Yöntem makalesi

Biocytin kurtarma ve dolgulu hipokampal CA2 Interneurons 3D rekonstrüksiyonu

11K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58592

⸱

20 Kasım 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University College London

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada özetlenen protokolünü ayirt analizi, biocytin kurtarma ve hücre içi elektrofizyolojik kayıtlar in vitro nöron izin takip hipokampal CA2 interneurons yüksek kaliteli rekonstrüksiyonlar açıklar karakterizasyonu ve belirlenmesi için sonuçta iyi nöronal anatomisi.

Özet

Kortikal ağ etkinliğini işler nasıl bilgi çok sayıda temel ve klinik bilimsel sorular için önem taşımaktadır. Burada açıklanan protokol temel yapı taşları olan bu devreyi tanımlar. Kortikal bölgelerde ayrıntılı çalışmalar sonunda devre elemanları ile diğer bilim adamları beyin nasıl edinme bir anlayış için gerekli, işler ve bilgi ve ne hastalığında ise elektrofizyolojik terslik depolar sağlayacaktır ve morfolojik veri bilgi işleme keşfetmek modeli ağları inşaat Hesaplamalı nörologlar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada özetlenen protokolünü açıklar nasıl biocytin dolu hücreleri oluşur CA2 bölgede kaydedilen kurtarıldı ve 3D yeniden. Ayrıca, kalsiyum bağlayıcı protein veya peptid kaydedilen interneurons içerik gösteri protokolünü açıklar.

Giriş

Korteks ve hipokampus nöronal sınıflandırılması1,2,3,4, onları arasındaki bağlantıları haritalar5,6 alt türlerinden ki böyle karmaşıklık yapılardır , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 ve nasıl bu devre bilişsel işlevler12,13,14,15 destekler hala yoğun çalışma ve sürekli tartışma konusu altında bulunmaktadır. Örneğin, Ayrıntılar ve devreyi karmaşıklığı anlamak ve birçok farklı çalışmalardan elde edilen veriler koordine etmek tanımlamak ve bileşenleri tanımlamak edebilmek son derece yararlı olur, ancak bir konu tartışma için nasıl kalır çok farklı nöronların sınıfları var, ya da düz olup bütün nöronlar belirli bir sınıfa ait olarak tanımlamak mümkündür. Yapı ve devreleri derecelerde karmaşıklığı ile test hesaplama araçları Gelişmiş16,17,18davranıyorsun, ama detaylı çalışmalar hücre tiplerinin ihtiyacını bu çabalar için merkezi bir noktada bulunuyor ve aralarındaki bağlantıları özellikleri. Yetişkin fareler yeni korteksimiz yerel devre hakkında bilgi büyük miktarda zaten kullanılarak toplanmış protokol burada10,19,20,21, anlatılan 22. her ne kadar "bağlantı şeması" uzak tamamlandıktan, bazı desenler açık veya kurallar ortaya çıkmıştır. Her ne kadar bazı ayrıntılar değişir, Ayrıca, bu kurallar için insan yeni korteksimiz eşit uygulanabilir olması muhtemeldir temel yapı taşları gelişimi sağlayan iki memeli türü (fare ve kedi) ve birçok neocortical yerinde, yaygındır. Burada açıklanan tekniği kortikal devresi fonksiyonel Haritası anlayışımızı presynaptic ve postsinaptik nöronların bağlantılarını daha önce ayrıntılı bir iletişim kuralı kullanılarak incelenmiştir değil bölgelerde yer tespit ederek genişletmek için kullanılan Bu yetişkin beyin dokusunda mükemmel doku koruma ve dikkat çekici boyama kurtarma sağlar. CA2 yerel devre ve nöronal bu alt alan özelliklerinde veri doldurma biocytin ile hücre içi elektrofizyolojik kayıtlar (keskin microelectrodes ile eşleştirilmiş kayıtları) birleştirerek bu yöntemle toplanmıştır, ayirt, histolojik yordamlar ve komşu CA bölgeleri23,24,25ile doğrudan karşılaştırma izin nöronal rekonstrüksiyonu, çok detaylı.

Bu makalede açıklanan tekniği detaylı nöronal anatomi hücreleri ve yüksek kaliteli doğru sınıflandırılması ve her iki onların dendritik ve aksonal arbors, olabilecek veriler doğru rekonstrüksiyonlar izin vererek elde etmek için yıllar boyunca geliştirilen keskin elektrotları kullanarak eşleştirilmiş kayıtları toplanan elektrofizyolojik verilerle ilişkili. Histolojik protokolü, nöronlar ultrastructure korumak ve dendritik (dahil dikenleri) ve aksonal arbors mükemmel kurtarma elde etmek için en iyi duruma getirilmiş. Örneğin, ilk olarak bir sabitleştirici çözümde çeker ve ikincisi osmiyum tetroxide sonrası sabitleme tarafından Çift Kişilik fiksasyon tekniği prensibi ışık mikroskobu26için iyi bir kontrast sağlar. Oxazolidin ve bir çözüm pikrik asit az miktarda antikor penetrasyonu artırmak için ve önerilen bir önceki çalışma27' deki hücre ultrastructure korumak için sabitleştirici çözüm için eklenir. Cryo-koruma geleneksel bir deterjan yerine sukroz ile birlikte donma-çözülme yöntemini kullanarak beyin dilimler permeabilization de kaydedilen hücre detaylı morfolojik analiz için dokuların en iyi koruma sağlar. Buna ek olarak, özellikle çok güzel yapıların görselleştirme incubations hidrojen peroksit (H2O2) ve sodyum borhidrür (NaBH4) ile arka plan boyama azaltarak artırıldı. Nikel klorür (NiCl2) horseradish peroksidaz (HRP) ekleyerek bir siyah pigment reaksiyon ürünü elde etmek için tepki de karşıtlığı artırır.

Aşağıdaki iletişim kuralı mükemmel doku koruma ve son derece detaylı nöronal 3D rekonstrüksiyonlar hücre içi kayıtları vitrotakip tespit etmek için kullanılan yordamları açıklar. Dilim hazırlık açıklaması, hücre içi eşleştirilmiş kayıtları kullanarak elektrotlar keskin ve bizim Laboratuvarda kullanılan sonraki histolojik yordamlar daha önce raporlanmış28olmuştur. Her ne kadar intracellularly biocytin 450-500 mikron kalınlığında dilimler içinde dolu hücre iletişim kuralının uygulandığı, aynı iletişim kuralını bütün hücreli kayıtları aşağıdaki kullanılabilir. Ancak, daha ince dilimleri kullanımı hücreleri daha az komple rekonstrüksiyonu içinde sonuçlanır.

Protokol

Bu çalışma kullanılan tüm yordamlar ile ilgili hayvan bilimsel yordamlar Yasası 1986 İngiliz İçişleri Bakanlığı yönetmeliklerine göre yapılmıştır.

1. kalsiyum bağlayıcı Protein veya Protein içeriği aşağıdaki elektrofizyolojik kayıtlar ve Biocytin dolum Biocytin görselleştirme ve Interneurons tespiti

Not: elektrofizyolojik Kayıtlar sonunda önce gecede histolojik yordamlar içeren hücreler biocytin dolu dilimleri sabitlenir. Yordamın kalan kısmını başka bir gün, doku hasarı önlemek için gerçekleştirilir sabitleştirici çözüm 0.1 M fosfat tampon bir tek değişiklikle ertesi sabah değiştirilir. Fiksasyon çözüm (%4 paraformaldehyde, %0.2 doymuş pikrik asit çözeltisi, % 0,025 oxazolidin çözüm 0.1 M fosfat tampon (PB)) kayıtları gün en iyi sonuç için taze yapılmalıdır.

  1. Elektrofizyolojik kayıt sonundaki dikkatle bir boya fırçası ile kaydedilen hücreleri içeren dilim alın ve yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) içeren bir tencereye koyun.
    Not: Dilim hazırlık ve keskin elektrotları kullanarak hücre içi kayıtları için kullanılan protokolü ayrıntılarının olmuştur daha önce açıklanan28.
  2. Bir duman başlıklı dikkatle beyin dilim bir boya fırçası ile almak ve kaliteli filtre kağıdı küçük bir parça üzerine rulo. Dilimi üzerine ıslatılmış süzgeç kağıt başka bir parça yerleştirin ve ıslak filtre kağıt iki adet 5-10 mL sabitleştirici çözüm ve gecede 4 ° C'de buzdolabı deposunda içeren küçük bir plastik kap yerleştirin
  3. Distile su içinde jelatin çözeltisi hazırlamak. Sıcak plaka üzerinde bir ölçek 20 mL distile su koyun ve 60 ° c ısı Suya kademeli 2.4 g jelatin ekleyin, eriyene kadar bekleyin ve 35-40 ° C ile doku hasarı önlemek için kullanmadan önce soğumasını bekleyin.
  4. Sabitleştirici çözüm 2 mL 0.1 M PB ile değiştirin. Dilimi bir Petri kabına yerleştirin ve herhangi bir aşırı doku bir neşter bıçakla kesip. (9 cm çapında, yükseklik 1.4 cm) kabında bölünen doku yerleştirmek, bu yatıyor olmak hiçbir kıvrımlar veya kırışıklıklar ile düz ve kuru bir fırça kullanarak aşırı arabellek kaldırma.
  5. Sıcak jelatin çözüm dokuyla kapak ve hızlı bir şekilde çözüm soğumasını donmuş bir blok üzerine Petri kabına yerleştirin.
  6. Kontrast sağlamak için bir açı-dengeli lamba kullanarak, çanak yan bakmak ve dilimi ayarlamak jelatin başlayana kadar iyi bir boya fırçası gelen hafif basınç kullanarak düz tutun.
    Not: doku düz yalan söylemez, jelatin yeniden erimiş olabilir. Yüzey katmanı yavaşça yüzeye yakın lamba ampul birkaç saniye boyunca hareket ettirerek erime gibi bu katılaşır Fırça kaldırma tarafından neden jelatin yüzeyinde herhangi bir kusurları kaldırılmış olabilir.
  7. Çanak ayarı jelatin buzdolabına taşımak ve 30-60 dk 4 ° C'de bırakın.
  8. Bir duman başlık, küçük bir blok kesme (~ 1 x 1 cm) bir neşter bıçak kullanarak yemeğin jelatin gömülü doku içeren, küçük bir spatula kullanarak blok Asansör ve dikkatle dilimler için en az 30 dk 4 ° C'de düzeltmek için kullanılan aynı ama taze sabitleştirici çözüm içinde yer .
  9. Jelatin blok 5 mL 0.1 M PB üç kere yıka, bir parça kağıt doku ve yapıştırıcı kullanarak (Örneğin, üst dokusuyla) kadar blok tarafı bir vibratome üzerine chuck stick kullanarak Makinası.
  10. Aşırı yapıştırıcı ile bir filtre kağıt parçası kaldırmak ve eşkenar dörtgen bırakarak bir neşter bıçak blok köşeleri kesmek için kullanın.
  11. Bir vibratome kullanarak 50 µm kalınlık dilimle bölüm ve her bölümü dikkatle % 10 Sükroz içeren bir cam şişede yer.
  12. Dikkatle şişeyi bir bölümünden almak, düz bir Petri kabına kapak yerleştirin. Diseksiyon mikroskop ve taze neşter bıçak kullanarak, gelen jelatin bölümü çevresinde kaldırmak ve Bölüm 2 mL taze % 10 Sükroz içeren bir flakon dönmek
    Not: Bu aşamada doku büzülme dehidratasyon adımında (adım 1.37) azaltmak için mümkün olduğu kadar jelatin kaldırmak çok önemlidir.
  13. Cryo-korumak onları % 10 sükroz çözüm, % 20 sükroz - %6 gliserol çözüm içinde 20 dk 10 min için iki kez ve son olarak 30 dk içinde % 30 sükroz - %12 gliserol çözüm kuluçka tarafından oda sıcaklığında 0.1 M PB tabanlı sükroz-gliserol çözüm bölümlerde iki kez altında sürekli ajitasyon.
  14. Kalay folyo bir fırça kullanarak düz üzerine küçük bir dikdörtgen bölümlerine yerleştirin. Bölümlerden herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak ve dikkatle kalay folyo bir paket katlayın.
  15. Sıvı azot yüzeyine yakın parsel için 30 yüzey dokunmadan tutun s ve tamamen yaklaşık 30 s. tekrarlamak için donma-çözülme başka bir iki kez çözülme bölümler olanak sağlar.
  16. Bir boya fırçası ile tüm bölümleri kaldırın ve 2 mL 0.1 M PB sürekli ajitasyon altında aşırı sükroz yıkamak için içeren bir cam şişe yer onları.
  17. PB Pasteur pipet ile kaldırın ve 30 dk. yıkamak için 2 ml 0.1 M PB bölümleri bölümlerde 2 mL % 1'sulu H2O2 kuluçkaya 3 x 5 dak.
  18. Pasteur pipet ile 0.1 M PB kaldırın ve 0.1 M PB % 1 sodyum borhidrür (NaBH4) ekleyin.
    Not:4 çözüm hidrojen gaz kapalı verir NaBH olarak şişe kap değil.
  19. Pasteur pipet ile sodyum borhidrür kaldırmak ve bölümleri 2 mL 0.1 M PB iyice içinde yıkayın 5 x 5 dak.
  20. 0.1 M PB % 10 normal keçi serum (NGS) 0.1 M PB 30 dk içinde değiştirin.
  21. Keçi serum kaldırmak ve gecede 4 ° C'de fare monoklonal ve tavşan poliklonal antikorlar ABC çözümde oluşan karışımı içinde bölümler kuluçkaya.
    Not: Tablo 1 ' de Botcher ve ark. birincil antikorlar önceki çalışmalarda kullanılan bir listesi görüntülenir (2014) 29.
  22. İkincil antikorlar (Tablo reçetesi) fluorescently etiketli bir karışımı karanlıkta 2 h için bölümleri kuluçkaya.
  23. Bölümleri montaj orta ve bir coverslip ile kapak slayta bağlayın.
  24. Floresans 40 X büyütme (Şekil 1Bb) etiketleme görüntü alabilir.
  25. Imaging floresan sonra bir cam Petri PBS içeren slayta yerleştirin ve coverslip dikkatli bir şekilde çıkarın. Sonra PBS nazik bakliyat Pasteur pipet üzerinden kullanarak slayt bölümleri yıkayın. Bölümleri PBS içeren bir temiz cam şişe yerleştirin.
  26. Avidin-HRP tepki öncelikle HRP reaksiyon ürünü yükseltmek için en az 2 h için ABC bölümlerde kuluçka tarafından gerçekleştirin.
  27. 3,5 diaminobenzidine (DAB) çözüm bir tablet için 5 mL distile su ekleyerek hazırlayın.
  28. PBS bölümlerle 10 min için üç kez yıkama ve sonra iki kez 10 dakika süreyle Tris arabelleği ile son yıkama sonra Tris arabellek kaldırın.
  29. Hızlı bir şekilde % 8 NiCl2 çözüm bir damla DAB ekleyin, ve dışarı mix ve hızlı bir şekilde bu çözümün 1 mL üzerinde bölümler eklemek için çözüm pipette. 15 dakika DAB/NiCl2 çözüm bölümlerde kuluçkaya.
  30. 10 µL % 1 H2O2 DAB ekleyin. Tepki altında yaklaşık 1-2 min için sürekli ajitasyon karanlıkta sürdürmek ve doldurulmuş hücreler diseksiyon mikroskop ile etiketleme izlemek izin verir.
  31. DAB/NiCl2/h2O2 çözüm kaldırarak reaksiyonu durdurmak ve 5 min için iki kez Tris arabellek bölümlerle yıkayın.
  32. Duman Hood, filtre kağıdı küçük bir daire bir Petri kabına yerleştirin ve 0.1 M PB ile nemlendirin. Teker teker camdan bir fırça kullanarak şişe ve dikkatli bir şekilde düz kağıt üzerine koyup bölümleri kaldırın.
  33. Filtre kağıdı başka bir nemlendirilmiş daire ile bölümlerini kapsayacak ve aşırı arabellek doku kağıt yüzeyine dokunarak yavaşça kaldırın.
  34. Uygulamak 8 – 9 damla % 1 osmiyum tetroxide 0.1 M PB içinde en iyi kağıt, çanak kapağı ve en az 30 dk ama en fazla 1 saat için duman başlıklı korumak.
  35. Petri kabına açmak ve en iyi filtre kağıdı kaldırın. Bölümleri çýkýntýdan tek bir fırça ile tek bir cam şişede yer onları ve onları iki kez distile suyla durulayın.
  36. Osmiyum tetroxide kaybı uygun şekilde atın. Tüm tek kullanımlık ekipman durulayın ve uygun kutulara koyun.
  37. Her bölüm bir cam slayt ve coverslip üzerine düz bölümleri yerleştirin. Slaydı bir Petri kabına aktarmak, bir boş cam şişe içinde yer ve % 50 alkol ile kapak korumak için coverslip üzerine getirin. 15 dk sonra slayt çözümden kaldırmak ve slayttan bölümleri kaldırın. Bu bölümleri slayt üzerinde geri ve sonra % 70 alkol 15 dakika süreyle slayt yer yer % 95 ve son olarak %100 alkol çözüm aynı işlemi tekrarlayın.
  38. Dehidratasyon adım bölümlerde bir shaker duman başlıklı %100 alkol içeren bir cam şişe aktarın. Alkol çözüm propilen oksit (C3H6O) ile değiştirin ve üç kez 5 dakika yıkayın. Son yıkama sonrasında propilen oksit ~ 2 mL şişede tutmak ve reçine (1:1 oran) ekleyin. Reçine tasfiye edilir sağlamak ve bölümler 30 dk için sürekli ajitasyon altında tutun.
  39. Her bölüm bir tahta sopa kullanarak epoksi reçine içeren bir alüminyum planchette yerleştirin ve gecede kuluçkaya.
    Not: reçine bölümleri zarar riskini önlemek için 24 saat uzun bölümlerde bırakmayın.
  40. Yaklaşık 10 dakika süreyle sıcak bir tabak üzerinde planchette almak kadar her yer bir tahta sopa ile bölüm ve temiz bir slayt üzerinde koyun. Her bölüm yönünü tutarlı bir diseksiyon mikroskop kullanarak tutmak. Bir coverslip bölümler yerleştirin. Slayt 48 h kür için 56 ° c fırında yerleştirin.

2. 3D nöronal rekonstrüksiyonu

Not: Neurolucida yazılım kullanılır. Aşağıda verilen talimatları yalnızca belirli nöron imar sistemi (Malzemeler tablo) için geçerlidir. Kesme üzerinden elde edilen bölümler bir mikroskop kullanarak rekonstrüksiyonlar önce eşleştirilir.

  1. Sahne Alanı'nda bir slayt yer ve sahne klip ile güvenli ve nöron imar yazılımını açın. Al sekmesini ve canlı resmiseçin.
  2. Kalınlığı 100 X Petrol objektif lens kullanarak her bölümün ölçmek. Z metrelik üst ve alt her bölümün üzerinde değeri not alın ve bölüm kalınlık olarak iki değer arasındaki farkı hesaplar.
  3. Hücre vücut içeren Ana sayfa bölümüne odaklanmak için bir düşük-büyütme objektif kullanın. 100 x objektif kullanın, hücre vücut üzerinde odaklanmak ve merkezini referans noktası işaretlemek için tıklatın.
  4. İzleme sekmesinden Seri Bölüm Yöneticisi'niseçin. Sonra Kayıt yeni bölümü (+ simgesi) Seri Bölüm Yöneticisi penceresinde seçin. Bölüm numarasını girin. Her bölüm doğru Z sırada adlandırın ve adım 2.2 içinde ölçülen kesme kalınlığı girin.
  5. Soma 100 X amacı istimal 3D izlemek için kontur izleme sekmesinden seçin ve hücre vücut kontur seçin. Hücre gövdesi çok başına odağı taşımak için joystick'i kullanýn. Puan Şu anda odakta olan parçası çevresinde tıklayarak yerleştirin. Sağ tıklatın ve bu ilk taslak bitirmek için Yakın kontur seçin. Hücre vücudun alt (Şekil 2) ulaşıncaya kadar farklı z pozisyonlarda bu işlemi yineleyin.
    Not: 3D görselleştirme 3D hücre gövdesine görselleştirmek için izleme sekmesini seçin.
  6. 100 X amacı istimal 2D hücre gövdesine izlemek için hücre vücut izleme sekmesini odak ortasındaki hücre vücudun nöron menüden seçin. Puan hücre vücut çevresini tıklayarak yerleştirin. Hücre vücut tamamlamak için sağ tıklatın ve hücre vücut bitirmekseçin.
  7. Dendritik arbor izlemek için Dendrite veya Apikal Dendrite nöron menüde seçin. İlk kısa, ilk segment çapı dendrite çapını eşleştirmek için imleç ayarlamak için farenin kaydırma tekerini kullanarak her dendrite için izleme. İzleme çapını ayarlamak için bölüm ve farenin kaydırma tekerini arasında taşımak için joystick kullanarak her dendrites takip et.
  8. İzleme ile canlı mikroskop imge hizalamasını denetleyin ve gerekirse, özellikle joystick kullanarak taşıdıktan sonra ayarlayın. İzleme sekmesinde, Hizalama izlemeyiseçin, üzerinde izleme'yi tıklatın ve sonra doğru konumu tıklatın.
  9. Bir düğüm ağacında ulaşıldığında, sağ tıklatın ve Bifurcating veya Trifurcating düğüm aþaðý açýlan menüsünden seçin.
  10. Bir şube sonuna ulaşıldığında, biten bir nöron menü açılır menüsünden seçin. Seçin doğru bitiş türü, i.e., bölümleri arasında eşleşen kolaylaştırmak için yüksek son, normal bitiş veya low biten .
  11. Bir kez geçerli bölümdeki tüm dendrites takip edilmiştir, Sevinç serbest sekmesini seçin ve hemen üstünde veya altında tamamlanan bölümüne eşleşen bir bölüme taşımak üstünde mikroskop büyütme azaltmak.
  12. Tamamlanan bölümüne eşleşen bir bölümünde dendrites arasında eşleşen noktalarını belirlemek için üzerinde hareket sekmesini tıklatın ve maç puanıseçin. Uyumlu olması için gereken puan sayısını seçin (üç veya daha fazla puan tercih edilir) ve ardından OKtuşuna basın. Tamamlanmış bir dal sonunu tıklatın ve dal'ı tıklatın. Her maç sayısı için bu işlemi yineleyin. 100 X büyütme doğru eşleşen emin olmak için bu adımları tekrarlayın.
  13. Eşleşen dalları doğrudan sonunu üzerinde sağ tıklatarak önceki bölümüne ekleyin. Şube ile tamamlanan izlenen şube ve daha önce açıklandığı gibi izleme satır sonu Ekle seçin.
  14. Her bölümün tüm dendrites izlendiği bir kez Axon nöron menüsünden seçerek işlemin aynısı kullanılarak axon izleyin.
  15. Giriş bölümüne yeniden yapılanma ile canlı mikroskop imge yeniden hizalayın ve kontür izleme sekmesini seçin bir önceden tanımlanmış kontur/katman kenarlık/bölge kenarlığı seçin ve izleme bir kontur boyunca gidin. Sonunda açık konturseçin. Tüm istenen katmanları ve bölge ana hatlarını izleme.
  16. 3D görselleştirme 3D rekonstrüksiyonlar görselleştirmek için izleme sekmesini kullanın.
  17. 3D rekonstrüksiyonu (Video 1) videoları kaydetmek için 3D yeniden açın ve Create filmaçın. Bir dosya hedef ayarla ve dönme hızı istenen. Bu dönüşü için 270 ° ayarlamak için tavsiye edilir. Kayıt işlemini başlatmak, bir kaç saniye, kayıt'ı seçin sonra Otomatik Döndür' ü tıklatın. Gerektiğinde kaydı durdurmak seçin. Bir video düzenleme yazılımı (Malzemeler tablo) ile video düzenleme.
  18. Dosyaları TIFF veya JPEG dosyaları vermek için dosya seçin | İhracat | Görüntü olarak dışa aktarma izleme. µM/piksel oranı seçin ve uygunseçin. Bir arka plan rengi seçin ve dosyayıseçin. Dosya adı, TIFF veya JPEG seçin ve Kaydettuşuna basın. Vektör dosyaları dosyaları vermek için dosya seçin | İhracat | Vektör dosyaları olarak dışa aktarma izleme.
  19. Xarakteristikaları analizleri gerçekleştirmek için bir neuron imar analiz yazılımı kullanın.
    1. Dendritik ağaçlar çözümlemek ve bir dendrogram elde etmek için Neurolucida Explorer'da dosyayı açın. Analiz seçin | Yapısı ve seçme Dendrogram aþaðý açýlan menüsünden (Şekil 3).
    2. 3D rekonstrüksiyonu (Şube karmaşıklığı, şube ve somas, yüzey alanı birimleri) kapsamlı xarakteristikaları analizini gerçekleştirmek için yazılım dosyasını açın. ' Nin Görünüm sekmesinde, Tümünü Seç' i tıklatın. Çözümlemek etiket seçin. O zaman yapısı ve Şube yapısı analizseçin.

3. sorun

  1. Kamera ayarlarını değiştirin. En iyi sonuç için daha az 100 ms için çekim hızı ayarlamak ve kazanç ve 0 olarak mümkün olduğunca yakın ofset.
  2. Nöron imar yazılım otomatik olarak izlenen kontür bir 3D hücre gövdesinde 3D görselleştirme izleme sekmesinde olarak görüntülemiyorsa, nesneleri seçin izleme sekmesini seçin, klavyedeki Ctrl tuşunu basılı tutun ve üzerinde çizilmiş kontür tıklatın, sağ tıklatın ve açılan menüde hücre vücut ayarla seçeneğini seçin.
  3. Bireysel bir şube z parametreleri ayarlamak, ağaç (nesneleri seçin izleme sekmesinde) seçin ve ayarlamak için sağ tıklatma menüsü aracılığıyla tüm noktaları z düzeltilmesi aşağı. Değiştir z konumu, seçin, ardından üst karakter z değeri seçin ve gerekli değer girin.
  4. Büyük bir mesafe üzerinden izleme taşımak gerekli olduğunda 'Gitmek' ' hareket' sekmesini kullanarak rekonstrüksiyonlar yeniden hizalayın.
  5. Ek düğümleri yeniden yapılanma sürecinde herhangi bir yere ekleyin. Düğümü sağ tıklayın (Nesne seçme içinde izleme sekmesini ve tıkırtı üstünde belgili tanımlık dal), yerleştirilmesini nerede şube seçin ve Seçili ağaç düğümü Ekleseçin. O zaman tıkırtı üstünde belgili tanımlık dal doğru konuma.
  6. Karmaşık bir nöron yeniden inşa zaman, izleme eşleşen dalları ayrı ayrı ve daha sonra onları dalı daha kolay tanımlanması için splice. Yeni bölüm dallarında ayrı ayrı izlemek ve sonra bu dallar önceki bölümde eşleşen dallarda spliced, sağ tıklatın ve seçin Spliceşube biten üzerinden hovering, o zaman sonunu üzerinden hovering tarafından ekleyin bu şube için spliced ve seçeneğini tıklatmaktır.
  7. Bir şube yanlış ağaca türü'nün altında takip Eğer ağaç seçin, sağ tıklatın ve Ağaç türünü değiştirseçin ve doğru ağaç türünü seçin.
  8. Bir nokta yanlış yerleştirilmiş olması durumunda, Ctrl + Zgerçekleştirmek veya izleme menüsünde son noktasını kaldırmak için geri al düğmesini tıklatın. Ancak, joystick bölümü arasında bir noktaya kaldırmaya çalışmadan önce taşımak için kullanılırsa, bu yordam çalışmaz. Bu durumda, şube sonlandığında nokta kaldırılmış olabilir. Noktası Kaldır'ı seçin (basın Nesne seçme ve tıkırtı üstünde belgili tanımlık dal), şube kaldırılması, sağ tıklatın ve seçin noktasının üzerine getirin.
  9. Emin Eğer iki dalı eşleştirilir ya 1) 3D Visualize izleme sekmesinde denetlemek için kullanırsınız, olup şube z-uçak içinde eşleşmesi veya 2) Göstermek kanat özelliği seri Bölüm Yöneticisi'nde görüntülemek için kullanmak hemen bölümleri Yukarıdaki ve gri geçerli bölümün altında.
  10. Bir bölümü Kuzey değil Ayarlamak XY ölçekleme araçları izleme sekmesini seçin ve x ekseni -1 olarak değiştirmek gidin. O zaman doğru Z-büzülme seçin ve z ekseni -1 olarak değiştirin. Sonra her zamanki gibi dalları izleyin. Bu değişiklikleri özgün yönünü vardı bir bölüme taşırken tersine çevirmek hatırlıyorum. X - ve z - ekseni değiştirme değil bitiş etiketleri dalını değiştirmek, yani doğru sonlar kullanılmakta olan'ın porno versiyonunu zaman dikkat çekmek.
  11. Kalınlığı kesim bölümü ile ölçülen takılı kalınlığı arasındaki önemli fark varsa doğru Z-büzülme düzeltilebilir. İzleme sekmesinde, alet, o zaman Z-büzülme düzeltmekseçin ve takılı kalınlığı tarafından bölünmüş kesme kalınlığı ondalık gösterimi olarak z ekseni için büzülme faktörünü girin.

Sonuçlar

Hipokampal CA2 nöronlarda elektrofizyolojik kayıtlar (rakamlar 1Ac, reklam ve 1Bc, Bd) takip biocytin ile doluydu. Dilimleri gecede kayıtları takip tespit edildi ve nörokimyasal ve morfolojik nöronlar karakterizasyonu burada açıklanan protokol sonrası açığa çıkarılmıştır.

Kalsiyum bağlayıcı protein veya dolgulu interneurons protein içeriği ilk birincil antikorlar ve daha sonra ile fluorescently etiketli ikincil antikorlar dilimleri kuluçka tarafından tespit edilmiştir. İnterneurons kayıtları sırasında ateş özellikleri kullanılan birincil antikorlar seçiminde belirleyecektir. Avidin-AMCA biocytin dolu interneuron görselleştirmek için kullanıldı ve anti-fare floresein isothiocyanate (FITC) ve keçi Anti-tavşan Texas kırmızı (TR) interneuronal (Şekil 1Bb) nörokimyasal karakterize etmek için kullanılmıştır.

Floresans görselleştirme, biocytin (Şekil 1Ab) ortaya çıkarmak için bir HRP protokolün kullanılmış olduğunu. CA2 interneurons ince detaylı anatomisi sonra bir nöron imar yazılım (Şekil 2 ve Şekil 3a) kullanarak 3D çizilmiştir. 3D yeniden kaydedilen ve CA2 içinde dolu bir sepet hücrenin bir video Videoiçinde görüntülenir. Dendritik ve aksonal arbors 450-500 mikron dilim derinliği içinde sınırlı Eğer nöronal rekonstrüksiyonlar tamamlandı olarak kabul edildi. Zavallı aksonal arbor boyama axon ilk segment ve çok proksimal dalları ile sınırlı üst veya alt dilimin veya bir boyama tarafından açık sonla kesilen dalları varlığı ile değerlendirildi. Şekil 4 iyi bir ve bir zavallı HRP boyama aşağıdaki biocytin görselleştirme örnekleri temsil eder.

3D rekonstrüksiyonu (Şekil 3) analizini xarakteristikaları şube karmaşıklığı, soma yüzey alanı ve yüzey alanı ve hacmi dendritik ve aksonal arbors göstermek için yürütülen olabilir.

figure-results-1
Resim 1 : İki türden sepeti hücre nöronal rekonstrüksiyonlar kaydedildi ve hipokampal CA2 bölgede doldurdu ve elektrofizyolojik veri hücre içi kayıtları takip elde edilen korelasyon vitro. Bu rakam önceki çalışmalar23,24değiştirildi. Bu tabaka Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (A) Aa: çizim tüp (1000 X) kullanarak sınırlı dendritik ve aksonal arbor CA2 sepet hücresiyle yeniden inşası. Dendrites siyah, ve akson kırmızı. AB: Burada açıklanan avidin-HRP protokol sonrası biocytin dolu sepet hücre görüntüsü. AC: Temsilcisi hyperpolarizing ve kısıtlı dendritik ve aksonal arbor bir CA2 sepet hücrenin geçerli enjeksiyon depolarize gerilim yanıt-e doğru iz. Reklam: Arbor sepet hücre bağlantıları daraltmak için CA2 piramit örneği keskin elektrotları kullanarak kaydedilen. Bileşik eksitatör Post sinaptik potansiyel (EPSP) ortalamalar kısa tren depresyon belirgin yanıt trenler için üç sivri için gösteri sırasında. (B) Ba: 2D çizim tüp (1000 X) kullanarak geniş dendritik ve aksonal arbors CA2 sepet hücresiyle inşası. Radyal CA2 bölge ve yatay olarak içinde SO ve SP CA2 ve CA3 bölgelerin tüm katmanından genişletilmiş dendritik ağacı bu sepet hücreye (siyah). Bir yatay dendrite de CA1 bölgeye ulaştı. CA3 ve CA1 bölgeler için genişletilmiş axon (kırmızılı). Bb: Biocytin dolu (AMCA boyama) sepeti hücresiydi PV-immunopositive (FITC boyama) ve CB-immunonegative (Texas-kırmızı boyama). BC: Temsilcisi hyperpolarizing ve geniş dendritik ve aksonal arbor bir CA2 sepet hücrenin geçerli enjeksiyon depolarize gerilim yanıt-e doğru iz. BD: Bileşik EPSP ortalamalar kısa tren kolaylaştırma belirgin yanıt trenler için üç sivri için gösteri sırasında. İnterneurons CA2 içinde kaydedilen diğer türleri örnekleri önceki çalışmalar25,30' u bulunabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

figure-results-2
Resim 2 : 3D Cep vücut yeniden yapılanma. (A)3D izleme hücre vücudun. Farklı z pozisyonlarında hücre vücuda odaklı iken takip farklı kontür görünümünü. (B) 3D görüş-in farklı kontür. (C) 3D görünümü farklı bir açıdan, hücre vücudun. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

figure-results-3
Şekil 3 : 3D nöronal rekonstrüksiyonlar morfometri analizleri. (A)CA2 dar arbor sepet cep 3D inşası. Dendritik her dal bir renk (yeşil, mavi, kırmızı ve pembe) tarafından temsil edilir ve ışık mavidir axon. (B) Dendrogram dendritik şube sayısını ve küreler konsantrik ile soma ve soma üzerinden 100 mikron aralıklarla içinde bulunan her kesimin uzunluğu temsil eden sepet hücre. Dendrogram renklerini dendrites CA2 piramidal hücrelerde (bir önceki çalışma23uyarlanmıştır) gerçekleştirilen xarakteristikaları analiz A. (C) örnekte karşılık gelmesi. Dendritik şube sayısını CA2 piramit hücre soma mesafeden karşı çizildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

figure-results-4
Şekil 4 : İyi (A) ve kötü (B) HRP boyama örnekleri. (A)Biocytin kurtarma ortaya CA2 içinde çok iyi dolu bir interneuron. Hücre vücut (CB) koyu lekeli ve açık ana hatları vardır. Dendrites boncuklu ve bazı spines (kırmızı yıldızlar tarafından temsil edilen) görüntülenir. Aksonal çardak (A) yoğun ve küçük boutons hediyeler. (B) örnek bir zavallı dendritik ve aksonal CA2 2 piramit hücrelerinin boyama. CB boyama ile Seviyelendirmeyi Temizle'yi hiçbir zayıf. Zavallı boyama sık sık çok az biocytin dolu dalları huzurunda kaynaklanan kısa elektrofizyolojik kayıtlar ile ilişkilidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Video 1: Stratum pyramidale, dendrites tüm katmanları ve akson CA2 stratum pyramidale ve bitişik katman oriens, soma ile sınırlı dendritik ağaç dikme (CA2 dar arbor sepet hücresi olarak da bilinir) CA2 sepet hücresiyle 3D nöronal inşası ve radiatum. Çok birkaç dal proksimal CA3 tabaka oriens ve CA3 stratum pyramidale ulaştı. Bu hücre elektrofizyolojik kayıtlar aşağıdaki biocytin ile doluydu ve bölümler avidin-HRP burada açıklanan protokol sonrası işlendi. Dendrites sağlam olmasına rağmen Dilimleme nedeniyle, yalnızca akson dilimi derinliği içinde kurtarıldı. Dendrites, koyu pembe ve beyaz axon. Katman ve bölge sınırları videonun başında eklenmiştir. 3D imar Svenja Falk tarafından Georgia Economides-3D video tarafından. Video adım 2.17 belirtildiği gibi bir nöron imar yazılımı ile kaydedilen ve bir video düzenleme yazılımı ile düzenlenebilir. Video linki:30. Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.

Kullanılan çözümlerKompozisyon/talimatları
Fiksasyon çözüm%4 paraformaldehyde, %0.2 pikrik asit çözüm, % 0,025 oxazolidin çözüm 0.1 M fosfat tampon (PB) doymuş.
0,1 M fosfat tampon pH 7,6900 mL distile su 100 mL 1 M fosfat tampon stok ekleyin
Serum fizyolojik (PBS) pH 7.4/7,5 fosfat tamponlu10 mL 0.1 M fosfat tampon, 0.2 g KCl ve NaCl 8,76 g 990 ml distile su ekleyin
TRIS tampon pH 7.55,72 g Tris hidroklorür ve Tris Bankası 1.66 g 50 mL distile su içinde çözülür. Sonra 1 L distile su ile yapın.
Arabelleğe alınan oxazolidin ve paraformaldehyde sabitleştirici çözüm%4 paraformaldehyde, %0.2 pikrik asit çözüm, % 0,025 oxazolidin çözüm 0.1 M fosfat tampon doymuş.
ABC çözümEn az 30 dk ABC kitinden kullanmadan önce yapılması için çözüm. 1 damla çözüm A ve B çözeltinin 1 damla PBS için 2.5 mL ekleyin.
Durcupan epoksi reçine:20 tencere yapmak: Bileşen A, bileşen B 20 g, bileşenin C 0.6 g ve bileşenin D - 0.4 g 20 g
Denge dökülen bir çemberi filtre kağıdı ile plaka kapsayan tarafından korumak. Dikkatle reaktifleri yukarıda belirtilen oranlarda tripour kabı içine tartın. Şiddetle iki ahşap sopa için en az 5 dk kullanarak karıştırarak tarafından iyice karıştırın. Karışımı bir üniforma yoğunluğu koyu kahverengi renk olacaktır. Kabı ~ 50 ° C en fazla mümkün olduğunca çok sayıda hava kabarcıkları kaldırmak için 10 dk fırında yerleştirin. Not: Reçine Eğer 10 dk. Decant uzun fırın kabı reçine plastik kap veya 5 mL şırınga dışarıda bırakın onları tarih ve kullanıma hazır-20 ° C buzlukta saklamak tedavi etmeye başlayacak.

Tablo 1: Tablo çözümleri. 

Tartışma

Elektrofizyolojik kayıtlar vitro (Şekil 1 Ac,d ve M.ö., d) ile histochemical birlikte ve immunohistokimyasal yordamları etkinleştirmek detaylı morfoloji, kalsiyum bağlayıcı protein içeriği ve Yetişkin kortikal interneurons kimliğini ortaya olarak kaydedildi. CA2 bölgesinde bu tekniği ilk kez yerel devre çalışma izin ve daha önce CA1 veya CA3 tarif edilmiştir değil interneurons alt sınıflarını ortaya: geniş dendritik ve aksonal arbor sepet hücreleri (Şekil 1B), bistratified hücreleri ve SP-SR interneurons.

Burada açıklanan protokol nöronlar ultrastructure korumak ve dendritik (dahil dikenleri) ve aksonal arbors mükemmel kurtarma edinmek için optimize edilmiştir. Kritik adımları içerir kontrast ışık mikroskobu26 geliştirmek için çift fiksasyon tekniği kullanımı ve antikor penetrasyon geliştirmek ve nöronal korumak için sabitleştirici çözüm oxazolidin ve pikrik asit çözüm eklenmesi ultrastructure27. Osmication ve reçine katıştırma z-uçak büzülme28azaltmak iken nazik donma-çözülme permeabilization ince yapısının daha iyi koruma sağlar. Buna ek olarak, (örneğin aksonlar küçük boutons ile para cezası) çok güzel yapıların görselleştirme H2O2 ve arka plan boyama azaltmak için NaBH4 bölümlerle kuluçka tarafından geliştirildi. Kontrast Ayrıca NiCl2 ' ye HRP tepki ilavesi ile artırılabilir.

Burada verilen histolojik yordam tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik açısından mükemmel sonuçlar sunar. Ancak, elektrofizyolojik kayıt süresi daha kısa kayıtları genellikle yoksul aksonal boyama ile ilişkili ile boyama biocytin/floresan kalitesini belirleyecektir. Protokoller (bütün hücreli yama sıkma vs keskin elektrotları kullanarak hücre içi kayıtları) kayıt seçimi de biocytin saklama ve koruma iyi anatomi etkileyebilir.

Güçlükler içinde iken burada açıklanan histolojik işleme ve 100 X büyütme (axon karmaşıklığına bağlı olarak 1-4weeks), yeniden oluşturmak için geçen süre sırasında güzel yapısını koruyarak takdir edilmektedir, bu yöntem verir bir dendritik ve aksonal çapları doğru bir şekilde temsil. Daha az biocytin etiketleme ortaya çıkarmak için yüksek güç gerektiren protokolleri kullanımı anlaşılabilir bir durumdur, ancak, bunlar genellikle iyi aksonal şube açık görselleştirme engel. Deterjanlar biocytin ve antikorlar, ortaya çıkarmak için Avidin-HRP girişini teşvik etmek, genellikle kalın bölümlerde gerekli, ama güzel yapısını bozabilir. Nörologlar arama sürekli için yeniden yapılanma yarı otomatik yöntemleri ama için şimdi ve akson özellikle, biocytin-HRP el ile yeniden yapılanma ile için altın standart31kalır.

Son derece ayrıntılı nöronal rekonstrüksiyonu, aksonlar boutons ve düğümlerin olup tam aksonal arbor, çizim doğru akson çapı temsili ile değiştirir boyunca miyelin ve daha genel olarak özellikle doğru çizimlerinin onun uzunluğu, daha fazla bilgi doğru teşhis edilmesi için kullanılan farklı türde bir interneurone sağlamak. Birçok interneurons belirli bir sınıf tam olarak uygun olmayabilir rağmen yukarıda açıklanan tekniği nöronal elektrofizyolojik özellikleri, belirli bir bağlantı türü ile ilişkili ve ayrıntılı kısa vadeli plastisite ilişkili veri sağlar nöronal rekonstrüksiyonu, ayrıntılı olarak incelenecektir için bağlantı şeması CA2 bölgesinde izin.

İyi, ayrıntılı yapısı kez Hesaplamalı modellerinde basitleştirilmiştir. Anlaşılabilir olsa da, bu gelecekte kritik olabilecek bilgi kaybına neden olur. Ayrıntılı 3D rekonstrüksiyonu ile paralel sinaptik veri analizini interneuronal sınıflandırma için daha fazla ölçüt eklenmesi sağlayacaktır. Veri içinde kamu depoları yatırılır ve akson çapı ve myelination Aksiyon potansiyeli yaymayı sporadik değişiklikler sonucu hesaplama açısından keşfetmek için tüccarları tarafından kullanılan.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu araştırma Novartis Pharma (Basel) ve tıbbi araştırma Konseyi Prof Alex Thomson, biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC-BB/G008639/1), fizyolojik Derneği, Avrupa Birliği için fon aldı Ufuk 2020 çerçeve programı araştırma ve yenilik (insan beyni proje SGA1) belirli Hibe Sözleşmesi No 720270 altında ve belirli Hibe Sözleşmesi No 785907 altında (insan beyni proje SGA2). Fon güvenliğini sağlama diğer kortikal bölgelerde Protokolü ayarlamak için ve onun sürekli destek için bu proje için Prof Alex Thomson için çok müteşekkiriz. Laboratuvar-kurtarma protokolüne optimize yardımcı oldu ve CA2 neurones yeniden üye tarafından yapılan katkıları minnettarlıkla kabul vardır: J. Deuchars, H. Pawelzik, ö. I. Hughes, A. s. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Avidin-7-amino-4-metilkumarin-3-asetik asit (Avidin-AMCA) antikoru- 20.8 mg/mL Vektör laboratuvarlarıA2008
Biyositin ve nbsp; ≥ % 98 (TLC)SigmaB4261
3,5 diaminobenzidin (DAB) tablet, 5 mLhazırlamak için SigmaD4293
Durcupan epoksi reçine ASigma44611
Durcupan epoksi reçine BSigma44612
Durcupan epoksi reçine CSigma44613
Durcupan epoksi reçine DSigma44614
Etanol, saf. pa, mutlak, ≥ % 99.8Sigma32221
JelatinSigma48723
Glutaraldehit çözeltisi, derece I, H 2< / sub>OSigmaG5882
Gliserol, vb. içinde% 25; %99 SigmaG5516
Keçi serumuSigmaG9023
Keçi anti-fare floresein izotiyosiyanat (FITC) - 14.3 mg / mLSigmaF2653
Keçi anti-tavşan Texas Red (TR) - 3.3 mg / mLInvitrogenT2767
Hidrojen peroksit,% 30 çözeltiSigmaH-1009
Daldırma yağı, viskozite 1.250 cSt (lit.)SigmaI0890
Nikel klorür (NiCl2< / sub> . 6H2< / sub>O)Sigma N5756
Osmiyum tetroksit, elektron mikroskobu için, H2O  içinde %4;Sigma75632
Paraformaldehit, reaktif sınıfı, kristalimsi SigmaP6148
Su ile nemlendirilmiş pikrik asit, ≥ %98Sigma197378
Fosfat tamponu 1 MSigmaP3619
Propilen oksit (C3H6O), %99Alfa Aesar 30765
Sodyum tetrahidroboratVWR27885.134
SükrozFisher scientificS/8600/53
Trizma Hidroklorür, ≥ %99,0SigmaT5941
Trizma tabanı, & ge; % 99,9SigmaT6066
Vectashield Antifade Montaj Ortamı, kırılma indisi 1.45 Vektör laboratuvarlarıH-1000
Vectastain Elite ABC HRP kitiVektör laboratuvarlarıPK6100
Kullanılan ekipmanlar 
VibratomeAgar Scientific
C4A Çukurlu alüminyum plakalar GA-MA & İŞTİRAKLER, Inc.
Leica DMR mikroskobu Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q  floresan ışık kaynağı Excelitas Teknolojileri 
Leica DFC450 dijital mikroskop kamerası Leica Mikro Sistemler& nbsp;
Rapidograph teknik çizim kalemi 0.18mm Londra grafik merkezi
0.18 mm rapidograf ucuLondra grafik merkezi
Rapidograph teknik çizim kalemi 0.25mm Londra grafik merkezi
0,25 mm rapidograf ucuLondra grafik merkezi
XYZ sahne kontrolü için PC iş istasyonu, sahne, kamera ve joystic içeren Neurolucida sistemiMicrobrighfield (MBF) Bioscience
Neurolucida yazılım sürümü 2017Microbrighfield (MBF) Bioscience
CorelDRAW graphics Suite X5Corel
Video düzenleme yazılımı Adobe Premiere Pro
Cam şişeler 14 mLFisher scientific 

Kaynaklar

  1. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Bezaire, M. J., Soltesz, I. Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus. 23, 751-785 (2013).
  4. Katona, L., et al. Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus. Hippocampus. 27, 359-377 (2017).
  5. Ali, A. B., Thomson, A. M. Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus. Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).
  6. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  7. Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat. Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).
  8. Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus. European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).
  9. Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus. Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).
  10. Thomson, A. M., Lamy, C. Functional maps of neocortical local circuitry. Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).
  11. Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
  12. Wilent, W. B., Nitz, D. A. Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons. Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).
  13. Hirsch, J. A., Martinez, L. M. Laminar processing in the visual cortical column. Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).
  14. Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep. Nature. 531, 185-190 (2016).
  15. Yu, J. Y., et al. Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility. eLife. 6, e27621(2017).
  16. Markram, H., et al. Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry. Cell. 163, 456-492 (2015).
  17. Van Geit, W., et al. BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience. Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).
  18. Gal, E., et al. Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry. Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).
  19. Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro. Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).
  20. Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).
  21. West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).
  22. Bannister, A. P., Thomson, A. M. Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex. Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).
  23. Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).
  24. Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).
  25. Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).
  26. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).
  27. Somogyi, P., Takagi, H. A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry. Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).
  28. Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).
  29. Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104(2014).
  30. Mercer, A., Thomson, A. M. Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers? Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83(2017).
  31. Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B Rekonstr ksiyonntern ron MorfolojisiElektrofizyolojik Kay tVibratom Kesit AlmaAvidin HRP ReaksiyonuOzmiyum Tetroksit BoyamaKalsiyum Ba lay c ProteinFloresan G r nt leme
Biocytin kurtarma ve dolgulu hipokampal CA2 Interneurons 3D rekonstrüksiyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.