Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
  6. Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
  7. Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
  8. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
  9. Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
  10. Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
  11. Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
  12. Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
  13. Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
  14. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
  15. Darouiche, R. O. Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
  16. Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63(2017).
  17. Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).
  18. Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
  19. Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
  20. Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
  21. van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584(2013).
  22. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
  23. Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
  24. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697(2009).
  25. Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
  27. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255(2013).
  28. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
  29. Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
  30. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  31. Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
  32. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
  33. Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
  34. Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
  35. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  36. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781(2012).
  37. Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).
  38. Chaplin, W. T. P. Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , Queen's University. Master thesis (2017).
  39. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
  40. Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
  41. Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
  42. Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
  43. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779(2011).
  44. Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
  45. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59(2007).
  46. Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biyomalzeme li kili EnfeksiyonFloresan MikroskopiMikrok re EnjeksiyonuMakrofaj Yan tKoloni Olu turan BirimObjectJ ImageJFloresan Protein Ekspresyonu

İlgili makaleler