Kültür Drosophila Egg Chambers Time-Lapse filmler kullanarak yerel hücresel ve doku ölçeklerde Actomyosin dinamikleri Analizi

Özet

Bu protokol, tek hücrelerde ve kavisli epitelyal dokularda akomyosin davranışlarını nasıl güvenilir bir şekilde analiz ettiğini açıklayan basit yönergelerle birlikte Fiji tabanlı, Kullanıcı dostu bir metodoloji sunar. Öğretici izlemek için hiçbir programlama becerileri gereklidir; tüm adımlar Fiji grafik kullanıcı arayüzü ve ilişkili eklentileri kullanarak yarı interaktif bir şekilde gerçekleştirilir.

Özet

Drosophila olgunlaşmamış Yumurtalar yumurta odaları denir ve onların yapısı geliştirme sırasında bir elipsoid şekle bir turda morfolojik değişiklikler geçmesi ilkel organlar benzer. Bu gelişimsel süreç oogenesis denir ve bir sonraki sinek nesil güvenli fonksiyonel Olgun yumurta üretmek için çok önemlidir. Bu nedenlerden dolayı, yumurta odaları hayvan organı gelişimini anlamak için ideal ve ilgili bir model olarak hizmet vermiştir.

Çeşitli in vitro kültür protokolleri geliştirilmiştir, ancak bu protokoller için çeşitli dezavantajları vardır. Biri, onları hareketsiz ve analiz yumurta odalarının çevresel yüzeyinin görüntülenmiş edinme düzlemini artırmak için görüntülenmiş yumurta odalarında yapay bir basınç sağlayan çeşitli kapakları uygulama içerir. Böyle bir yaklaşım, uzun eksenleri etrafında yumurta odaları döndürmek için güç üreten ince akomyosin makinenin davranışını olumsuz etkileyebilir.

Böylece, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, yumurta odalarının çevresi boyunca akomyosin makinelerini güvenilir bir şekilde analiz etmek amacıyla medyada serbestçe Drosophila Egg Chambers kültürü sunuyoruz. Protokolün ilk bölümünde, yerel hücresel ölçekte (15 hücreye kadar) sınırlı bir satın alma düzleminde aktomiozin makinelerini nasıl analiz edebileceğiz hakkında ayrıntılı bir kılavuz sağlıyoruz. Protokol ikinci bölümünde, biz yumurta odaları ' çevresel yüzey tanımlanmış bir ince tabaka basit ekstraksiyon sağlayan yeni bir Fiji tabanlı eklentisi ile kullanıcılara sağlar. Aşağıdaki protokol daha sonra doku ölçeğinde (> 50 hücre) akomyosin sinyallerinin nasıl çözümleneceğini açıklar. Son olarak, bu yaklaşımların kısıtlamalarını hem yerel hücresel hem de doku ölçeklerde tespit ediyoruz ve potansiyel gelecekteki gelişimini ve olası uygulamalarını tartışıyoruz.

Giriş

Yeni görüntüleme ve yazılım teknolojilerinin yaşam bilimleri uygulamalarında sürekli gelişimi, yaşamın temel ilkelerini anlamakta büyük bir etki sağladı. Ana zorluklardan biri, çeşitli dokularda canlı görüntüleme ile birlikte gelişimsel süreçlerin güvenilir bir şekilde görselleştirilmesi. Dokular organlar ve organları ve bu nedenle, çoğunluğu kolayca görüntüleme için erişilebilir değildir. Bu nedenle, kendi diseksiyon ve in vitro kültür izin protokolleri yeterince canlı bir vücut içinde in vivo durumu yansıtmak biyolojik olayları görselleştirmek için geliştirilmiştir.

Geçtiğimiz yıllarda, Drosophila yumurta odalarının kültür ve can....

Protokol

Not: Aşağıdaki protokol, yerel hücresel ve Drosophila yumurta odalarında doku ölçeği aktomiozin analiz talimatları sağlar. Yerel ölçekli yaklaşım, kullanıcıların yumurta odasına göre 15 hücreye kadar ayrıntılı akomyosin davranışını analiz etmelerini sağlar ve yüksek hızlı görüntüleme ve ters bir Konfokal mikroskop kullanarak kısa bir süre için (5 – 10 dakika) TLMs satın almayı gerektirir. Buna karşılık, doku ölçeği 50 – 100 hücrelerde aktomiozin bilgi sağlar ve düşük hızlı görüntüleme ve ters dönen disk mikroskop kullanarak uzun bir süre (≥ 30 dk) için tlms edinme gerektirir (bkz. Şekil 2 ve Tablo 1

Sonuçlar

Bu protokol bilim adamlarının epitel dokularda akomyosin ağlarının davranışlarını araştırmasını sağlar. Bu sadece yerel hücresel ölçekte (birkaç hücre) aktomiozin davranışının ayrıntılı bir analizi doku ölçeği (birçok hücre) benzer bir analiz ile birleştirildiğinde mümkündür. Ancak, epitelyal dokular genellikle kavisli ve bu dokuların ince bir tabaka çıkarma daha önce kolayca mümkün değildi, Drosophila yumurta odalarında gösterildiği gibi (Şekil 1). .......

Tartışma

Yumurta odalarının diseksiyonu ve kültürü için kritik adımlar ve sorun giderme

Eğer çok fazla sinekler küçük bir şişeye yerleştirilir, sinek gıda 2 – 3 gün sonra büyük miktarlarda besleme larvaları ve yetişkin sinek gıda sıkışıp almak sinek nedeniyle çamurlu açabilirsiniz. Böyle bir durumda, bu sineklerin geri kalanını taze yiyeceklerle yeni bir şişeye çevirin ve sayısını küçültür. Özellikle, gıda sıkışmış kadın hariç.

Schneider karışımı (SM) öncede.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Schneider Orta	Gibco	21720-024	[+] -Glutamin
Penisilin / Streptomisin	Gibco	15140-122	[ +] 10.000 Ünite/mL Penisilin [+] 10.000 &mikro; g / mL Streptomisin
Fetal Sığır Serumu	Sigma	ve nbsp; F135	Isı ile İnaktive
Edilmiş İnsülin Çözeltisi İnsan	Sigma	I9278
50 mL Falcon tüpleri	Eppendorf		steril
Millex-GV filtresi	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Cam Tabanlı Mikro Kuyu Tabakları	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri kabı, 14 mm Microwell, No. 1.5 kapak camı
Forseps	A. Dumont & Filler		#55
CellMask Deep Red (hücre zarı boyası)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (hücre zarı boyası)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depresyon diseksiyon slaydı	Fisher Scientific	12-560B
Mikroskobik ekipman
Steromikroskop	Ör. Zeiss		Stemi SV 6
Ters konfokal mikroskop	örneğin Zeiss/Olympus
Eğirme diski mikroskobu	örneğin Zeiss/Andor
Mikroskobik cam/kapak camı	, örneğin Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus aleti
Wironit iğne tutucu	Hammacher	9160020
Kaktüs omurgası	Echinocactus grusonii/fıçı kaktüs
Drosophila el yazmasında kullanılan stoklar
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			Ayrıntılar için bakınız Rauzi ve ark.: Düzlemsel polarize aktomiyosin kasılma akışları, epitelyal kavşağın yeniden şekillenmesini kontrol eder. Doğa 2010, Cilt 468, sf. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C<>			Ayrıntılar için bakınız Viktorinova et al.: Epitel rotasyonundan önce aktomiyosinin düzlemsel simetri kırılması gelir ve epitel dokusunu hücre deformasyonlarından korur. PLoS Genetics 2017, Cilt 13, Sayı 11, sf. e1007107.