Yöntem makalesi

Kültür Drosophila Egg Chambers Time-Lapse filmler kullanarak yerel hücresel ve doku ölçeklerde Actomyosin dinamikleri Analizi

DOI:

10.3791/58587

⸱

3 Haziran 2019

 ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2Center for Systems Biology Dresden

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, tek hücrelerde ve kavisli epitelyal dokularda akomyosin davranışlarını nasıl güvenilir bir şekilde analiz ettiğini açıklayan basit yönergelerle birlikte Fiji tabanlı, Kullanıcı dostu bir metodoloji sunar. Öğretici izlemek için hiçbir programlama becerileri gereklidir; tüm adımlar Fiji grafik kullanıcı arayüzü ve ilişkili eklentileri kullanarak yarı interaktif bir şekilde gerçekleştirilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila olgunlaşmamış Yumurtalar yumurta odaları denir ve onların yapısı geliştirme sırasında bir elipsoid şekle bir turda morfolojik değişiklikler geçmesi ilkel organlar benzer. Bu gelişimsel süreç oogenesis denir ve bir sonraki sinek nesil güvenli fonksiyonel Olgun yumurta üretmek için çok önemlidir. Bu nedenlerden dolayı, yumurta odaları hayvan organı gelişimini anlamak için ideal ve ilgili bir model olarak hizmet vermiştir.

Çeşitli in vitro kültür protokolleri geliştirilmiştir, ancak bu protokoller için çeşitli dezavantajları vardır. Biri, onları hareketsiz ve analiz yumurta odalarının çevresel yüzeyinin görüntülenmiş edinme düzlemini artırmak için görüntülenmiş yumurta odalarında yapay bir basınç sağlayan çeşitli kapakları uygulama içerir. Böyle bir yaklaşım, uzun eksenleri etrafında yumurta odaları döndürmek için güç üreten ince akomyosin makinenin davranışını olumsuz etkileyebilir.

Böylece, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, yumurta odalarının çevresi boyunca akomyosin makinelerini güvenilir bir şekilde analiz etmek amacıyla medyada serbestçe Drosophila Egg Chambers kültürü sunuyoruz. Protokolün ilk bölümünde, yerel hücresel ölçekte (15 hücreye kadar) sınırlı bir satın alma düzleminde aktomiozin makinelerini nasıl analiz edebileceğiz hakkında ayrıntılı bir kılavuz sağlıyoruz. Protokol ikinci bölümünde, biz yumurta odaları ' çevresel yüzey tanımlanmış bir ince tabaka basit ekstraksiyon sağlayan yeni bir Fiji tabanlı eklentisi ile kullanıcılara sağlar. Aşağıdaki protokol daha sonra doku ölçeğinde (> 50 hücre) akomyosin sinyallerinin nasıl çözümleneceğini açıklar. Son olarak, bu yaklaşımların kısıtlamalarını hem yerel hücresel hem de doku ölçeklerde tespit ediyoruz ve potansiyel gelecekteki gelişimini ve olası uygulamalarını tartışıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni görüntüleme ve yazılım teknolojilerinin yaşam bilimleri uygulamalarında sürekli gelişimi, yaşamın temel ilkelerini anlamakta büyük bir etki sağladı. Ana zorluklardan biri, çeşitli dokularda canlı görüntüleme ile birlikte gelişimsel süreçlerin güvenilir bir şekilde görselleştirilmesi. Dokular organlar ve organları ve bu nedenle, çoğunluğu kolayca görüntüleme için erişilebilir değildir. Bu nedenle, kendi diseksiyon ve in vitro kültür izin protokolleri yeterince canlı bir vücut içinde in vivo durumu yansıtmak biyolojik olayları görselleştirmek için geliştirilmiştir.

Geçtiğimiz yıllarda, Drosophila yumurta odalarının kültür ve canlı görüntülemesinde, ilkel organlara benzeyen acinar benzeri yapıların, ilkel organ gelişimi temel prensiplerinin anlayışına son derece katkı sağladı1 , 2 , 3. Şu anda, mevcut çeşitli kültür protokolleri vardır, ve kullanımı edinme süresi bağlıdır, hücre türü görüntülenmiş olması, ve onların Erişilebilirlik (örn., iç germline vs dış somatik hattı)4.

Tüm bu kültür protokollerinde ortak bir özellik sıvı medyada yüksek kontril aktivite gösteren analiz yumurta odaları immobilizasyon için ihtiyaç vardır. Yumurta odaları kontril aktivite bağlı yumurta odaları uzun bir dize kapsayan kas levha ağırlıklı olarak neden olur5,6,7. Bu nedenle, Genç yumurta odalarının düzgün immobilizasyonu elde etmek için, çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir, Cover,6,8,9 veya esnek battaniye 4 ile yumurta odaları kapsayan içeren, 10 veya düşük erime noktası agaroz3,11içine katıştırma. Aynı zamanda yumurta odalarının çevresel yüzeyinin ince düzleştirme nedeniyle daha büyük bir görsel düzlem görüntüleme izin olarak bu yaklaşımlar popülerdir.

Ancak, son zamanlarda, bu genç yumurta odaları (Aşama 1-8) onların anterior-posterior eksen etrafında döndürmek gösterilmiştir6 ve bu doku hareketi bu genç yumurta odalarının çevresel yüzeyine yakın ince bir aktomiozin ağ tarafından desteklenmektedir olduğunu 12. bu nedenle, bu doku ince bir düzleştirme neden hücresel yüzey yapay değişiklik kuvvet üreten aktomiozin makine davranışı üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir. Kontrpuan, yumurta odası dokusu düzleştirilmiş değilse, yumurta odalarının çevresel yüzeyinde proteinlerin mikroskobik görüntüleme daha da satın uçak azalan boyutu ile sınırlı hale gelir.

Bu nedenle, Prasad ve al.9 ve Celeste Berg4,10 laboratuvarından birleştirilmiş protokollere sahibiz ve gelişmiş yöntemde hiçbir coverslip/esnek battaniye/agarose kullanılabilmesi için onları daha fazla değiştirdik. Drosophila yumurta odaları serbestçe medyada kültürlü ve burada sunulan protokol sadece ters mikroskopiye uygulanır. Protokole iki parça vardır. İlk bölüm, yumurta odaları içinde yerel hücresel ölçekte (15 hücreye kadar) akomyosin sinyallerinin analizine odaklanmıştır. İkinci bölümde, yumurta odalarının ücretsiz kültürü nedeniyle küçük bir satın alma uçağı ile ilişkili sınırlamaları üstesinden odaklanıyoruz. Bu bağlamda, biz seçici özler ve bir çevresel doku yüzeyi tanımlanan katmanları ortaya çıkaran bir yarı interaktif grafik kullanıcı arayüzü ile bir roman Fiji tabanlı hesaplama yöntemi geliştirdik. Bunun ardından doku ölçeğinde akomyosin nasıl çözümleneceğini açıklayan bir protokol izlenir (yani, > 50 hücre). Eğri epitelyal dokularda tanımlanmış bir ince tabakanın seçici olarak çıkarılması, klasik z-Stack projeksiyon kullanarak kolayca mümkün olmamıştır (Şekil 1), bu kolay kullanımlı Yöntem, önemli bir ön koşul olarak anlaşılır Drosophila yumurta odalarında doku ölçeğinde ince (< 1 μm) aktomiozin ağının davranışı.

Buna ek olarak, protokol kolaylaştırmak için, biz örnek zaman atlamalı Filmler (tlms) ve floresan etiketli kasa invaze olmayan konvansiyonel myosin II davranış örnek dosyaları ( ek dosya 3bakın) sağlar. Myosin II bir motor proteindir ve akomyosin makinenin aktif kontroton parçasını temsil eder. Myosin II görüntü için, biz myosin II adlandırılan mrlc değiştirilmiş bir düzenleyici ışık zinciri içeren Drosophila transjenik hatları kullanın:: GFP (Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın)12,13. Hücre zarlarını görselleştirmek için protokol ticari boyalara dayanır (bkz. malzeme tablosu). Bu protokol sadece küçük hücre altı mrlc analizi için uygundur:: Gfp sinyalleri12 ama aynı zamanda ± 300 μM civarında herhangi bir benzer boyutlu hücre altı parçacıklar için, böyle yaşam-ACT ile gözlenen gibi:: Gfp12,14.

Her ikisi de bu protokoller içinde vitro kültürlü Drosophila yumurta odaları kullanılarak sunulmasına rağmen, akomyosin sinyalleri satın alma da kültür medyanın optimizasyonu üzerine diğer dokularda kullanılarak yapılabilir ve kullanılabilirliği bağlı ilgili ticari boyalar veya örneğin, mRNA mikroenjeksiyonları geçici gen ifade profilleri elde etmek için floresan etiketli proteinlerin. Benzer şekilde, bir çevresel yüzeyden ince bir tabakanın çıkarılması için Fiji tabanlı protokol, elipsoid ve organ benzeri dokulara daha genel olarak uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Aşağıdaki protokol, yerel hücresel ve Drosophila yumurta odalarında doku ölçeği aktomiozin analiz talimatları sağlar. Yerel ölçekli yaklaşım, kullanıcıların yumurta odasına göre 15 hücreye kadar ayrıntılı akomyosin davranışını analiz etmelerini sağlar ve yüksek hızlı görüntüleme ve ters bir Konfokal mikroskop kullanarak kısa bir süre için (5 – 10 dakika) TLMs satın almayı gerektirir. Buna karşılık, doku ölçeği 50 – 100 hücrelerde aktomiozin bilgi sağlar ve düşük hızlı görüntüleme ve ters dönen disk mikroskop kullanarak uzun bir süre (≥ 30 dk) için tlms edinme gerektirir (bkz. Şekil 2 ve Tablo 1' de her ölçekte önerilen parametreler). Akomyosin sinyallerini analiz etme ölçeğinin tamamen kullanıcının bilimsel sorusuna bağlı olduğu karar. Eşlik eden test TLMs bu kararı vermek için yardımcı olmalıdır.

1. yerel hücresel ölçek (LCS)

Not: İncelemek ve görüntü in vitro kültürlü Drosophila yumurta odaları, ek dosya 1açıklanan protokol izleyin. Elde edilen TLD 'Leri çözümlemek için aşağıdaki protokole devam edin. TLMs 'in eşlik eden test dosyalarına bağlantılar ek dosya 3' te sağlanır.

  1. Yerel hücresel ölçekte (LCS) TLMs veri işleme
    1. Floresan etiketleri yoğunluğu çürümesini telafi etmek için TLMs Bleach düzeltmesi
      1. Şu yönergeleri izleyerek kullanılan bilgisayarda güncel bir Fiji uygulamasının yüklü olduğundan emin olun: fiji > bir TLM açın (örn., ek dosya 3' ten TestMovie1. tif).
      2. Görüntü > renk > bölünmüş kanallar'ı tıklatarak renk kanallarını bölün.
      3. Görüntü > Adjust ≫ bleach düzeltme ≫ basit oran > arka plan yoğunluğu 0,0kullanarak her iki kanalda bir çamaşır suyu düzeltmesi gerçekleştirin.
        Not: Tatmin edici olmayan sonuçlar elde ediliyorsanız, bu eklentinin hangi düzeltme yöntemlerinin en iyi şekilde uyduğunu keşfedin (örn. basit oranyerine histogram eşleştirme kullanın).
    2. TLMs için bir hücre maskesi oluşturmak için hücre segmentasyon
      1. Fiji zaten açık değilse, yeniden açın (ve güncel olduğundan emin olun) aşağıdaki yardım > güncelleştirme ≫ Değişiklikleri Uygula > Tamam.
      2. Bu zaten yapılmadı, makro Tıssuecellsegmentmovie. ijm (http://adm.irbbarcelona.org/MATLAB/TissueCellSegmentMovie.ijm) indirin. Sürükle ve Fiji içine bu script bırakın.
      3. Çamaşır suyu ile düzeltilmiş TLM. tiff dosyasını açın (bkz. Bölüm 1.1.1). Resim > renk > bölünmüş kanallarkullanarak çamaşır suyu tarafından düzeltilmiş dosya kanallarını Böl.
      4. Yüklenen komut dosyasını, açık komut dosyasında Çalıştır simgesine basarak seçilen TLM 'nin etkin hücre membran kanalına çalıştırın. 2,500 Için Gauss bulanıklığını ve hücre algılama hassasiyetini -1 olarak ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Güzel bir hücre maskesi almak için, yukarıdaki bu parametreleri değiştirmeyin. 63x hedefiyle elde edilen TLD 'Ler için 10 – 20 arasındaki tahmini gürültü Toleransını ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın.
        Not: Diğer hedefler için farklı parametreler gerekebilir. Bir TLM arka plan temizleyici, düşük tahmini gürültü toleransı gereklidir.
      5. Oluşturulan bir hücre maskesi, analiz edilen TLM 'de ve Particlestack (G)adlı yeni bir pencerede görünür ve buna ek olarak, eylem gerekli adlı küçük bir pencere görüntülenir. TLM 'deki hücre maskesinden, yalnızca TLM 'nin merkezindeki hücrelere odaklanın ve TLM boyunca tam ve iyi tanımlanmış anahatlar sağlayabilirler.
      6. Seçili hücreler yapay/ekstra hücre anahatları içeriyorsa, TLM 'de gerekli eylem adlı birleştirme aracı penceresini kullanın. İkincisi için, penceredeki yönergeleri izleyin.
        Not: Hücre anahatlarının iyi tanımlandığından emin olun ve bir TLM 'de gerçek hücre membranlarına karşılık gelen herhangi bir kesinlik sonraki analizleri etkileyebilir. İstenmeyen hücrelerin kaldırılması gibi ek tweaks ve değişiklikler, daha sonra Surface Manager aracını kullanarak yapılabilir (Bölüm 1.1.3 ' de açıklanmıştır).
      7. Merkezinde Seçilen hücreler güzel gerçek hücre membranlarına karşılık geldiğinde, ParticleStack bir. tiff dosyası olarak kaydedin > > Tiff olarak kaydedin .
    3. Oluşturulan hücre maskesinin Surface Manager 'a yüklenmesi
      1. Surface Manager Plugin15 kullanılan Fiji kurulum içine yükleyin. Viktorinova ve al.16' nın talimatlarını takip edin.
      2. Eklentiler ≫ segmentasyon ≫ Surface Manager (3D) kullanarak Surface Manager 'ı açın.
        Not: Surface Manager penceresi sağdaki birkaç eylem düğmelerini ve soldaki boş bir pencereyi görüntüler. Tüm eylem düğmelerini görmek için, pencerenin yüksekliğini/genişliğine uzatmak için gerekli olabilir. Zaman dilimlerinin z-dilimleri olarak görüneceğini unutmayın.
      3. İlgili ParticleStack. tiff dosyasını Surface Manager 'a tıklayarak dosya > Aç 'ı tıklatıp açmak için resmi seçin (örn., ParticlesStack1. tif).
      4. Surface Manager 'da, anahat görüntüsünü oku düğmesini tıklatın ve jakarlı dizinini% 60 olarak ayarlayın.
        Not: ParticlesStack1. tif dosyasının yüklenmesi, bilgisayarın işlem gücüne bağlı olarak birkaç dakikaya kadar sürebilir.
      5. Yüklendikten sonra her hücre bir S numarası ile atanır ve yüzey Yöneticisi penceresinin sol kısmında görünür.
        Not: Tüm hücrelerin anahatları ve hücre adlarını göstermek için, yüzey Yöneticisi penceresinin alt kısmındaki Tümünü göster ve etiketleri göster onay kutularını işaretleyin. Hücre numaraları kendi doğruluğu için kontrol edildikten sonra bu işlevi kullanmak için önerilir.
      6. İlk S numarasını tıklayın; ParticlesStack1. tif öğesinden alınan hücre anahattı TLM 'de görünür. TLM genelinde hücre anahat kalitesi için alınan her S numarasını kontrol edin ve yanlış hücre anahatları görüntüleyen istenmeyen hücreleri kaldırın. Bunu yapmak için, hücre anahattı vurgulayın ve düğmeyi tıklatın Delete.
        Not: Aynı zamanda hassas hücre anahatları için düzeltmek ve yeni hücre anahatları eklemek mümkündür. Bu, tartışma bölümünde açıklanmıştır.
      7. Tüm düzeltilmiş hücreleri, diske kaydet düğmesine basarak RoiSet. zip dosyası olarak kaydedin.
        Not: Oturumun kesintiye uğramması gerekiyorsa, RoiSet dosyasını daha sonra Surface Manager 'a yüklemek mümkündür: Fiji 'de (dosya > Open) bir TLM açın ve bir TLM seçin. Eklentileri ≫ segmentasyon ≫ Surface Manager (3D)üzerinden yüzey Yöneticisi açın. Diske yükle düğmesini tıklatarak ve uygun roiset. zip dosyasını seçerek Ilgili roiset. zip dosyasını yükleyin. Yüklenen hücre maskelerinin yüklenmiş TLM 'ye karşılık geldiğini iki kez kontrol edin.
    4. TLMs 'de doku sürüklenme için düzeltme
      Not: TLMs 'in edinme süresi boyunca, epitelyal rotasyon veya istenmeyen bir hareket nedeniyle drift efektleri görülebilir. Her iki durumda da, daha sonra manuel akomyosin analizini kolaylaştırmak için herhangi bir drift için düzeltme yapmanızı öneririz. Drift düzeltmesi sadece manuel aktomiozin analizi için gereklidir. Bu yazının yüklü MultiStackReg Plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) ile güncel Fiji yazılımı gerektirir.
      1. Dosya > Açık ve seçin Bleach-düzeltilmiş dosya aracılığıyla Fiji 'de çamaşır suyu düzeltilmiş TLM açın yukarıda belirtilen öğretici kullanılarak oluşturulan.
      2. Kanalları Böl ve görüntü > renk > bölünmüş kanallararacılığıyla hücre membranlarını tanımlayan birini seçin.
      3. Hücre anahatları görünür şekilde pürüzsüz olmadığında aşağıdaki protokolü kullanın: işlem > Filtreler ≫ Gauss bulanıklaştırma. Bir 63x amacı için ~ 1 – 2 olarak ayarlayın ve Tamam 'ı tıklatın ve sonra Evet. Tıklatın işlem > ikili ≫ varsayılan ayarları kullanarak maske Dönüştür ; sonra Tamam' ı tıklatın.
      4. Yük MultiStackReg Plugin aşağıdaki eklentileri > kayıt > multistackreg.
      5. Yığın 1 ' in hücre membran kanalına ayarlandığından emin olun, eylem 1 Hizala olarak ayarlanır ve dönüştürme çeviri olarak ayarlanır. Dönüşüm dosyasını Kaydet onay kutusunu Işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın.
      6. Seçili TLM, MultiStackReg eklentisi ve dosya > Open 'ı kullanarak kaydedilmiş dönüştürme dosyasını yeniden açın ve bir TLM seçin. Görüntü > renk > bölünmüş kanallarıkullanarak renk kanallarını Böl.
      7. Eklentileri > kayıt > Multistackregtıklayarak multistackreg Plugin yükleyin. Dönüşüm dosyasını eylem 1 olarak yükle 'yi seçin.
      8. Dönüşümü sert gövde olarak bırakın ve Tamam'ı tıklatın. Önceden kaydedilmiş dönüşüm dosyasını seçin ve Tamam 'ı yeniden tıklatın.
      9. Görüntü > renk > birleştirme kanallarıaşağıdaki görüntü Kanalları Birleştir ve kayıtlı TLM. tiff dosyası olarak kaydedin. Dosya > > Tiff olarak kaydet 'i tıklatarak dosyayı kaydedin.
        Not: Orada alternatif yollar Fiji 'de bir doku drift için düzeltmek için, yani eklentileri > kayıt ≫ stackreg/doğru 3D driftile.
  2. LCS 'de Surface Manager 'da akomyosin darbeleri Analizi
    Not: Bu protokol adımı, bilim adamlarının, analiz edilen dokuda akomyosin darbeleri olup olmadığını belirlemesini ve ayrıntılı davranışları ve akomyosin sinyallerinin yönünü anlamanızı sağlar.
    1. Fiji açın ve bir TLM ve karşılık gelen hücre maskesi Surface Manager 'da açık olduğundan emin olun.
      Not: Fiji yüklü ve güncel ve Surface Manager eklentisi yüklü olduğundan emin olun (adım 1.1.3.1).
    2. Dosya > Open ile bir TLM açın ve açmak için bir TLM seçin (örn., TestMovie1_bleach. tif). Eklentiler ≫ segmentasyon ≫ Surface Manager (3D)aracılığıyla yüzey Yöneticisi eklentisi yükleyin. Burada öğretici oluşturulan kaydedilmiş hücre maskesini yükleyin (örn., ParticlesStack1. tif) dosya > Aç ve seçin bir hücre maskesi (örn., ParticlesStack1. tif). İlgili bölge (YG, örneğin, TestMovie1_RoiSet. zip) yükleyin. Bkz. Şekil 3A.
    3. Seçilen TLM 'de ilgilendiğiniz kanala geçin.
      Not: Kanalları ayırt etmek için TLM 'nin etrafında belirtilen renk kodunu izleyin.
    4. Yüzey Yöneticisi 'nde, Ortalama gri değer Slice tarafından Slice (Şekil 3B) adlı pencereyi elde etmek için İstatistikler düğmesini tıklatın. Belirtilen hücre içindeki belirli bir analiz kanalındaki aktomiozin sinyallerinin ortalama/medyan yoğunluğu değerlerinin zaman içinde özetlendiğini, aynı zamanda hücre alanı ve hücre şekline ilişkin diğer parametrelerin de görüntüleneceğini unutmayın.
      Not: Yoğunluk değerleri arbitraty ünitelerinde (A.U.); hücre alanı pikseldir ve kare mikrometre içine dönüştürülmesi gerekir.
    5. Elde edilen değerleri bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin. Istatistik penceresine tıklayın, dosya ≫ farklı Kaydet.
      Not: Elde edilen istatistiksel değerleri daha sonra aşağıdaki şekilde doğrulamak mümkündür: Fiji 'de çamaşır suyu ile düzeltilmiş TLM ve Surface Manager 'ı açın. Diskten yük düğmesine basarak ve dosyayı açmak için karşılık gelen RoiSet. ZIP TLM yükleyin. Hücre anahatları olan kaydedilmiş maske yüklenir ve hücrelerin adları sol yüzey Yöneticisi penceresinde görünecektir. İstatistik değerleri için istatistik düğmesini tıklatın.
  3. LCS 'de bireysel hücre altı aktomiozin sinyallerinin manuel Analizi
    Not: Bu protokol en çok konsantrasyon gerektirir ve zaman alıcı. Genel olarak, elde edilen bir TLM 1 gün içinde rahatça analiz edilebilir. Bu onların diseksiyon önce sinek hazırlama için zaman içermez, diseksiyon, ve görüntü edinme.
    1. Seçilen, çamaşır suyu ile düzeltilmiş ve kayıtlı (drift-düzeltilmiş) TLM 'i güncel bir Fiji uygulamasında açın. Bir test örneği olarak bir çamaşır suyu düzeltilmiş ve drift-düzeltilmiş TLM (örneğin, TestMovie1_bleach_reg. tif) kullanın.
    2. Görüntü > Adjust > Parlaklık/kontrastkullanarak bireysel akomyosin sinyallerini görmek için parlaklığı ve karşıtlığı ayarlayın.
    3. TLMs 'Leri doku/gövde eksenine göre aynı yönde hizalayın. Yumurta odaları durumunda, yumurta odalarının ön tarafını her zaman görüntü/submovie/TLM soluna analiz etmeden önce hizalayın.
    4. Seçilen filmi kısa 30 s alt filmlere ve her biri zaman projesine bölün. Zaman yansıtılan ve zaman yansıtılan alt filmleri ilgili adlarla kaydedin. Orijinal kaynağı saklayın.
      Not: Submovies orijinal TLMs ilk görüntü > yığınları > Slice Removeraracılığıyla istenmeyen çerçeveleri silerek oluşturulabilir. Kaldırılacak dilimleri tanımlayın ve artırma ayarlayın. Dilim çıkarıcı kullanmadan önce RGB 'ye Dönüştür zaman artırma = 1. 30 s alt filmi zaman projesi için, tanımlanan çerçeveler (dilim) için ımage > Stacks > Z-Project > Max yoğunluk 'ı tıklatın ve sonra Tamam'ı tıklatın. İki sonraki 30 s alt filmlerde 2 adet aktomiozin sinyallerini saymamak için her saniyede 30 s alt filmi atlayın.
    5. İlgili 30 s alt filminin (Şekil 4A, B) yanında zaman yansıtılan bir görüntü yerleştirin. Zaman yansıtılan alt filmde sinyal hattını tanımlayın. Submovie el ile oynatarak orijinal alt filmde bu çizgi boyunca aktomiozin sinyal hareketinin yönünü (0 ° – 360 °) belirleyin. Sinyal hareketinin yönünü tanımlanan doku eksenine veya benzer bir araca göre el ile ölçmek için açı aracını (Fiji çubuğunda) kullanın.
      Not: Fiji sadece 0 ° – 180 ° ölçekli (Şekil 4c) çalışır ve elde edilen değerlerin 0 ° – 360 ° ölçekte yeniden hesaplanması gereklidir. Bir sinyal hattı zaman içinde bir akomyosin sinyal hareketinin yörüngesine karşılık gelir.
    6. Akomyosin sinyallerinin analizinde çoğaltılmasını önlemek için, zaman yansıtılan alt filmde (Şekil 4b, D) hücrelerdeki analiz sinyal çizgilerini işaretleyin.
    7. 30 s alt filminde seçilen tüm hücreleri analiz edin ve elde edilen açıları kaydedin.
      Not: TLM boyunca iyi tanımlanmış hücre anahatları olan hücrelerde yalnızca hücre altı sitoplazmik akomyosin sinyallerini analiz edin. Tüm TLM 'deki 15 – 20 ' den az algılanan sinyallerle bireysel hücreleri hariç tutun. Bilinmeyen kökenleri nedeniyle hücreler arasında hareket eden akomyosin sinyallerini yoksay. 30 s alt filmdeki bir analiz hücresi için sinyal sayılarının bir örneği Şekil 4d'de gösterilir.
    8. Bir TLM 'nin tüm 30 s uzunluğunda alt filmleri analiz edilinceye kadar devam edin ve bir e-tablo dosyasında bir TLM 'nin akomyosin sinyallerinin tüm ölçülen açısını kaydedin.
    9. Tüm ölçülen açıları ilgili TLMs sayısı (denemeye bağlı) üzerinde özetlemek. Analiz edilen akomyosin sinyallerinin yönü yüzdesini, örneğin, tercih edilen bir yazılım ile 0 ° ile 360 ° arasında bir Aralık ile bir gül diyagramı olarak arsa.
      Not: İstatistiksel olarak önemli sonuçlar elde etmek için, herhangi bir yumurta odası aşamasının beş ila on bağımsız yumurta odaları analiz edilmesi tavsiye edilir.

2. doku ölçeği

Not: İncelemek ve görüntü in vitro kültürlü Drosophila yumurta odaları için, ek dosya 2protokol izleyin. Elde edilen TLD 'Leri çözümlemek için aşağıdaki protokole devam edin. TLMs eşlik eden test dosyaları ek dosya 3yerleştirilir.

  1. Eğri epitelyal dokularda seçici yüzey ekstraksiyon
    Not:Bu protokol, kullanıcıların zaman içinde eğri epitelyal dokuda ince bir akomyosin katmanını seçici olarak çıkarmasına olanak tanır. Bu protokol adım kullanıcı dostu ve sezgisel bir grafik arayüzüne dayanmaktadır. Kolayca analiz etmek mümkündür (yüzey ayıklamak) birkaç TLMs. kullanım TestMovie2. czi (Ek dosya 3) bir test TLM örneği olarak.
    1. Güncel bir Fiji uygulaması açın (fiji > yardım ≫ güncelleme > Değişiklikleri Uygula > Tamam).
    2. Ellipsoid yüzey projeksiyon eklentisi15 yüklü olduğundan emin olun. Viktorinova et al. takip edin. 16 yaşında.
    3. Bir TLM açın ve eklentiler ≫ bigdataviewer > geçerli görüntüyü XML/HDF5 dosyası olarak dışa aktar'ı tıklatarak XML/HDF5 dosyası olarak dışa aktarın.
      Not: Bir verme yolu tanımlamak için gereklidir. Kaydetme birkaç dakika sürebilir ve TLM uzunluğuna bağlıdır.
    4. Dışa aktarılan dosyayı ellipsoid yüzey projeksiyon içinde eklentiler ≫ bigdataviewer ≫ ellipsoid yüzey projeksiyon > Select XML dosyasınıtıklatarak açın.
      Not: Yumurta odasının sagittal görünümleri ve işleme yoluyla Kullanıcı rehberlik etmek için bir diyalog ile yeni bir pencere görünecektir. Dilim görünümünde gezinme hakkında ayrıntılar https://imagej.net/BigDataViewer adresinde bulunabilir.
    5. Ofarklılık projeksiyon adlı iletişim penceresinde birkaç sekme vardır. Sınırlayıcı kutusu olarak adlandırılan ilk iletişim sekmesinde, TLM 'de bir yumurta odasının x ve y kenarlıklarını sınırlayıcı kutunun z genişliğiyle birlikte (örn. z yığını/yumurta odasının derinliği) ve set tuşuna (Şekil 5A) belirleyin.
    6. Kenarlıkları tanımlamak için x, y ve z 'nin yanındaki düğmeleri sürükleyin veya x, y ve z kutularındaki sayı koordinatlarını tanımlayın. Kenarları yüzey ekstraksiyon içine ilgi yumurta odasının parçası almak için yeterince cömert olduğundan emin olun. Yumurta odasının seçilmiş parçaları pembe vurgulanır.
    7. Penceredeki bul Blobları adlı sekmeye geçiş yapın. Sigma ve minimal en yüksek değeri tanımlayın; daha sonra, yeşil Bloblar olarak görünecek olan akomyosin sinyallerini (Şekil 5B) tanımlamak için COMPUTE tuşuna basın. Yeterli noktalar (100 civarında) bulunduğunda kadar farklı parametrelerle bu adımı yeniden deneyin.
      Not: Minimum pik değeri 20 \ u2012100 değerleri taşır ile Sigma 1 \ u20123 Stage-6-8 yumurta odaları aktomiozin sinyalleri belirlemek için en iyi çalışır. Akomyosin sinyallerinin belirlenmesi önemli bir adımdır ve sinyal kalitesine ve boyutuna bağlıdır. Varolan Bloblar doğru boyutunu onaylamak önemlidir. Görüntüde görünür yeşil lekeler/Bloblar bir sonraki adımın işe yaramazsa anlamına gelir. Blob 'ları görmek için seçilen z düzlemlerini inceleyin.
    8. Elipsoid tasarlamak için, fit elipsoidadlı sekmeyle devam edin. Rasgele örnekleri 10.000, dış/iç kesme mesafesi 1 \ u201210 Için ayarlayın ve sonra COMPUTE (Şekil 5c) tıklatın.
      Not: Düşük kesme mesafesi, daha hassas istenen elipsoid olacaktır. Bunun ardından, projeksiyon denilen sekme otomatik olarak açılacaktır ve yüzey ekstraksiyon tanımına izin verir. Ayarların optimize edilmesi gerekir.
    9. Projection (Şekil 5D) adlı sekmeyle daha fazla devam edin. Minimum ve maksimum projeksiyon mesafesi (örn. istenilen elipsoid genişliği) ayarlayın. Pembe tanımlanan elipsoid bölgenin yumurta odasının tüm dış tabakasını içeren, böylece minimal ve maksimal projeksiyon uzaklığı ayarlamak için gereklidir. Dilim mesafesini tanımlayın (1 önerilir).
      Not: Şekil 6a, C'de yanlış ve optimum projeksiyon parametrelerine neden olan bir hatalı ve optimum elipsoid Sığdır örnekleri gösterilir. Faiz ince çevresel tabaka daha sonra tanımlanabilir. Hesaplama basmadan önce yumurta odasında tanımlanan genişlikte elipsoid pembe bölgenin görünür olduğundan emin olun. İstenilen elipsoid (pembe tek çizgi) iyi sonuçlar elde etmek için bir yumurta odasının elipsoid yüzeyine güzel uyum önemlidir. Elipsoid Sığdır iyi değilse, istenilen yüzey ekstraksiyon elde edilinceye kadar farklı ayarlar düzenleyin.
      1. Elipsoid bir çıkış genişliği (≥ 800) ve yüksekliği (≥ 400) ayarlayın. Yüzey çıkarma işlemi için hangi zaman noktasının oluşturulacağını ayarlayın (örneğin, TLM ekstraksiyonu uzunluğunu tanımlayın). Küresel veya silindirik bir projeksiyon seçin. Z 'ye çevirin ve gerekirse Y 'ye hizalayın.
      2. Görüntüolarak adlandırılan yeni pencerelerin her iki kanalı için bir yüzey ekstraksiyonu elde etmek için COMPUTE tuşuna basın. Görüntü > Ayarla > Parlaklık/kontrast seçeneğini tıklatarak, elde edilen görüntü pencerelerin parlaklığını ve karşıtlığını, yansıtılan akomyosin sinyallerini görebilecek şekilde ayarlayın.
        Not: Şekil 6B, D'de yanlış ve en iyi elipsoid Sığdır kaynaklanan bir projeksiyon örnek bir karşılaştırma gösterilir.
    10. Yüzey ekstraksiyon iyi görünüyorsa, görüntüleri (her iki kanal ayrı olarak). tiff olarak kaydedin. Ayrıca, bu belirli yumurta odasının yüzeyinin nasıl ayıklandığı gibi gelecekteki başvuru için günlük penceresi dosyasını kaydedin.
      Not: Bu, ayıklanan ince katmanın orijinal açılmamış şekline (yalnızca geliştiriciler için) döndürülmesi durumunda özellikle önemli bilgilerdir.
    11. Fiji 'de tercih edilen renk koduyla kanalları birleştirin.
      Not: Gerekirse, proje seçilen z-yığın katmanları ile aktomiozin sinyalleri. Satın alma odağı bir TLM 'de zaman içinde biraz değiştiğinde, seçilen z yığını katmanlarının projeksiyon gereklidir. En iyi sonuçlar için, en çok bir-iki z yığını katmanları proje.
    12. Sonuçları. tiff dosyaları olarak kaydedin.
      Not: Myosin II (mrlc:: Gfp) kontrol ve fat2 mutant yumurta odaları folikül Epitelyumu temsil eden ince Katmanlar (seçici bazal ve apikal yüzey) temsili örnekler Şekil 8' de bulunabilir.
  2. Seçici olarak çıkarılan doku yüzeyinin veri işleme
    1. Bleach-floresan etiketlerinin yoğunluğu çürümesini telafi etmek için TLD 'Leri düzeltin.
      1. Fiji açın. Bir TLM açın (örn., TestMovie2_extraction. tif ek dosya 3) Dosya > Openkullanarak. Görüntüyü açmak için seçin.
      2. Renk kanallarını Böl ve gerekirse resim > renk > bölünmüş kanallar'ı tıklatarak 16 bitlik resimlere dönüştürün. Görüntü > türü > 16-bitkullanarak kanalları 16 bit görüntülere (32 bit görüntülerden) dönüştürün.
      3. Görüntü > Adjust ≫ bleach düzeltme ≫ basit oran > arka plan yoğunluğu 0,0kullanarak her iki kanalda bir çamaşır suyu düzeltmesi gerçekleştirin.
        Not: Eğer gereksiz sonuçlar elde edilir, bu eklentinin hangi düzeltme yöntemlerinin en iyi sığacağı keşfetmek için gereklidir (örn., basit oran yerine histogram eşleştirme kullanın).
      4. Görüntü > renk > Kanalları Birleştir'i tıklatarak, çamaşır suyu ile düzeltilmiş iki görüntüden kanalları birleştirin. Birleştirilmiş görüntüyü, dosya ≫ ≫ Tiff olarak kaydet 'i tıklatarak. tiff dosyası olarak kaydedin.
        Not: Gerekirse kanallar için kontrast ve parlaklığı ayarlayın.
    2. TLMs için bir hücre maskesi oluşturmak için hücre segmentasyon
      1. Fiji zaten açık değilse, yeniden açın (ve Yardım 'ı tıklatarak güncel olduğundan emin olun > güncelleştirme ≫ Değişiklikleri Uygula > Tamam).
      2. Bu zaten yapılmadı ise, makro TissueCellSegmentMovie. IJM (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm) indirin.
      3. Sürükle ve Fiji içine bu script bırakın. Bleach tarafından düzeltilmiş dosyayı açın (örn., ek dosya 3' ten TestMovie2_bleach. tif, Ayrıca bkz: 2.2.1).
      4. Resim > renk > bölünmüş kanallar'ı tıklatarak çamaşır suyu tarafından düzeltilmiş dosyanın kanallarını bölün. Görüntü > Ayarla > Parlaklık/kontrastseçeneğini tıklatarak açık hücre anahatlarını sağlamak için membran kanalını ayarlayın.
      5. Yüklenen komut dosyasını, açık komut dosyasında Çalıştır simgesine basarak seçilen TLM 'nin etkin hücre membran kanalına çalıştırın. Gauss bulanıklığını 1,500olarak ayarlayın. Hücre algılama duyarlılığı-1 ' e ayarlayın ve Tamam' ı tıklatın. 40X hedefiyle elde edilen TLMs için tahmini gürültü toleransı 'nı ~ 8 olarak ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın.
        Not: Güzel bir hücre maskesi almak için, yukarıdaki bu parametreleri değiştirmeyin. Diğer hedefler için farklı parametreler gerekebilir. TLM 'de arka plan temizleyici, düşük tahmini gürültü toleransı gereklidir.
      6. Oluşturulan bir hücre maskesi, analiz edilen TLM 'de ve Particlestack (G)adlı yeni bir pencerede görünür. Ayrıca, eylem gerekli adlı küçük bir pencere görüntülenir. TLM 'deki hücre maskesinden, yalnızca TLM 'nin merkezindeki hücrelere odaklanın ve TLM boyunca tam ve iyi tanımlanmış anahatlar sağlayabilirler.
      7. Seçili hücreler yapay/ekstra hücre anahatları içeriyorsa, TLM 'de gerekli eylem adlı birleştirme aracı penceresini kullanın. İkincisi için, penceredeki yönergeleri izleyin.
        Not: Hücre anahatlarının iyi tanımlandığından emin olun ve bir TLM 'de gerçek hücre membranlarına karşılık gelen herhangi bir kesinlik sonraki analizleri etkileyebilir. İstenmeyen hücrelerin kaldırılması gibi ek tweaks ve değişiklikler, daha sonra Surface Manager aracını kullanarak yapılabilir (aşağıdaki eğitimde özetlenmiştir).
      8. Merkezde seçili hücreler güzel gerçek hücre membranlarına karşılık geldiğinde, ParticleStack bir. tiff dosyası olarak kaydedin > > Tiff olarak kaydedin . Oluşturulan hücre maskesinin yüklenmesini ve Surface Manager 'da daha önce 1.1.3 ve 1,2 bölümünde (Ayrıca 2.2.3 ve 2,3 bölümlerde ayrıntılı olarak açıklanan) yapılan aktomiozin analizini gerçekleştirmek için devam edin.
    3. Oluşturulan hücre maskesinin Surface Manager 'a yüklenmesi
      1. Yüzey Yöneticisi eklentisi zaten kullanılan Fiji kurulumunda yüklüyse, adım 2 ' ye geçin. Yoksa, Viktorinova et al.16takip edin. Geliştiriciler için sadece kaynak kodu da15kullanılabilir.
      2. Eklentiler ≫ segmentasyon ≫ Surface Manager (3B)öğesini tıklatarak yüzey Yöneticisi 'ni açın.
        Not: Surface Manager penceresi sağdaki birkaç eylem düğmelerini ve soldaki boş bir pencereyi görüntüler. Tüm eylem düğmelerini görmek için, pencerenin yüksekliğini/genişliğine uzatmak için gerekli olabilir. Zaman dilimlerinin z-dilimleri olarak görüneceğini unutmayın.
      3. İlgili ParticleStack. tif dosyasını, dosya > Aç aracılığıyla Surface Manager 'a açın ve açılacak resmi seçin (örn. ek dosya 3' ten ParticleStack2. tif).
      4. Surface Manager 'da, anahat görüntüsünü oku düğmesini tıklatın ve jakarlı dizinini% 60 olarak ayarlayın.
        Not: ParticleStack. tif dosyasının yüklenmesi, bilgisayar gücüne bağlı olarak birkaç dakikaya kadar sürebilir.
      5. Yüklendikten sonra her hücre bir S numarası ile atanır ve yüzey Yöneticisi penceresinin sol kısmında görünecektir (şekil 7a).
        Not: Tüm hücrelerin anahatları ve hücre adlarını göstermek için, yüzey Yöneticisi penceresinin alt kısmındaki Tümünü göster ve etiketleri göster onay kutularını işaretleyin. Hücre numaraları kendi doğruluğu için kontrol edildikten sonra bu işlevi kullanmak için önerilir.
      6. İlk S numarasını tıklayın; ParticleStack. tif öğesinden alınan hücre anahattı TLM 'de görünür. TLM genelinde hücre anahat kalitesi için alınan her S numarasını kontrol edin ve yanlış hücre anahatları görüntüleyen istenmeyen hücreleri kaldırın. Bunu yapmak için, hücre anahattı vurgulayın ve düğmeyi tıklatın Delete.
        Not: Aynı zamanda hassas hücre anahatları için düzeltmek ve yeni hücre anahatları eklemek mümkündür. Bu, tartışma bölümünde açıklanmıştır.
      7. Tüm düzeltilmiş hücreleri, diske kaydet düğmesine basarak RoiSet. zip dosyası olarak kaydedin.
        Not: Oturumun kesintiye uğraması gerekiyorsa, RoiSet. zip dosyasını daha sonra Surface Manager 'a yüklemek mümkündür: Dosya üzerinden Fiji 'de BIR tlm açın > açın ve bir TLMseçin. Surface Manager 'ı aşağıdaki gibi açın: Plugins ≫ segmentasyon ≫ Surface Manager (3D). Diskten yükle düğmesini tıklatarak ve uygun roiset. zip dosyasını (örn. TestMovie2_RoiSet. zip) seçerek Ilgili roiset. zip ' i yükleyin. Yüklenen hücre maskelerinin yüklenmiş TLM 'ye karşılık geldiğini iki kez kontrol edin.
  3. Yüzey yöneticisinde akomyosin darbeleri Analizi
    Not: Fiji açın ve bir TLM ve karşılık gelen hücre maskesi Surface Manager 'da açık olduğundan emin olun. Fiji yüklü ve güncel ve Surface Manager Plugin (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) yüklü olduğundan emin olun.
    1. Dosya > Open ile bir TLM açın ve açmak için bir TLM seçin (örn., TestMovie2_bleach. tif). Eklentiler ≫ segmentasyon ≫ Surface Manager (3D)aracılığıyla yüzey Yöneticisi eklentisi yükleyin. Burada öğretici oluşturulan kaydedilmiş hücre maskesini yükleyin (örn., ParticlesStack2. tif) dosya > Aç ve seçin bir hücre maskesi (örn., ParticlesStack2. tif). İlgili YG 'yi yükleyin (örn., TestMovie2_RoiSet. zip).
    2. Seçilen TLM 'de ilgilendiğiniz kanala geçin.
      Not: Kanallar arasında ayrım yapmak için TLM 'nin etrafında belirtilen renk kodunu izleyin.
    3. Yüzey Yöneticisi 'nde, Ortalama gri değer Slice tarafından Slice (şekil 7b) adlı pencereyi elde etmek için İstatistikler düğmesini tıklatın. Belirtilen hücre içindeki belirli bir analiz kanalındaki aktomiozin sinyallerinin ortalama/medyan yoğunluğu değerlerinin zaman içinde özetlendiğini, aynı zamanda hücre alanı ve hücre şekline ilişkin diğer parametrelerin de görüntüleneceğini unutmayın.
      Not: Yoğunluk değerleri A.U.; hücre alanı pikseldir ve kare mikrometre içine dönüştürülmesi gerekir.
    4. Elde edilen değerleri bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin: Istatistik penceresine tıklayın, dosya ≫ farklı Kaydet.
      Not: Elde edilen istatistiksel değerleri daha sonra aşağıdaki gibi doğrulamak mümkündür. Fiji 'de çamaşır suyu düzeltilmiş TLM açın. Yüzey Yöneticisi 'ni açın. Diskten yük düğmesine basarak ve dosyayı açmak için karşılık gelen RoiSet. ZIP TLM yükleyin. Hücre anahatları olan kaydedilmiş maske yüklenir ve hücrelerin adları sol yüzey Yöneticisi penceresinde görünecektir. İstatistik değerleri için istatistik düğmesini tıklatın.
      Not: Bireysel hücre içi akomyosin sinyallerinin manuel analizineilişkin olarak, doku ölçeğinde alt hücresel akomyosin sinyallerinin manuel olarak analizini yapmak mümkün değildir. Tartışma bölümünde vurgulanacak şekilde, yarı doku ölçeğinde bireysel akomyosin sinyallerinin analizi için optimizasyon gereklidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol bilim adamlarının epitel dokularda akomyosin ağlarının davranışlarını araştırmasını sağlar. Bu sadece yerel hücresel ölçekte (birkaç hücre) aktomiozin davranışının ayrıntılı bir analizi doku ölçeği (birçok hücre) benzer bir analiz ile birleştirildiğinde mümkündür. Ancak, epitelyal dokular genellikle kavisli ve bu dokuların ince bir tabaka çıkarma daha önce kolayca mümkün değildi, Drosophila yumurta odalarında gösterildiği gibi (Şekil 1). ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yumurta odalarının diseksiyonu ve kültürü için kritik adımlar ve sorun giderme

Eğer çok fazla sinekler küçük bir şişeye yerleştirilir, sinek gıda 2 – 3 gün sonra büyük miktarlarda besleme larvaları ve yetişkin sinek gıda sıkışıp almak sinek nedeniyle çamurlu açabilirsiniz. Böyle bir durumda, bu sineklerin geri kalanını taze yiyeceklerle yeni bir şişeye çevirin ve sayısını küçültür. Özellikle, gıda sıkışmış kadın hariç.

Schneider karışımı (SM) öncede...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çok Miriam Osterfield için bir yaklaşım Celeste Berg laboratuar4kabul kullanarak yumurta odaları in vitro yaşam görüntüleme onu tavsiye paylaşımı için minnettar. Ayrıca, hücre segmentasyonunu sağlayan Fiji senaryosu için Sebastian Tosi 'ye teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Schneider OrtaGibco21720-024[+] -Glutamin
Penisilin / StreptomisinGibco15140-122 [ +] 10.000 Ünite/mL Penisilin [+] 10.000 &mikro; g / mL Streptomisin
Fetal Sığır SerumuSigmave nbsp; F135Isı ile İnaktive
Edilmiş İnsülin Çözeltisi İnsanSigma  I9278
50 mL Falcon tüpleriEppendorfsteril
Millex-GV filtresiMilliporeSLGV033NS33 mm
Cam Tabanlı Mikro Kuyu TabaklarıMatTek CorporationP35G-1.5-14-C35 mm Petri kabı, 14 mm Microwell, No. 1.5 kapak camı
ForsepsA. Dumont & Filler #55
CellMask Deep Red (hücre zarı boyası)InvitrogenC10046
FM4-64 (hücre zarı boyası)ThermoFisher/InvitrogenT13320
Depresyon diseksiyon slaydıFisher Scientific12-560B
Mikroskobik ekipman
SteromikroskopÖr. ZeissStemi SV 6
Ters konfokal mikroskopörneğin Zeiss/Olympus
Eğirme diski mikroskobuörneğin Zeiss/Andor
Mikroskobik cam/kapak camı, örneğin Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus aleti
Wironit iğne tutucuHammacher9160020
Kaktüs omurgasıEchinocactus grusonii/fıçı kaktüs
Drosophila el yazmasında kullanılan stoklar
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFPAyrıntılar için bakınız Rauzi ve ark.: Düzlemsel polarize aktomiyosin kasılma akışları, epitelyal kavşağın yeniden şekillenmesini kontrol eder. Doğa 2010, Cilt 468, sf. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C<>Ayrıntılar için bakınız Viktorinova et al.: Epitel rotasyonundan önce aktomiyosinin düzlemsel simetri kırılması gelir ve epitel dokusunu hücre deformasyonlarından korur. PLoS Genetics 2017, Cilt 13, Sayı 11, sf. e1007107.
, ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).
  2. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
  3. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
  4. Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
  5. Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
  6. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
  7. Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
  8. Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044(2013).
  9. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
  10. Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
  11. Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511(2014).
  12. Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107(2017).
  13. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
  14. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
  15. Haase, R. Surface manager. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018).
  16. Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018).
  17. Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017).
  18. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  19. Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
  20. Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
  21. Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Actomyosin DynamicsDrosophila Egg ChambersTime lapse MoviesFiji based PluginSurface ManagerEllipsoid Surface ProjectionCell Mask AnalysisTissue Scale AnalysisLocal Cellular ScaleEpithelial Tissue

İlgili makaleler