Burada, genetik olarak eşleşmiş hayalice ayrı photoactivatable ve floresan proteinler içerir bir iletişim kuralı mevcut. Bu floresan protein chimeras miktar photoactivated Yani, floresan, olmak olduğunu PA-FP fraksiyonunun photoactivation verimliliği izin verir. Protokol photoactivation farklı modları farklı photoactivation verimliliği verim ortaya koymaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Nasıl Photoactivated floresan proteinler toplu olarak ve canlı hücrelerdeki kısmını ölçmek için
Bu makalede
Özet
Özet
Photoactivatable ve - Cabrio floresan proteinler (PA-FPs) Floresan yaşamak-cep mikroskobu içinde hücreleri ve protein topluluğu dinamiklerini analiz etmek için kullanılmaya başlandı. Şimdiye kadar herhangi bir yöntem toplu olarak ölçmek kullanılmaktadır ve PA-fps kaç ifade canlı hücreleri belli photoactivated vardır.
Burada, biz iç cetveller içeren bir protokolü mevcut, Yani, genetik olarak ratiometrically için hayalice farklı (photoactivatable) Floresan proteinler, birleşince tüm PA-FPs olması için açýk bir hücreye ifade kısmını ölçmek Floresan. Bu iletişim kuralını kullanan, gösterdiğimiz photoactivation farklı modları farklı photoactivation verimliliği vermiştir. Mikroskop (CLSM) tarama confocal lazer ile kısa yüksek güçlü photoactivation kadar dört kez daha düşük photoactivation verimliliği yüzlerce alt düzey Etkilenmeler CLSM tarafından uygulanan veya widefield aydınlatma tarafından uygulanan kısa bir darbe daha sonuçlandı. Protokol burada (PA-) GFP ve (PA-) kiraz için örneği iken, bu prensip olarak hayalice farklı herhangi bir photoactivatable veya photoconvertible floresan protein çifti ve deneysel herhangi bir kurulum için uygulanabilir.
Giriş
2002 yılında, ilk genel olarak uygulanabilir photoactivatable (PA-GFP1) ve photoconvertible (Kaede2) Floresan proteinler tarif edildi. Bu optik vurgulayıcı floresan proteinler UV-ışık, Yani, ışınlama üzerine spektral özellikleri değiştirmek onlar parlak hale (photoactivatable floresan proteinler, Yani, PA-kare/sn), onların rengi (photoconvertible veya değiştirme FPs). Bugüne kadar çeşitli geri dönüşümlü ve geri dönüşümsüz photoactivatable ve photoconvertible floresan proteinler Gelişmiş3,4olmuştur. Topluluk veya toplu çalışmalarda optik vurgulayıcılar tüm hücreleri veya proteinler dinamikleri ve hücre altı bölmeleri bağlantısı çalışmaya kullanılmaktadır. Ayrıca, etkin optik vurgulayıcılar tek-molekül superresolution PALM5 ve FPALM6gibi teknikleri Imaging temel.
Her ne kadar fotoğrafkimyasal işleme sırasında photoactivation veya - dönüşüm tarif edilmiş birçok optik vurgulayıcılar ve hatta crystallographic yapıları için önce ve photoactivation sonra / - dönüşüm kullanılabilir7 yaptı , 8, temel fotoğraffiziksel mekanizma photoactivation ve - dönüşüm değil tamamen anlaşılmaktadır. Ayrıca, şu ana kadar sadece kaba tahminler photoactivation ve - dönüşüm, verimliliğini, yani floresan proteinlerin kısmını var aslında photoconverted veya floresan olmak photoactivated. Vitro topluluğu çalışmaları soğurma spektrumları ve yerli miktarı vardiyada miktarının ve protein bir jel9,10,11' deki aktif bildirilmiştir.
Burada, photoactivated floresan proteinler toplu olarak ve canlı hücrelerdeki kısmını değerlendirmeye floresan protein chimeras içeren bir protokolü mevcut. Ne zaman genetik olarak kodlanmış floresan proteinler ile çalışma, protein ifade mutlak miktarı hücre hücre değişir ve bilinmiyor. Bir hücre bir PA-FP ifade photoactivation başka bir hücre daha sonra daha parlak bir sinyal gösteriyorsa, bu parlak sinyal PA-FP yüksek ifadesi veya PA-FP daha verimli bir photoactivation nedeniyle ise ayırt edemez. Hücreleri ifade kademede standartlaştırmak için genetik olarak eşleşmiş hayalice farklı floresan proteinlerin iç cetveller tanıtmak. Photoactivatable floresan protein bir hayalice farklı her zaman açık floresan proteinler, iç cetveller için genetik bilgi oluşturulur kaplin tarafından bu hala bir bilinmeyen toplam tutar ama sabit ve bilinen bir göreli miktarını belirtilecektir 1:1. Bu strateji farklı UV ışık photoactivation şemaları, Yani, nicel karakterizasyonu PA-FPs photoactivated photoactivation farklı mod ile olabilir ve böylece izin veriyorsa göreli miktarını değerlendirmesini sağlar diğerlerinden daha etkili photoactivation şemaları tanımlamak için. Ayrıca, bu strateji prensip olarak photoactivated PA-FP kesir mutlak miktar değerlendirmesini sağlar. Bu amaçla, sunulan topluluk çalışmalar analizi daha karmaşık bu protokol için düzenlendiği şekilde kılan Yoğunluk merkezli olduğunu fark önemlidir. Ölçülen floresan yoğunluğu, Yani, farklı moleküler parlaklık, absorbans ve emisyon spectra ve perde efektleri, belirleme parametrelerinin floresans yoğunluklarda farklı floresan proteinlerin karşılaştırırken dikkate alınması gerekir.
Sunulan ratiometric Yoğunluk merkezli miktar photoactivation verimlilik PA-GFP ve PA-kiraz canlı hücrelerdeki örneklenir ama genel olarak uygulanabilir ilke olarak ve herhangi bir photoactivatable floresan protein herhangi altında için kullanılan Deneysel durumu.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. plazmid İnşaat
- İki renkli füzyon probları oluşturmak. Memeli hücre ifade vektör kullanın (bkz. Tablo reçetesi) hangi mCherry112 ve PA-mCherry113 ile kısıtlama eklenmiş olan içinde siteleri AgeI ve BsrGI.
- Sipariş özel oligo-eGFP ve PA-eGFP A206K mutasyon, Yani, mEGFP ve PA-mEGFP14 kodonu SalI-BamHI parçası olarak olmadan içeren monomeric türevleri yükseltmek için nükleotit. Bu SalI-BamHI parçası ifade vektör klonlama birden çok siteye eklemek ve N-terminal astar 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' ve C-terminal astar 5'-AAT ATA TGG ATC MOLDOVA'da CTT GTA CAG CTC GTC kedi GC 3' kullanın. Bu yeşil ve kırmızı floresan protein arasında beş amino asit bağlayıcı RNPPV oluşturur. Biz fluorophore chimeras GFP sevk edecektir — kiraz, PA-GFP — kiraz ve GFP — PA-kiraz bu yazının geri kalanı için.
Not: Fluorophores kaplin ve photoactivation etkinliğini değerlendirmek için iç cetveller oluşturulması ile herhangi bir hayalice ayrı fluorophore çifti, Örneğin superfolder PA-GFP 15yapılabilir / PA-TagRFP 16, vb Birçok photoactivatable floresan proteinlerin GFP türetilmiştir. Bu nedenle, yukarıda verilen astar sıra için birçok floresan protein bir memeli hücre ifade vektör bir fluorophore chimera oluşturmak için kullanılabilir.
2. hücre kültür ve Transfection
- Herhangi bir standart hücre çizgisini HeLa, NRK, Cos-7 veya belirli hücre kültürünü belirli photoactivation deneyler için kullanılacak gibi kullanın. DMEM (% 10 fetal Sığır serum ve 2 mM glutamin ile desteklenmiş) ve tripsin olmadan fenol red kullanın (bakınız Tablo reçetesiarka plan floresans azaltmak için).
- Tripsin konfluent bir kültür hücrelerinin ayırmak, hücre süspansiyon Neubauer odası ve tohum 5.000 – 10.000 hücre iyi kullanarak hücreleri saymak. Alternatif olarak, 1 damla 2 mL pipet 10 mL hücre süspansiyon yetiştirilen konfluent hücre kültüründen gelen bir T 25-hücre kültürü şişesi veya 5 mL hücre süspansiyon bir T 12,5-hücre kültürü şişeye yetiştirilen konfluent kültüründen gelen 3 damla kullanın.
- 8-şey odalarında #1.0 kapaklı hücrelerin büyümesine ( Tablo malzemelerigörmek) Floresan yaşamak-cep mikroskobu için cam.
- GFP protokolüyle Distribütör'ın başına ticari reaktifler (bkz. Tablo reçetesi) kullanarak kaplama sonra hücreleri 24 h transfect — kiraz, PA-GFP — kiraz ve GFP — PA-kiraz chimeras.
- Görüntü hücre sonra 20 h toplam protein ifade, katlama ve olgunlaşma için izin vermek için transfection posta.
3. görüntüleme ve Photoactivation
- Görüntü hücrelerde 37 santigrat derece, oksijen ve ısıtmalı çevre odası. Hücre medya fizyolojik pH Tampon ve CO2işlemek için-bağımsız, 20 mM HEPES ekleme veya CO2 gaz %5 akışı için ayarla.
- İlk olarak, görüntü GFP ifade hücreleri — kiraz inşa etmek. Zaman entegre lazer yoğunluğu her piksel için tanımlayan bir confocal görüntü, Yani, piksel Işınma Zamanı mikrosaniye, yüzde ve dijital zoom acousto optik ayarlanabilir filtre (AOTF) iletim parametreleri ayarlayın.
Not: 60 x objektif ve 3 x dijital zoom kullanarak yeterli büyütme sağlarken, bir hücrenin tamamını görüntüleme sağlar. Öyle ki herhangi bir beyazlatma olmadan iyi bir sinyal / gürültü oranı resimleri göster ve floresan yoğunluğu doygunluk gösteren hiçbir piksel 2-4 μs ve AOTF iletimi için 488-nm ve 561-nm lazer için piksel Işınma Zamanı ayarlayın. - Görüntü, set lazer güç, AOTF iletim, piksel Işınma Zamanı ve dijital zoom, 15-20 hücreleri GFP ifade kullanarak — kiraz.
- Sonra aynı set lazer gücü, piksel Işınma Zamanı, AOTF iletim ve dijital zoom hücreleri GFP ifade ile görüntü — PA-kiraz ve PA-GFP — kiraz. Arama Yeşil kanal veya kırmızı kanalı, hücreler sırasıyla ifade etmek için. Hücrelerin uzun pozlama hücreleri floresan proteinler çamaşır suyu değil için ifade etmek için arama sırasında kaçının.
- Bir pre-harekete geçirmek resim ve üç etkinleştirme sonrası görüntüleri ile bir mini saat serilerini ayarlayın. Etkinleştirme sonrası görüntüleri UV ışık maruz nedeniyle olası geçici karanlık Birleşik tanımlanmasına yardımcı olacak.
Not: algılanan floresan yoğunluğu nedeniyle geçici karanlık Birleşik değişimler bizim ellerimizde olduğunu < % 1 olabilir ihmal, ama karanlık iller deneysel her kurulum için tespit edilebilir. - Photoactivation verimliliği belirlemek için Yani, zaten kurulmuş olan, belirli photoactivation deneylerde floresan olmak için açýk PA-FPs kısmını uygulamak aynı photoactivation ayarları 15-20 hücrelere bu Burada tanıtılan iç cetveller ifade eden ve görüntü analizi (Bölüm 4) ile devam edin. Photoactivation deneyler ayarlamak başlayan, burada birkaç farklı ayarlar PA-GFP ve PA-Cherry ile deneysel bizim deneyim dayalı bulmak; gerekli değişiklikleri yapın.
- İçin anlık photoactivation PA-GFP ve PA-kiraz mikroskop (CLSM) tarama confocal lazer kullanarak 405 nm lazer ışığı 3 veya 5 yinelemelerde, 90 μW sırasıyla uygulayın.
Not: mikroskobik yapımız ile % 38 AOTM iletim ve bir 2 μs piksel Işınma Zamanı kullanarak bu 405 nm lazer güç objektif lens satır tarama modunda şiddetindeydi. Bu ayarlar ile % 8 ve % 16'pa-GFP ve PA-kiraz ifade photoactivated floresan olmak olabilir. İçin anlık photoactivation oldu CLSM kullanarak tüm titrasyon serisi daha önce17yayınlandı. - Photoactivated PA-GFP ve PA-kiraz fluorophores daha yüksek bir kısmını daha yüksek sinyal gürültü oranı elde etmek için avantajlı Örneğin ise ve photoactivation hemen olmak zorunda değil, 405 nm lazer ışığı bir 2 μs piksel Işınma Zamanı ve %6 40 μW uygulamak AOTF iletim 450 yineleme için. O zaman, photoactivation 4 dakikaya aksine sadece 1-2 saniye kadar sürer ama photoactivation verimlilik için PA-GFP %29 yerine % 8, bir daha yüksek sinyal gürültü oranı için izin olacak.
- İçin anlık photoactivation PA-GFP ve PA-kiraz mikroskop (CLSM) tarama confocal lazer kullanarak 405 nm lazer ışığı 3 veya 5 yinelemelerde, 90 μW sırasıyla uygulayın.
- Mikro ayna dizide bir kayma ışık modülatörü de içeren bir mozaik dijital aydınlatma sistemi varsa, 405 nm lazer ışık widefield-photoactivation için kullanılabilir. Bu milisaniye içinde verimli photoactivation olanak sağlar.
Not: objektif lens ve bir çekim hızı 250 MS ölçülen 1.6 mW lazer gücü ile PA-GFP % 29 floresan olmak photoactivated olabilir. - Herhangi bir ayarlama photoactivation parametreleri ile 15-20 hücreleri PA-GFP ifade görüntü — kiraz ve GFP — PA-kiraz, anılan sıraya göre.
- PH, reaktif oksijen türleri ve diğer çevresel faktörler photoactivation etkinliğini etkileyebilir beri ilgi protein nerede PA-FPs ilgili hücre altı micromilieu photoactivation verimliliği değerlendirmek önemli olabilir yer. Plazma zarı protein VSVG 18ile yazarlar yaptıkları gibi faiz protein fluorophore chimeras kaplin tarafından photoactivation verimliliği ilgi belirli hücre altı kompartımanda değerlendirilebilir.
4. analiz ve algoritma Ratiometric Yoğunluk merkezli miktar Photoactivation verimlilik için görüntü
- Görüntü analizi açık kaynak resim platformlar ImageJ veya Fiji işlem yapılabilir. Arka plan floresan yoğunluğu olmayan transfected hücrelerinde yeşil (B1) ve kırmızı (B2) Kanal belirlemek. Perinükleer veya artan otomatik floresans gösterilen herhangi bir yerlerde kaçının.
- Transfected hücrede floresan yoğunluğu belirlemek için hücre vücuttaki serbest seçim aracıyla anahat. Yine, Perinükleer veya otomatik floresans gösterilen herhangi bir diğer yerlerde kaçının.
- Her kanaldaki ölçülen floresan yoğunluğu arka plan çıkarma.
BenG =Green_measured – B1
BenR =Red_measured – B2 - GFP kullanın — (RtoGr) kırmızı yeşil oranını hesaplamak ve donör Şoklama floresans rezonans enerji aktarımı (FRET) nedeniyle için düzeltmek için kiraz bu seçeneği oluşturun. PERDE verimliliği E 0,3 GFP için önceki deneylerde olduğu tespit — kiraz yapýsý iki fluorophores18arasında aynı amino asit Bağlayıcısı'nı kullanarak.
RtoGr = (benRed_measured -B2) / (benGreen_measured -B1)
RtoGrcorr RtoGr = * (1-E)
Not: Bu yoğunluğu-dayalı yaklaşım, mEGFP ve PA-mGFP için Şoklama donör değil karakterize olası farklı spektral özellikleri göz önüne alındığında farklı olabilir. MEGFP ve PA-mGFP için tespit değil donör kuantum verimi FRET (kET) oranı ve Foerster mesafe (R0) bağlıdır. - GFP kullanın — photoactivated PA-kiraz kısmını değerlendirmek için bu PA-kiraz seçeneği oluşturun. GFP ölçülen unquenched yeşil floresan yoğunluğu çarparak PA-kiraz beklenen floresans yoğunluğunu belirlemek — PA-kiraz inşa önceden düzeltilmiş kırmızı-için-yeşil-oranı ile photoactivation (RtoGrcorr ).
BenRed_expected = (Green_measured -B1ı) * RtoGrcorr
Not: yukarıda belirtildiği şekilde, her zaman açık FP ve FP photoactivatable moleküler parlaklığını farklı olabilir. Tartışma bu farklar için hesap hakkında daha fazla bilgi için bkz:. - PA-kiraz photoactivation verimliliği ölçülen kırmızı floresans yoğunluğu sonra photoactivation ve kırmızı kanalı beklenen floresan yoğunluğu bir kesir olarak hesaplayın.
(FPA-Cherry) = (benRed_measured -B2) / benRed_expected - PA-GFP kullanın — photoactivated PA-GFP kısmını değerlendirmek için kiraz bu seçeneği oluşturun. PA-GFP ölçülen kırmızı floresans yoğunluğunu bölerek PA-GFP beklenen floresans yoğunluğunu belirlemek — kiraz kırmızı-için-yeşil-oranı tarafından (RtoGr) önceki photoactivation oluşturmak. Burada, RtoGr aynı miktarda Şoklama donör GFP ve PA-GFP tabidir çünkü Şoklama, donör için düzeltilmesi gerekmez.
BenGreen_expected = (benRed_measured -B2) / RtoGr - PA-GFP photoactivation verimliliği ölçülen yeşil floresan yoğunluğu sonra photoactivation ve yeşil kanal beklenen floresan yoğunluğu bir kesir olarak hesaplayın.
(FPA-GFP) = (benGreen_measured -B1) / benGreen_expected
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada sunulan Protokolü floresan olmak photoactivated vardır floresan proteinler kısmını ratiometric miktar gösterir (resim 1). Bu kesir photoactivation modu bağlı farklıdır.
Mikroskop (CLSM) tarama confocal lazer ile kısa sürede yüksek güçlü photoactivation kullanarak tipik bir sonucu Şekil 2 cile gösterilir. Objektif lens piksel tarafından ölçülen lazer güç titrating...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Şimdiye kadar herhangi bir yöntem toplu olarak PA-canlı hücrelerde ifade photoactivated floresan olmak olan FPs kısmını belirlemek için var olmamıştır. Sunulan Protokolü herhangi bir hayalice farklı floresan protein çifti için kullanılabilir. PA-FPs PA-GFP ve PA-kiraz burada geri dönüşü olmayan örneği, bu yaklaşım ilke photoconvertible proteinler için de geçerlidir iken. Hayalice farklı floresan protein, ancak, dikkatli bir şekilde photoconvertible floresan proteinler onların absorbans ve emisyon spectra, Örneğin
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Dorigo laboratuvar ve Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji Imaging servis ekipmanları ve mekan bu proje için sağlamak için teşekkür etmek istiyorum.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| pEGFP-N1 memeli hücre ekspresyon vektörü | Clontech | ||
| DMEM fenol kırmızısı olmadan | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fenol kırmızısı olmayan tripsin | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamin (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8 kuyulu odalar #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
Kaynaklar
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944(2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
