Antikor aracılıklı Tau izni Microglia tarafından eğitim için tahlil hücre tabanlı

Alzheimer hastalığı (Ah) konformasyonal değişim ve kendinden montajlı amiloid Beta peptid ve tau protein patolojik toplamları ile karakterize bir ilerici nörodejeneratif durumdur. Anormal derecede fosforile tau reaksiyonlar ve neurofibrillary düğüm^1,2biriken iken normal çözünür amiloid Beta peptid oligomeric ve fibriler amiloid β dönüştürülür. Bu protein toplamları hafıza kaybı ve sonraki ilerici bilişsel gerileme için önde gelen nöronal ölüme neden. Üretken olmayan neuroinflammation ve misfolded proteinler, temizlemek için azaltılmış bir yeteneği de dahil olmak üzere diğer faktörler, azdırmak ve hastalık hızlandırmak. Şu anda, müdahale stratejilerinin reklam karşı büyük ölçüde semptomatik rahatlama sağlar, ama hiçbir hastalığı değiştirme tedavisi veya önleme.

Kanıt artan önemli bir rol hyperphosphorylated tau toplamları içinde reklam patoloji göstermektedir. Patolojik olmayan haliyle tau mikrotübüller için bağlar ve nöronal sitoiskeleti onların derlemeye yerli gelişeceğini bir proteindir. Tau hyperphosphorylated olduğunda, sitoiskeleti ayırır ve içine hangi reklam³ile ilişkili patoloji çoğunu neden inanılıyor tau toplamları nöron kümeleri. İlk intracellularly biriken tau başlar toplanan, ancak hastalık ilerledikçe etkilenen neurons ekstrasellüler alana hangi o-ebilmek alınmak bitişik veya synaptically bağlı sağlıklı nöronlarda tarafından yayımlanması için kabul edilir bir " deli dana benzeri şekilde". İçselleştirilmiş bir kez tau toplamak daha fazla tau toplama yolu ile şablonu esas alan konformasyonal değişim⁴neden olmaktadır.

Bu varsayıma göre tedaviler tau tohum kesintiye uğratmasını yetenekli yavaşlatmak veya tau-aracılı nörodejeneratif hastalık seyri ters. Bu destek, azaltılmış tau patoloji ve geliştirilmiş bilişsel işlev^{5,6,7,8 genetik mutasyon tauopathy için duyarlı yapılır ve pasif Anti-tau antikorlar ile enjekte fareler gösterir ,9}. Ancak, hangi tarafından patoloji terapötik antikorlar azaltmak mekanizmaları hala zor kalır.

Önerilen mekanizmaları antikor aracılıklı alımı ve gümrükleme tau microglia, beynin yerleşik bağışıklık hücreleri tarafından patolojik toplanan formları biridir. Son yayınlar microglia verimli bir şekilde içselleştirmesi ve patolojik tau türler bozulmasına yol açar ve bu yeteneği yüzeyinde ifade Fc reseptörü içeren anti-tau antikorlar ile Fc bağımlı mekanizma tarafından geliştirilmiş öneririm fagositoz^10,11microglia ve reseptör aracılı. Bu veri microglia terapötik antikorlar potansiyel olarak önemli effectors tanımlayın.

Biz burada nicelik tau alımı microglia tarafından değerlendirmek için bir hücre tabanlı tahlil tanımlamak. Bu tahlil ile oluşturulan veri eylem böylece Anti-tau antikorlar gelişimleri potansiyel reklam tedavi olarak daha fazla adımlardan geçmek için yararlı bir araç temsil eden Anti-tau antikorların mekanizmaları elucidating yardımcı olabilir.

1. BV-2 hücreleri kültür

Not: Tanıtıcı BV-2 hücreleri seviye 2 koruma altında. BV-2 hücre kültürünü bir saran rekombinant ecotropic retrovirüsü (yalnızca fare hücreleri bulaşmasını yeteneğine sahip)¹²üretir; öyle virüs dönüştürme yeteneği ve in vivo tumorigenic potansiyel onların vitro için bilinir.

1. Kültür BV-2 hücreleri yüksek glikoz Dulbecco'nın % 10 fetal Sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 2 mM L-glutamin (kodlamayla aracı olarak şu andan itibaren anılacaktır) ile 4 x 10^{4 hücreleri tohum tarafından desteklenen kartal Orta (DMEM) modifiye} hücre/mL.
2. 37 ° C'de % 5 CO₂ oksijen bir atmosferde kültürleri korumak
   Not: gevşek bağlı ve süspansiyon hücreleri büyümek.

2. etiket rekombinant Tau toplamları pH duyarlı floresan boya

Not: Apetri ve ark. içinde açıklandığı gibi Tau toplamları hazırlanmıştır ¹³ ile farkı yok Thioflavin T (ThT) tepki arabelleğe eklendi. Toplanan örnekler 1,5 mL santrifüj tüplerde toplanmıştır. Son floresans sinyal havuzu örnek 118 µL 50 µM ThT eriyik 12 µL ile karıştırılarak kontrol edildi. Toplamları 20.000 x g 4 ° C'de 1 h için toplama tepki karisimin centrifuging tarafından ayrı kaldık Süpernatant monomeric tau toplamları dönüştürüldü onaylamak için sn-MALS tarafından analiz edildi. Dondurulmuş ve derin dondurucu-80 ° C'de depolanan ek granül (tau toplamları) olduğunu

1. PH 8,5 konsantrasyonu 1 mg/ml 0.1 M sodyum bikarbonat tampon (NaHCO₃) Tau toplamları resuspend (~ 20 µM).
   Not: Tau toplamları konsantrasyon ilk monomer konsantre tau monomerleri, 280 emilimini tarafından değerlendirildi gibi dayanmaktadır 0.31 mLmg^-1cm^-1bir tükenme katsayısı kullanarak nm.
2. Çok ısınmaya önlemek için buz tutarken bir sonda sonicator kullanarak resuspended toplamları solüsyon içeren temizleyicide.
   1. Bir genliği % 65 (ile sonicator güç 250 W) kullanın.
   2. 3 ve 8 darbeleri gerçekleştirmek duraklar 15 s s arasında bakliyat ısınmayı önlemek için.
3. PH-duyarlı boya üreticisinin öğretim takip dimetil sülfoksit (DMSO) (bundan sonra başvuru için pH boya olarak) bir 8,9 mM hisse senedi çözümü hazırlayın.
   Not: Her zaman taze bir çözüm hazırlamak ve sadece hazırlanan gününde kullanabilirsiniz.
4. Boya köstebek protein başına 10 mol 0.2 mM son boya konsantrasyon için ekleyin.
5. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.
6. 45-60 dakika oda sıcaklığında ışıktan korunan tepki karışımı kuluçkaya.
7. Bu arada, üreticinin yönergeleri sütun desalting bir çapraz bağlı dextran jel bir araya getirin.
8. Sütun 25 mL 0.1 M NaHCO₃ tampon pH 8,5 içeren %3 DMSO ile equilibrate. Aracılığıyla akış atmak.
9. 2,5 mL toplam hacmi sütununda tepki etiketleme tau agrega ürün ekleyin. Örnek daha az 2.5 mL 2.5 mL toplam hacmi elde kadar arabellek ekleyin.
10. Paketlenmiş jel tamamen girin, akışı aracılığıyla atın örnek ver.
11. 3,5 mL 0.1 M NaHCO₃ tampon pH 8,5 içeren %3 DMSO ile elute ve eluate 2 mL tüpler 4 eşdeğer kesirler toplamak.
12. 4 kesirler protein konsantrasyonları bicinchoninic asit (BCA) tahlil tarafından belirler.
13. Etiketli protein-20 ° C dondurucuda saklayın.

3. alımı tahlil ile floresan aktif hücre okuma (FACS) sıralama

1. Gün 1 – Tohum hücreleri
   1. Orta ve ekleme 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x kültür kaldırarak şişeye yıkama BV-2 hücreleri.
      Not: cilt yıkama kullanılan hücre balonun büyüklüğüne göre değişir. Örneğin, bir T175 şişesi için 10 mL 1 x PBS ile yıkayın.
   2. PBS balonun kaldır ve hücreleri tarafından kuluçka hücreleri şişeye (yaklaşık 5 dk) ayırmak kadar tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) %0,05 37 ° C ve % 5 CO₂ ile bağlantısını kesin.
      Not: % 0.05 tripsin-EDTA hacmi kullanılan cep şişesi boyutuna bağlıdır. Örneğin, bir T175 şişesi için 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA kullanın.
   3. Orta 3'e beş kez yukarı ve aşağı pipetting tarafından kültür hücreler resuspend.
      Not: Orta kültür, birim boyutu kullanılan cep şişesi ve böylece şişeye hücre toplam sayısı bağlı olarak değişir. Örneğin, bir T175 şişesi için orta kültür 8 mL kullanın.
   4. Hücreleri saymak ve 1 x 10⁵ hücre/mL kültür 200 μg/mL heparin içeren ortamda son bir konsantrasyon ile bir hücre süspansiyon oluşturun.
   5. Hücre süspansiyon kuyuda bir 96-iyi doku kültürü düz alt plaka (2. 5 x 10⁴ hücreleri), 250 µL plaka.
   6. Gecede 37 ° C ve % 5 CO₂plaka kuluçkaya.
2. Gün 1 – Immunocomplexes hazırlamak
   1. PH boya-tau buz çözme.
   2. Koşul bir 500 nM çözüm pH başına 65 μl Orta (SFM) (yüksek glikoz DMEM 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 200 µg/mL heparin ile desteklenmiş) serum-Alerjik boya-tau toplamları hazırlayın.
   3. Antikor dilutions SFM ve bir konsantrasyon içinde 65 µl çift son bir hazırlayın. PH boya-tau toplamları ve bir 96-şey u-alt plaka antikor karıştırın. Koşul başına son hacim şimdi 130 µl ve pH boya-tau toplamları konsantrasyon 250 nM. Seyreltme plaka mühür ve gece 37 ° C'de kuluçkaya
3. 2. gün-Immunocomplexes alımı
   1. Kodlamayla orta BV-2 hücreleri kaldırın. Hücreleri bir kez 100 µL oda sıcaklığında 1 x PBS ile yıkayın.
   2. İmmunocomplexes 125 µL bir çok kanallı pipet kullanarak hücreleri aktarın. İmmunocomplexes 2 h 37 ° C ve % 5 CO₂için hücrelerle kuluçkaya.
   3. Kuluçka orta hücrelerdeki kaldırmak ve o atın. Hücreleri bir kez 100 µL oda sıcaklığında 1 x PBS ile yıkayın.
   4. 1 x PBS kaldırmak ve 50 µL tripsin-EDTA %0.25 37 ° C'de 20 dk için ve % 5 hücrelerle tedavi CO_2.
   5. 200 µL kodlamayla orta ekleyin ve de yukarı ve aşağı hücreleri ayırmak için pipetting tarafından resuspend. Hücreleri bir 96-şey U-yukarıdan aşağıya doğru transfer plaka. 400 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj plaka
   6. Plaka buza koyun, iki kez 150 µL buz soğuk 1 x PBS içinde hücre granül resuspending tarafından orta ve yıkama hücre kültürü çalışmalarının kaldırın. 400 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj plaka
   7. Hücreleri buza koy, eklenen 1 x PBS ve onlar tarafından resuspending granül 150 µL soğuk FACS arabellek (1 x PBS, % 0.5 Sığır serum albumin (BSA), 2 mM EDTA) içinde hücreleri yıkama kaldırmak. 400 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj plaka
   8. Hücreleri buza koy, eklenen FACS arabellek kaldırmak ve 200 µL soğuk FACS arabellek hücrelerde resuspend.
   9. Örneklerini hemen 2 x 10⁴ olayları canlı hücreleri kapısında edinme FACS tarafından (bkz. Adım 4.1).

4. FACS Analizi

Not: Gating strateji için Şekil 1 ' e bakın.

1. İleri dağılım alanı kullanarak karşı tarafı dağılım alanı (SSC-A) yoğunluk çizim, kapı alt ileri dağılım düzeyleri (Yani, enkaz ve ölü hücreleri) olaylarla hariç tarafından canlı hücrelerde (FSC-A).
2. Canlı hücre nüfus içinde kullanmak FSC-A karşı ileri dağılım yükseklik (FSC-H) hücre birini ve toplamları dışarıda bırakmak için. Singlet kapı bu.
3. Olayları singlet kapıyı kullanarak, bir pH boya tek parametre çubuk grafik oluşturun.
4. Ortalama floresans yoğunluğunu belirlemek. BV-2 tek denetim kullanarak negatif hücreler olarak hariç tarafından pH boya-tau pozitif hücrelerinin yüzdesi, kararlı belirlemek.

5. Immunocomplexes alımını mikroskobu okuma ile

1. Gün 1 – Tohum hücreleri
   1. BV-2 hücreleri 3.1.1, 3.1.2 ve 3.1.3 adımlarda açıklandığı şekilde hazırlayın.
   2. Hücreleri saymak ve onları Orta 10⁴ hücre/mL nihai bir konsantrasyon olarak kültür resuspend.
   3. Hücre süspansiyon 150 µL plaka (1.5 x 10³) bir poli-D-lizin bir kuyu başına 96-şey siyah plaka açık düz dipli ile kaplı.
   4. 48 h 37 ° C ve % 5 CO₂ plaka kuluçkaya.
2. Gün 3-Immunocomplexes hazırlamak
   Not: Etiketli tau toplamları ile antikor, kuluçka önce hafif sonication mikroskobu sonuçlarını iyileştirmek için gerçekleştirilen.
   1. PH boya-tau buz çözme ve buz tutarken bir sonda sonicator kullanarak solüsyon içeren temizleyicide. Bir genlik % 15 (250 W sonicator güç) kullanın. 2 ve bekle 20 leri bakliyat arasında 30 darbeleri gerçekleştirmek.
   2. Koşul bir 500 nM çözüm pH boya-tau toplamları SFM başına 65 μl hazırlayın.
   3. SFM 65 µl bir konsantrasyon için seyreltik antikor son bir çift. PH boya-tau toplamları ve bir 96-şey u-alt plaka antikor karıştırın. Koşul başına son hacim şimdi 130 µl ve pH boya-tau toplamları konsantrasyon 250 nM. Seyreltme plaka mühür ve gece 37 ° C'de kuluçkaya
   4. Orta hücre plaka kaldırmak ve 150 µL 200 µg/mL heparin ile desteklenmiş kodlamayla orta yerine. Gecede 37 ° C ve % 5 CO₂plaka kuluçkaya.
3. Gün 4-Immunocomplexes alımı
   1. Kodlamayla orta BV-2 hücrelerden kaldırma. İmmunocomplexes 125 µL bir çok kanallı pipet kullanarak hücreleri aktarın.
   2. 1 saat 45 dk % 5 CO₂37 ° C'de immunocomplexes hücrelerle kuluçkaya.
      Hücre çekirdeği DNA belirli boya ve seçime bağlı olarak düşük pH hücresel kompartmanlarda lekeleri bir sonda ile asidik organelleri leke. Hücreleri % 5 CO₂37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
      Not: SFM boyalar sulandırmak.
   3. Canlı hücre eleme confocal sistemi yüksek bir içerik görüntüleme kullanarak gerçekleştirin. Sıcaklığı 37 ° C ve % 5 CO₂olarak ayarlayın. Yüksek kaliteli görüntüler, 63 X su daldırma objektif kullanın ve görüntülü alan başına 0.5 µm uçaklar (Z-yığın başına 20) elde etmek.

Toplanan rekombinant tau kovalent bir pH duyarlı yeşil boya ile etiketli. Bu boya üzerine asidik organelleri, böylece hücre içi miktar için izin onun içselleştirilmesi, floresans önemli ölçüde artırır. Etiketli tau toplamları Anti-tau monoklonal antikorlar ile inkübe. Özellikle, biz CBTAU 28,1 chimeric bir sürümünü (fare Igg1 Fc bölgesi) kullanılır. Bu insan antikoru tau N-terminal Ekle bölgesine bağlar ve oluşturulan vitro tau liflerinde13bağlamak yapabiliyor. Bu tahlil, de CBTAU-28,1-dmCBTAU-28,1 benzeşme geliştirilmiş bir sürümünü test. CBTAU-28,1, Fab parçaları ebeveyn ve yüksek-benzeşme mutant olarak biçimlendirmek ve izotip kontrol olarak kullanılan bir fare Igg1 denetler.

BV-2 hücreleri önceden biçimlendirilmiş immunocomplexes ile inkübe veya tau varlığında antikor bağımsız tau alımını engellemek için heparin iki saat yalnız toplanan. Kuluçka sonra hücreleri ekstrasellüler membran için bağlı tau kaldırmak için trypsinized ve tau alımı için akış sitometresi tarafından analiz edildi. Biz son zamanlarda13açıklandığı gibi bu CBTAU 28,1 terfi türevleri alımını tau BV-2 hücrelerdeki bir doz bağımlı şekilde görülmektedir. Alımı CBTAU-28,1 Fab parçaları bazal tau alımı (Şekil 2) artmamıştır beri aracılı Fc olduğunu. Ayrıca, yüksek benzeşme dmCBTAU 28,1 antikor BV-2 hücrelere daha vahşi tipi antikor (Şekil 2) daha yüksek bir ölçüde tau alımını aracılık.

Antikor aracılıklı tau alımı ve yerelleştirme tau toplamları endolysosomal yerde olduğunu doğruladı tarafından confocal mikroskobu (Şekil 3) nerede asidik hücresel bölmesi düşük pH organelleri için bir sonda seçici kullanarak lekeli. Yeşil pH boya ve hücre içi puncta toplamları CBTAU-28,1 ile inkübe hücrelere gözlendi tau etiketli. Ayrıca, hücre içi tau toplamları kez böylece asidik organelleri tau toplamları varlığı öne düşük pH yuvası seçici kırmızı boya ile colocalized. CBTAU-28,1 Fab parçaları yeniden bir Fc reseptör aracılı içselleştirilmesi mekanizması (Şekil 3) bildiren tau alımı artmamıştır.

Şekil 1: Akış Sitometresi Analizi tau içselleştirilmesi BV-2 hücreleri tarafından algılamak için kullanılan strateji geçişi. Örnek veriyi BV-2 tek kontrol (A-C), izotip kontrol (D-F) ve dmCBTAU-28,1 (G-ben) gösterilir. BV-2 hücre nüfus enkaz ve ölü hücreleri (A, D, G) hariç FSC-A vs SSC-A yoğunluğu arsa üzerinde geçişli. BV-2 hücreleri daha sonra daha fazla hücre birini ve toplamları (B, E, H) dışarıda bırakmak için FSC-A vs FSC-H yoğunluğu arsa üzerinde kapı. Tek hücre kapısı bir pH boya (FITC temsilcisi bu sonuçları) tek parametre çubuk grafik oluşturmak için kullanılan (C, F, ben) ve geometrik ortalama floresans yoğunluğunu belirlemek. Alternatif olarak, pH boya-tau pozitif hücrelerinin yüzdesi, BV-2 tek denetimi kullanarak belirlenen negatif hücreleri hariç hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: CBTAU-28,1 aracılık eder tau toplamları mikroglial BV-2 hücreleri içine alımını. Toplanan rekombinant tau kovalent yeşil floresans pH duyarlı boya ile etiketli ve inkübe bir fare chimeric sürümüyle insan anti-tau antikor CBTAU-28,1, kendi benzeşim gelişmiş format, dmCBTAU-28,1, karşılık gelen Fab parçaları, bir fare Igg1 izotip kontrol antikor veya hiçbir antikor (tau toplamları yalnız). Immunocomplexes daha sonra iki saat varlığında antikor bağımsız tau alımını engellemek için heparin BV-2 hücreleri ile inkübe. İmmunocomplexes alımını akış sitometresi tarafından değerlendirildi ve geometrik ortalamasını (GM) Floresan yoğunluğu(a)veya tau pozitif (tau +) yüzdesi hücreleri (B) dile getirdi. Hata Çubuklarõn (a) iki bağımsız deney'nin standart sapması, (B) gösterir tek bir deneme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Tau toplamları BV-2 hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve hücresel asidik organelleri yerelleştirilmesine. Ön şekillendirilmesi tau-antikor immunocomplexes BV-2 hücreleri ile antikor bağımsız alımını engellemek için heparin huzurunda iki saat inkübe. Kuluçka sonra çekirdekleri bir DNA belirli mavi boya ve düşük pH yuvası seçici kırmızı boya ile asidik hücresel yuvası ile lekeli. Canlı hücre görüntüleme etiketli tau toplamları (yeşil) CBTAU-28,1 ve dmCBTAU 28,1, ancak değil izotip kontrol inkübe hücrelere hücre içi puncta ortaya koydu. Ayrıca, hücre içi tau toplamları kez kırmızı ile colocalized (böylece tau toplamları asidik hücresel yerde varlığını düşündüren sarı) boya. CBTAU-28,1 Fab parçaları bir Fc reseptör aracılı içselleştirilmesi mekanizması gösteren tau alımı artmamıştır. Görüntüleri bir 63 X su daldırma amacı ile alınan en fazla yoğunluk projeksiyonlar 20 uçak Z-yığın (0.5 µm uçakları) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.