Yöntem makalesi

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

DOI:

10.3791/58532

⸱

1 Kasım 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Plant Physiology, University of Neuchatel, 2Institut fur Biochemie und Biotechnologie, Martin-Luther-Universitat Halle-Wittenberg

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada protein alma kompleksleri (TOC-TIC kompleksi) dokunun etiketini kullanarak kloroplast arıtma için kanıtlanmış ve test iletişim kuralı mevcut. Tek benzeşimi yalıtım Protokolü potansiyel olarak herhangi bir protein için uygulanabilir ve kütle spektrometresi ile yeni etkileşim ortaklar tanımlamak için kullanılan.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kloroplast Biyogenez Plastit alma çekirdeği kodlu proteinleri binlerce gerektirir. Bu proteinler ithalat dış (TOC) ve iç (TIC) kloroplast membranlar translocon bağlıdır. İçindekiler tablosu ve TIC kompleksleri multimeric yüklenir ve muhtemelen henüz bilinmeyen bileşenleri içerir. TOC ve TIC bileşenleri tam envanter alanında ana amaçlarından biri kurmaktır. TOC-TIC kompleksleri yalıtım ve yeni bileşenleri tanımlaması için TOC159 oldu preprotein reseptör N-ölümcül musluk-TOC159 sonuçlanan tandem benzeşme arıtma (TAP) etiket eklenmesi tarafından değiştirildi. MUSLUK-etiket iki sıralı benzeşme arıtma adımları için tasarlanmıştır (dolayısıyla "tandem benzeşme"). Bu çalışmalarda kullanılan musluk-etiket (ProtA) takip Staphylococcus aureus Protein calmodulin bağlama peptid (CBP) tarafından türetilmiş bir N-terminal IgG-bağlayıcı etki oluşur. Bu iki benzeşme etiketleri arasında bir tütün etch virüs (TEV) proteaz bölünme site dahil olmuştur. Bu nedenle, TEV proteaz TOC159 içeren kompleksleri nazik elüsyon sonra IgG boncuk bağlama için kullanılabilir. Burada sunulan iletişim kuralında, ikinci Calmodulin-benzeşme arıtma adım ihmal. Arıtma Protokolü hazırlama ve toplam hücresel zarları solubilization ile başlar. Deterjan-tedaviden sonra çözündürüldükten membran proteinlerinin kompleksleri dokunun TOC159 içeren immunoisolation IgG boncuk ile inkübe. Bağlama ve geniş çamaşır üzerine, musluk-TOC159 içeren kompleksleri i ciddi ve IgG boncuk sayede S. aureus IgG-bağlayıcı etki kaldırılır TEV proteaz kullanarak serbest. Batı izole kurutma TOC159 içeren kompleksleri bilinen veya şüphelenilen TOC ve TIC proteinler varlığını doğrulamak için kullanılabilir. Daha da önemlisi, TOC159 içeren konut projeleri başarıyla TOC ve TIC kompleksleri yeni bileşenlerini belirlemek için kütle spektrometresi tarafından kullanılmaktadır. Biz potansiyel olarak mevcut iletişim kuralı herhangi bir membran bağlı protein verimli yalıtım karmaşık henüz bilinmeyen bileşenlerini tanımlanması için kütle spektrometresi tarafından kullanılmak üzere izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitkiler fotosentez ve photoautotrophic büyüme1kloroplast bağlıdır. Kloroplast proteinler büyük çoğunluğu çekirdeğinde kodlanmış, sitozol sentezlenmiş ve kloroplast zarf membranlar2TIC ve TOC kompleksleri ile içe aktarılmış. TOC karmaşık çekirdek protein iletken Toc75 kanal ve iki reseptör GTPases Toc33 ve Toc1593,4,5oluşur. TOC159 kloroplast Dipnotlar için önemlidir ve fotosentez ilişkili proteinler6büyük birikimi aracılık eder. TIC karmaşık TIC20 protein-iletken kanal yanı sıra7,8TIC110 ve TIC40 oluşur. Son zamanlarda, bir 1MD protein translocation iç zarf membran karmaşık izole edildi ve evvelce tanımlanamayan bileşenleri9hangi TIC56 biriydi, yer. Son zamanlarda ortak 1 MDa musluk-TOC159 benzeşme arıtma protokolünü kullanarak karmaşık TIC56 izole. Veriler "kanonik" TOC/TIC kompleksleri ve 1 MDa karmaşık10arasında yapısal bir örtüşme göstermiştir. Daha önce dokunun yöntemini kullanarak içindekiler tablosu ve TIC kompleksleri yeni etkileşim ortaklarının10,11burada açıklandığı gibi KOC1 bilinmeyen bileşenleri de tespit edilmiştir.

Böylece, TAP-etiket arıtma protein kompleksleri yalıtım ve etkileşen ortakları tarafından sonraki kitle spektrometrik Analizi12tanımlaması için verimli bir yöntemdir. DOKUNUN etiketi iki oluşur bir calmodulin bağlama peptid (CBP) bir tütün tarafından ayrılmış IgG bağlama tekrarlar etch virüs (TEV) proteaz bölünme sitesi. Bir IgG-benzeşme arıtma aşamasında oluşan orijinal yöntemi TEV bölünme tarafından takip ve sonraki calmodulin-benzeşme Kromatografi büyük ve son derece saf protein kompleksleri13,14 yerel arıtma izin . Biz prosedürü basitleştirilmiş ve TOC159 içeren protein kompleksleri de verimli bir şekilde sadece elüsyon15için TEV-bölünme tarafından takip IgG-benzeşme arıtma adım kullanarak saf olduğunu gösterdi. Bizim deneyim, calmodulin-benzeşme adım ihmal daha yüksek verimleri sonuçlandı ve bu nedenle düşük bereket proteinler için uygun olabilir.

Kısacası, biz kararlı transgenik A. thaliana mühendislik musluk-TOC159 ppi2 içinde (toc159 KO mutant) ifade çizgileri arka plan ve TOC-TIC kompleksleri arıtma için güvenilir bir kaynak olarak kurmuş. TOC-TIC kompleks izolasyon için protokol bitki materyali deterjan-Alerjik arabellekte homojenizasyon başlar. Santrifüjü sonra süpernatant atılır. Toplam membran kesir içeren pelet deterjan içeren bir arabellek kullanarak çözündürüldükten. Bir ultra-Santrifüjü adımdan sonra IgG-reçine benzeşme arıtma çözündürüldükten TIC TOC kompleksleri içeren süpernatant uygulanır. Birkaç sonra adımları yıkama, elüsyon IgG bağlayıcı etki alanlarının ve yavaşça seçmeli olarak aşağı ayırmak için TEV proteaz içeren bir arabellek kullanarak gerçekleştirilir yerli TOC159 içeren kompleksleri yayın. TEV eluate doğrudan Western blot veya TOC15910,11,15etkileşim ortaklarının tanımlamak için kütle spektrometresi tarafından çözümlenebilir. Yöntem da TOC15915translasyonel modifikasyonlar tanımlamak için kullanılmıştır. Gelecekte, yerel TOC159 içeren kompleksleri Kriyoelektron mikroskopisi kullanılarak yapısal çalışmalar için kullanılır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlanması Arabidopsis bitkiler

  1. Murashige ve Skoog (MS) Orta dahil vitamin % 1 sükroz ile yarım güç 1 L hazırlamak ve pH 5.7 ile potasyum hidroksit (KOH) için ayarlayın. Phytoagar ve otoklav 20 dk için %0,8 120 ° C'de Ekle
  2. MS orta Petri tabağı başına 75 mL dökün (çapı 14,5 cm, yüksekliği 3 cm) ve katılaşma 1 h için izin verir.
  3. Ve yüzey sterilize % 0.05 (v/v) içeren % 70 (v/v) etanol ile Triton X-100 5 min için %100 tarafından takip (v/v) etanol 10 dakika süreyle kaldırmak etanol Arabidopsis thaliana tohumların 30 mg 1.5 mL microfuge tüp için ekleyin.
  4. Tohum kurutma için steril filtre kağıdı aktarın. Sterilize edilmiş tohumlar eşit olarak (her genotip en az 8-10 tabak gerektirir) MS tabakta üzerine serpin ve cerrahi bant ile her plaka mühür.
  5. 4 ° C'de plakaları tohum çimlenme eşitlemek için karanlıkta iki gün kuluçkaya. Bir büyüme odası ile aşağıdaki ışık-siklet transfer: 120 µmol m−2 s– 1 ışık 8 h ve 22-20 ° C'de karanlık 16 h

2. HsIgG özel boncuk hazırlanması

  1. CNBr-harekete geçirmek özel boncuk (4 g) 100 mL 1 mM HCl askıya alma ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
  2. Özel boncuk Sinterlenmiş cam filtre içine aktarmak, 100 mL 100 mm HCl ile vakum altında yıkayın ve 2 - 3 kez tekrarlayın.
    Not: 4 ° c yıkama çözüm Precool
  3. Özel boncuk soğuk 100 mM HCl 1 ml ve 50 mL konik santrifüj tüpü transfer resuspend. Sinterlenmiş Cam Filtre 3 mL 100 mM HCl ile yıkayın ve aynı tüp sıvı transfer.
  4. 400 × g 4 ° C'de 5 min için de spin ve süpernatant bir pipet ile kaldırın.
    Not: tüp dikkatle boşaltmak değil.
  5. Boncuk resuspend 50 mL kaplin arabellek (Tablo 1); kısa bir süre karıştırın ve sonra 400 × g 4 ° C'de 5 min için de spin
  6. Kaplin arabellek 10 mL 50 mg liyofilize Homo sapiens IgG (Hs-IgG) dağıtılması, Özel boncuk hafifçe karıştırın ve bir gecede 4 ° C'de döner Shaker kuluçkaya
  7. 400 × g 4 ° C'de 5 min için de spin ve süpernatant bir pipet ile kaldırın.
  8. IgG-özel boncuk tampon ve 400 × g 4 ° C'de 5 min için spin kaplin 50 mL ile yıkayın
  9. 400 × g 4 ° C'de 5 min için de 50 mL engelleme arabellek (Tablo 1) ve spin ile IgG-özel boncuk resuspend Bir kez yinelenir.
  10. IgG-özel boncuk engelleme arabellek 50 mL resuspend, RT, 2 h ve 400 × g 4 ° C'de 5 min için spin için karışım döndürün
  11. Süpernatant kaldırmak ve IgG-özel boncuk resuspend 200 mL NaCl kaplin arabellek (Tablo 1).
  12. Kalan cross-linking CNBr gruplarda engellemek için IgG-özel boncuk 100 mL 0.1 M glisin-HCL, pH 2.8 ile yıkayın. 400 × g 4 ° C'de 5 min için de spin ve süpernatant kaldırın. 0.2 M glisin-HCl, pH 2.8, 400 × g 4 ° C'de 5 min için spin ile yıkama ve süpernatant kaldırın. Son olarak, IgG-özel boncuk 200 mL Ultrasaf Su ile yıkayın.
  13. IgG-özel boncuk Ultrasaf Su 200 mL ve sonra PBS arabellek (Tablo 1) 200 mL ile yıkayın.
  14. PBS arabellek % 0,01 NaN3 (sodyum azid) ile 20 ml IgG-özel boncuk resuspend ve 4 ° C'de depolayın

3. izolasyon ve Solubilization membran fraksiyonunun

  1. Üç haftalık A. thaliana fidan sıvı azot bir soğuk harç ve havaneli ile kum kullanarak 10 g eziyet.
  2. 20 mL soğuk arabellek (Tablo 1) 10 g için zemin doku bileme ekleyin, karıştırın ve buz çözme.
  3. Homogenate iki kat hızlı filtrasyon malzemesi ile 50 mL konik santrifüj tüpüne filtre. Arabellek filtrasyon önce zımpara ile hızlı filtrasyon malzemesi emmek.
  4. Santrifüj filtrate 1500 × g 4 ° C ve soğutulmuş 50 mL konik santrifüj tüpü süpernatant transferi de 10 dakika için tekrar aynı bir kez daha adım ve süpernatant toplamak. "Toplam kesir" 200 µL örneği korumak ve daha sonraki analizler için-80 ° C'de depolayın
  5. Süpernatant soğuk 38,50 mL ultracentrifuge tüpler için transfer ve 35 mL soğuk taşlama arabellek ile top. Santrifüj 100.000 × g bir ultracentrifuge 4 ° C'de 1 h için.
  6. Süpernatant 50 mL konik santrifüj tüpü aktarın. "Çözünür kesir" ve-80 ° C daha sonraki analizler için mağazada 200 µL örneği korur.
  7. Bir cam teflon homogenizer taşlama bir arabellek kullanarak yeşil Pelet yeniden askıya alma. 100.000 × g bir ultracentrifuge 4 ° C'de 1 h için santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  8. Yeşil Pelet 18.75 ml cam teflon homogenizer kullanarak arabellek taşlama x 1 resuspend ve 1 x arabellek taşlama 9.375 mL ekleyin.
  9. 37,5 mL vermek ve üzerinde bir "dönen shaker" 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 9.375 mL (TX-100 deterjan içeren) 4 x solubilisation çözeltisi (Tablo 1) Ekle
  10. Santrifüj 100.000 × g bir ultracentrifuge 4 ° C'de 1 h için. Süpernatant 50 mL konik santrifüj tüpü aktarın. (Future "yük kesir") süpernatant ve mağaza-80 ° c daha sonraki analizler için 200 µL örneği korur.
  11. Pelet arabellek taşlama 37,5 mL içinde resuspend. Örnek çözünmez bölümü ve mağaza-80 ° C'de muhafaza

4. Immunoprecipitation

  1. 100 µL Paketli IgG-özel reçine (Tablo 1) arabelleği A ve 100 × g 4 ° C'de 5 min için spin equilibrate
  2. Süpernatant kaldırmak ve arabellek A 4 ° C'de 100 µL IgG-özel reçine resuspend
  3. Yıkanmış IgG-özel reçine çözündürüldükten membranlar için 37,5 mL aktarmak ve gecede 50 mL konik santrifüj tüpü 4 ° C'de dönen bir shaker üzerinde kuluçkaya
  4. Tortu IgG-özel 100 × g 4 ° C'de 5 min için de reçine ve süpernatant bir pipet ile kaldırın. "Akış" 200 µL örneği korumak ve daha sonraki analizler için-80 ° C'de depolayın.
  5. IgG-özel reçine 37,5 mL arabellek A yıkama ve dönen bir shaker üzerinde 10 min için kuluçkaya.
  6. Tortu IgG-özel reçine 100 × g 4 ° C'de 5 min için de süpernatant bir pipet ile kaldırmak, arabellek A 15 mL santrifüj tüpü ve santrifüj 100 × g, 4 ° C, 5 dk. devam etsin de öğütme 5 mL "Wash 1" 200 µL örneği ekleyin ve-80 ° C'de depolayın daha sonraki analizler için.
  7. 5 adım üç kez arabelleği A. ile yıkama mL yineleyin
  8. Son iki çamaşır adımı inhibitörleri (NaF, proteaz inhibitörü ve PMSF) olmadan gerçekleştirmek
    Not: İnhibitörleri artık bu aşamada gerekli ve maliyetini azaltmak için ihmal. Son yıkama adım "son yıkama (W6)" ve-80 ° C daha sonraki analizler için mağazada 200 µL örneği korur.
  9. IgG-özel reçine 35 µm filtre ile bir 500 µL spin sütuna aktarmak ve (AcTEV içeren değil) denge 300 µL TEV elüsyon arabelleği (Tablo 1) ile iki kez boncuk yıkayın. Spin sütun kapatın.
  10. TEV elüsyon arabelleği 50 adet (10 µL) AcTEV içeren 300 µL ekleyin. Bir tüp karışımda reçine için eklemeden önce hazırlayın.
  11. Bir thermomixer 16 ° C'de boncuklar ile spin sütun kuluçkaya, 350 rpm 2 h. için sütun yavaşça tersine çevirin birkaç kez her 30 dakika.
  12. Spin sütun açmak, yeni temiz 1.5 mL tüp ve 100 × g 4 ° C'de eluate toplamak için 5 min için spin yeri.
  13. (Örneğin) yüzde 10'u (v/v) bir santrifüj evaporatör eluted örnek (~ 25 µL) Kuru ve kütle spektrometresi veya diğer daha fazla çözümleme için kullanın.
  14. Aliquot kalan eluate (~ 275 µL) onbir 1,5 mL santrifüj tüpleri (25 µL her), bir santrifüj evaporatör kuru ve-80 ° C'de depolamak için bölünmüş
  15. SDS-sayfa immunoblotting tarafından izlenen standart prosedür yanı sıra eluates muhafaza örnekleri analiz. İçin numune hazırlama, acele 50 µg toplam (T), yükleme (L), (FT), ile akışı yıkayın 1 (W1) ve yıkama 6 (W6) kloroform/metanol ayıklama16tarafından 200 µL.
  16. 2 x SDS-sayfa yükleme arabelleğe (Tablo 1) zarlarını örnekleri 10 µL ve eluted kurutulmuş örnek 25 µL ekleyin. Girdap ve ısı blok 95 ° C'de 10 dakika kaynatın.
  17. Analiz toplam (T), yükleme (L), (FT) ile akışı, yıkama 1 (W1), yıkama 6 (W6) ve (E) elüsyon yalıtım yordamı verimliliğini belirlemek için anti-TOC159 antikorları kullanarak immunoblotting tarafından.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz burada bir dokunun öğesini kloroplast zarf protein kompleksi transgenik A. thaliana arıtma için bir protokol açıklanan bitkiler. Şekil 1içindeAgösterildiği gibi bitkilerin 35S:NTAP ifade-TOC159 yapı 35S:NTAP yapı ifade bitkiler bir denetim olarak kullanılan iken bu karmaşık izole etmek için kullanılmıştır. Resim 1 B musluk-TOC159 protein kompleksleri etkileşen proteinler tanımlaması izin vermek için kütle spektrometresi tarafından takip arınma ayrıntılı adımları gösterir. İmmunoblot Analizi (Şekil 2, sağ tarafta) izole musluk-TOC159 TOC75 ve TOC33 TOC kompleks ile etkileşim onaylar. Kloroplast dış membran kinaz KOC1 da musluk-TOC159 kompleksi (Şekil 2B, sağ tarafı) ile birlikte izole TOC159 fazdan bilinmektedir. TIC110 varlığını ortaya koymaktadır izole musluk-TOC159 kompleksi TIC kompleks bileşenleri de içerir. Protein alma için alakasız bir plastoglobule protein karşı kaldırdı FBN1A antikor contaminations yokluğu gösteren musluk-TOC159 kompleksi tanımadı. Negatif kontrol immunoprecipitated NTAP protein herhangi bir TOC-TIC proteinler (Şekil 2,) sol tarafta ile birlikte izole değil ve musluk-TOC159 arıtma özgüllük onaylar.

figure-results-1
Resim 1 . Yapıları uyduruk benzeşme arıtma yordam. (A). 35S:NTAP-yapı, NTAP-TOC159 kodlama yapıldı stabil TOC159 ifade Arabidopsis thaliana. Negatif Kontrol tertibatları dokunun-etiketi tek başına kodlama 35S:NTAP yapı dile getirdi. (B). membran izolasyon ve solubilization, IgG özel IMMUNO-arıtma, yıkar, TEV proteaz bölünme ve elüsyon adım bilge benzeşme arıtma Protokolü oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Resim 2 . Tandem benzeşme arıtma TOC159 protein. N-ölümcül dokunun öğesini TOC159 NTAP-TOC15 saf:ppi2 Arabidopsis bitki ve dokunun dokunun: WT bitkilerden saf protein bir negatif kontrol kullanıldı. Toplam protein çözündürüldükten özleri (T), membran proteinlerinin = yük kesir (L), (FT), ile akışı ilk ve son yıkama kesirler (W1 ve W6) ve TEV eluate yüzde 10'u Western blot tarafından analiz. Membran ile TOC159 karşı antikor probed (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) ve FBN1A (AT4G04020). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo arabellekleri
Arabellek kaplinNaHCO3
Ayarlamak için pH 8,5 pH 0,1 M Na2CO3 ile ayarlayın. 		100 mM
 
Arabellek engellemeTris-HCl
PH 8 HCl ile için ayarlayın.		100 mM
 
PBS arabellekNa2HPO4
KH2PO4
NaCl
KCl
HCl ile pH 7,3 için ayarlayın.		4.3 mM
1.4 mM
137
2.7
 
NaCl arabellek kaplinKaplin arabellek
NaCl		 
1 M
Arabellek taşlama x 2Tris-HCl, pH 7.5 HCl ile.
NaCl
NaF
PMSF
Bitki proteaz inhibitörü kokteyl		100 mM
200 mM
5 mM
1 mM
%0,20
4 x solubilisation çözümGliserol
Triton-X100		% 40
% 3
Arabellek A 
Arabellek taşlama x 2
Arabellek taşlama x 1
4 x solubilisation çözüm		100 ml
50 ml
25 ml
% 25
TEV elüsyon arabellekTris-HCl, pH 8 HCl ile
EDTA, pH 8 HCl ile
NaCl
Gliserol
Triton-X100
DTT		50 mM
0,5 mM
100 mM
% 10
% 0.75
1 mM
2 x SDS-sayfa yükleme tamponTris-HCl pH 6.8 HCl ile
SDS
Gliserol
Bromophenol mavi
DTT		0,1 M
%4
% 20
%0,20
0,2 M

Tablo 1. Arabellek tarifleri.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek adım dokunun etiketi arıtma Arabidopsis TOC-TIC kompleks arıtma belirli ve verimli bir yöntem olduğunu gösterdi. MUSLUK-etiket iki ardışık arıtma adım (IgG-calmodulin benzeşme arıtma TEV proteaz-bölünme sonra ardından) izin verecek olsa da, birçok durumda TEV proteaz bölünme tarafından takip ilk benzeşme adım yeterli olacağına inanıyoruz. Hedefimiz, TOC159, bol düşük ve ikinci calmodulin-benzeşme adım eklenmesi aşırı bizim mevcut iletişim kuralından dışlamak için ana sebebi protein verim azalmış olduğunu. TEV-elüsyon kendi içinde özellikle IgG reçine yapışmasını proteinler kirletici orada kalacaktır süre yalnızca ilişkili etkileşim ortakları ile birlikte dokunun öğesini hedef yayınlayacak bir son derece özel ve nazik arıtma adımdır. Böylece, IgG-benzeşme adım ile birlikte, bizim ve muhtemelen diğerleri amaçlar için yeterince verimli bir saflaştırma TEV elüsyon sonuçlanır.

DOKUNUN öğesini yapı tamamen işlevsel içinde vivoolduğunu bakım alınması gerekir. DOKUNUN etiketleme protein etkinlik, istikrar veya yerelleştirme potansiyel olarak zararlı etkileri olabilir. Üç etki alanı, N-terminal asidik etki alanı, merkezi GTP-bağlayıcı etki ve dış kloroplast membran2' TOC159 tutturur C-terminal membran etki alanı, TOC159 oluşur. Membran ekleme ile potansiyel bir girişimi engellemek için musluk-etiket TOC159, N-terminus için erimiş. N-terminus Fusion daha doğrusu kural daha istisnadır. Çoğu protein N-terminal hedefleme bilgisini içeren ve bu nedenle tarafından etiketli C-terminus adlı. Biz TOC159 işlevsel vivo uluslara ppi2 mutant (bir albino mutant TOC159 eksik) tarafından musluk-TOC159 ile güvence verdi. Yeşil kurtarma, vahşi türü fenotip musluk-TOC159 fonksiyonel15olduğunu ima etti.

TOC159, KOC1 ve TIC5610,11dahil yeni etkileşim ortaklarının tanımlamak için kullanılan arıtma protokol. Toplamda, yaklaşık 30 proteinler bu yeni etkileşim ortakları izole ve yakın bir gelecekte karakterize düşündüren kompleksi ile ilişkili bulunmuştur. MUSLUK-etiket kompleksi arıtma öneririz iken, biz hala burada sunulan bir ek sürümleri var ve bazı uygulamalar için çok yararlı olabilir işaret etmek istiyorum.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İş hibe İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_156998 ve 31003A_176191) ve Neuchâtel Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
NaHCO3PanReac  AppliChemA0384
TrisBiosolve0020092391BS
Na2HPO4SigmaS7909
KH2PO4PanReac  AppliChemA2946
NaClPanReac  AppliChemA2942
NaFSigmaS1509Toksik
PMSFPanReac  AppliChemA0999Toksik
Bitki proteaz inhibitörü kokteyliSigmaP9599
GliserolPanReac  AppliChemA0970
Triton X100Roche10789704001
GlisinPanReac  AppliChemA1067
EDTACarl Roth8043
Dithiothreitol (DTT)PanReac  AppliChemA1101
SDSPanReac  AppliChemA0675
Bromofenol mavisiSigmaB0126
HClVWR20252-290Aşındırıcı
SükrozPanReac  AppliChemA3935
Murashige ve Skoog ortamı vitaminliDuchefa BiochemieM0222
PhytoagarDuchefa BiochemieP1003
Petri plakasıGreiner Bio-one639102
1.5 mL mikrofüj tüpleriSarstedt72.706
EtanolFisher kimyasalE/0600DF/15
Filtre kağıdı Whatman10311804
Cerrahi bant3M1530-1
CNBr ile Aktive edilen agaroz boncuklar (sefaroz 4B)GE Healthcare17-0430-01
Sinterlenmiş cam filtreDURAN2515703
Santrifüj tüpü 50 mLTPP91050
Saflaştırılmış immünoglobulin G (HsIgG)MP Biyomedikal855908
Döner çalkalayıcıIKA4016000
NaN3 (sodyum azid)Sigma71290Toksik
Hızlı filtrasyon malzemesi (Miracloth)Merk-Millipore475855
Ultracentrifube XNP-80Beckman CoulterA99839
Rotor SW 32 TiBeckman Coulter369650
Ultrasantrifüj tüpleriBeckman Coulter326823
Cam teflon homojenizatör (Potter)Wheaton357426
Spin sütunu (Mobicol)Mo Bi TecM1003
Filtre 35 & mikro; spin sütunu için m (Mobicol)Mo Bi TecM513515
AcTEVInvitrogen12575-015
Santrifüj evaporatör (Speed Vac)Eppendorf5305000100
FBN1A(PGL35) antikoruAgriSeraAS06 116RRID:AB_2247012
Kum, FontainebleauVWR27460.295

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., López-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Kessler, F., Schnell, D. Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus. Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).
  3. Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. Isolation of components of the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).
  4. Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).
  5. Jarvis, P., et al. An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science. 282 (5386), 100-103 (1998).
  6. Bauer, J., et al. Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane. The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).
  7. Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation. Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).
  8. Nakai, M. The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts. Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).
  9. Kikuchi, S., et al. Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane. Science. 339 (6119), 571-574 (2013).
  10. Kohler, D., et al. Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts. Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).
  11. Zufferey, M., et al. The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery. The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).
  12. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  13. Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants. The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).
  14. Rohila, J. S., et al. Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice. PloS one. 4 (8), 6685(2009).
  15. Agne, B., et al. The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein. Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).
  16. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Chloroplast TransloconTOC TIC ComplexesTAP Tag PurificationAffinity PurificationMembrane SolubilizationIgG Beads IncubationTEV Protease ElutionWestern Blot AnalysisMass Spectrometry IdentificationArabidopsis Thaliana

İlgili makaleler