Burada, genetik olarak eşleşmiş hayalice ayrı photoactivatable ve floresan proteinler içerir bir iletişim kuralı mevcut. Bu floresan protein chimeras miktar photoactivated Yani, floresan, olmak olduğunu PA-FP fraksiyonunun photoactivation verimliliği izin verir. Protokol photoactivation farklı modları farklı photoactivation verimliliği verim ortaya koymaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Nasıl Photoactivated floresan proteinler toplu olarak ve canlı hücrelerdeki kısmını ölçmek için
Bu makalede
Özet
Özet
Photoactivatable ve - Cabrio floresan proteinler (PA-FPs) Floresan yaşamak-cep mikroskobu içinde hücreleri ve protein topluluğu dinamiklerini analiz etmek için kullanılmaya başlandı. Şimdiye kadar herhangi bir yöntem toplu olarak ölçmek kullanılmaktadır ve PA-fps kaç ifade canlı hücreleri belli photoactivated vardır.
Burada, biz iç cetveller içeren bir protokolü mevcut, Yani, genetik olarak ratiometrically için hayalice farklı (photoactivatable) Floresan proteinler, birleşince tüm PA-FPs olması için açýk bir hücreye ifade kısmını ölçmek Floresan. Bu iletişim kuralını kullanan, gösterdiğimiz photoactivation farklı modları farklı photoactivation verimliliği vermiştir. Mikroskop (CLSM) tarama confocal lazer ile kısa yüksek güçlü photoactivation kadar dört kez daha düşük photoactivation verimliliği yüzlerce alt düzey Etkilenmeler CLSM tarafından uygulanan veya widefield aydınlatma tarafından uygulanan kısa bir darbe daha sonuçlandı. Protokol burada (PA-) GFP ve (PA-) kiraz için örneği iken, bu prensip olarak hayalice farklı herhangi bir photoactivatable veya photoconvertible floresan protein çifti ve deneysel herhangi bir kurulum için uygulanabilir.
Giriş
2002 yılında, ilk genel olarak uygulanabilir photoactivatable (PA-GFP1) ve photoconvertible (Kaede2) Floresan proteinler tarif edildi. Bu optik vurgulayıcı floresan proteinler UV-ışık, Yani, ışınlama üzerine spektral özellikleri değiştirmek onlar parlak hale (photoactivatable floresan proteinler, Yani, PA-kare/sn), onların rengi (photoconvertible veya değiştirme FPs). Bugüne kadar çeşitli geri dönüşümlü ve geri dönüşümsüz photoactivatable ve photoconvertible floresan proteinler Gelişmiş3,4olmuştur. Topluluk veya toplu çalışmalarda optik vurgulay....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. plazmid İnşaat
- İki renkli füzyon probları oluşturmak. Memeli hücre ifade vektör kullanın (bkz. Tablo reçetesi) hangi mCherry112 ve PA-mCherry113 ile kısıtlama eklenmiş olan içinde siteleri AgeI ve BsrGI.
- Sipariş özel oligo-eGFP ve PA-eGFP A206K mutasyon, Yani, mEGFP ve PA-mEGFP14 kodonu SalI-BamHI parçası olarak olmadan içeren monomeric türevleri yükseltmek için nükleotit. Bu SalI-BamHI parçası ifade vektör klonlama birden çok siteye eklemek ve N-terminal astar 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada sunulan Protokolü floresan olmak photoactivated vardır floresan proteinler kısmını ratiometric miktar gösterir (resim 1). Bu kesir photoactivation modu bağlı farklıdır.
Mikroskop (CLSM) tarama confocal lazer ile kısa sürede yüksek güçlü photoactivation kullanarak tipik bir sonucu Şekil 2 cile gösterilir. Objektif lens piksel tarafından ölçülen lazer güç titrating.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Şimdiye kadar herhangi bir yöntem toplu olarak PA-canlı hücrelerde ifade photoactivated floresan olmak olan FPs kısmını belirlemek için var olmamıştır. Sunulan Protokolü herhangi bir hayalice farklı floresan protein çifti için kullanılabilir. PA-FPs PA-GFP ve PA-kiraz burada geri dönüşü olmayan örneği, bu yaklaşım ilke photoconvertible proteinler için de geçerlidir iken. Hayalice farklı floresan protein, ancak, dikkatli bir şekilde photoconvertible floresan proteinler onların absorbans ve emisyon spectra, Örneğin
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Dorigo laboratuvar ve Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji Imaging servis ekipmanları ve mekan bu proje için sağlamak için teşekkür etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| pEGFP-N1 memeli hücre ekspresyon vektörü | Clontech | ||
| DMEM fenol kırmızısı olmadan | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fenol kırmızısı olmayan tripsin | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamin (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8 kuyulu odalar #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
Kaynaklar
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
