3D dinamik kültür sistemi ile bir çok katmanlı mezenkimal kök hücre levha inşaatı

Summary

Bu makale uygun kök hücre özelliği ile çok katmanlı kök hücre tabloları oluşturmak için verimli ve uygun bir yöntem sağlar.

Abstract

Kök hücre tedavisi bir umut verici yaralanan organ ve doku Yenileyici gelecekteki gösterir ve hücre sayfası teknik düşük hücre saklama ve hedef bölge içinde yoksul hayatta kalma artırmak için geliştirilmiştir. Ancak, vitro İnşaat sürecinde acilen kök hücre bioactivity bakımı ve hücre sayfası içinde hücre miktarı artan bir çözüm gerekir. Burada, bu protokole uygun kök hücre bioactivity ve en uygun kullanım ile bir çok katmanlı hücre sayfası oluşturmak için bir yöntem sunuyor. Decellularized domuz kalp zarını (DPP)₂ (PLA₂) decellularization yöntemi olarak hücre sayfası iskele fosfolifaz tarafından hazırlanan ve sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücre (BMSCs) izole ve numaralı seribaşı hücreler olarak genişletilmiş. Geçici çok katmanlı hücre sayfa yapısı RAD16 kullanarak inşa edilmiştir-Ben peptid hidrojel. Son olarak, hücre sayfası üç boyutlu (3D) yapısı stabilize etmek dinamik perfüzyon sistemi ile kültürlü ve 48 saat kültür vitrotakip hücre sayfası alınamadı. Bu iletişim kuralı bir çok katmanlı kök hücre sayfası oluşturmak için verimli ve uygun bir yöntem sağlar ve hücre sayfası bir olumlu kök hücre terapisi ürün olarak gelecekte geliştirilebilir.

Introduction

Kök hücre tedavisi birçok hastalık için etkili bir tedavi olarak bildirilmiştir; Ancak, düşük hücre saklama ve hedef bölge içinde yoksul hayatta kalma kritik konularda geleneksel kök hücre enjeksiyon takip kalır. Bu sorunu çözmek için doku mühendisliği bilim adamları hücre sayfası tekniği geliştirdi. Monolayered hücre sabıkası olduğu gibi hücre dışı matriks ile öncelikle sıcaklık-yanıt kültür çanak¹kullanılarak hazırlanan ve kök hücre saklama ve hayatta kalma hazır içinde önemli gelişmeler takip çalışmalarına bildirdi alan^2,3. Yöntemler arasında çok katmanlı hücre sayfası oluşturmak hücre hayatta kalma ve hücre sayfası tedavi etkisi^3,4geliştirmek için etkili bir strateji olarak bildirilmiştir. O zamandan beri bilim adamları hücre miktarı, kök hücre özellik ve mekanik özelliği hücre yaprak artırmak için farklı hücre sayfası inşaat yöntemler geliştirilmesi üzerinde çalıştı. Şimdiye kadar hücre sayfasının belirli türleri inşa ve miyokard infarktüsü⁵, kıkırdak hasarı⁶, tedavisinde okudu ve⁷cilt yara.

Bioactivity kök hücre nakli önce yaralı doku rejenerasyonu ortaya çıkan bir etkisi gösterdi ve farklı hücre sayfası inşaat stratejileri kök hücreler üzerinde farklı etkileri vardır. Bir yandan konfluent hücre sayfaları yalnızca yüksek yoğunluklu kök hücrelerinin oluşuyordu ve doğal hücre dışı matrisler yığın monolayered hücre sayfaları⁸ veya manyetik doku mühendisliği teknikleri⁹kullanarak elde edilebilir. Öte yandan, geliştirilen araştırmacılar yeterli mekanik mukavemeti sağlamak ve düşük bir kök hücre yoğunluk beslenme sağlamak için tohum verilen hücre büyüme^10,11,12, destek için farklı iskele kaynağı. Ancak, bu yaklaşımlardan rağmen düşük verimli beslenme kaynağı çok katmanlı hücre sayfa yapısı içinde önemli bir endişe vitro inşaat sırasında kalır. Bu nedenle, bir verimli ve uygun hücre sayfası yapı sistemi şiddetle ihtiyaç var.

Bu iletişim kuralı bir multilayeredmesenchymal kök hücre (MSC) hücre sayfası hazırlamak için adımları açıklar. Bu yapı sistemi, hücre sayfası mekanik mukavemeti DPP tarafından sağlanır. Bu iskele üzerinde bağlı olarak, 3D hücre yapısı hızlı bir şekilde RAD16 ile inşa edilebilir-ben peptid hidrojel ve dinamik perfüzyon sistemi 3D hücre sayfa yapısı stabilize ve yeterli beslenme sağlamak için çok katmanlı hücre levha, kültür için kullanılır hücreleri için kaynağı. Bu sistemi kullanarak, bir çok katmanlı BMSC sayfa başarılı bir şekilde hazırlanan ve sıçan miyokard infarktüsü modeli¹³üzerinde en uygun tedavi edici etkisi sergilenmektedir.

Protocol

Tüm kök hücre ve hayvan deney yordamlar bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının Ulusal Kılavuzu etik kurallarına göre yürütülen ve Jinan Üniversitesi hayvan bakım ve kullanım Komitesi (Guangzhou, Çin Halk Cumhuriyeti) tarafından onaylanmış.

1. hazırlanması PLA₂ Decellularization ile DPP iskele yöntemi¹⁴

Not: PLA₂ decellularization yönteminin şematik için Şekil 1A ' ya bakınız.

1. 100 mL 200 U/mL PLA₂ çözeltisi hazırlamak. 0.5 g sodyum deoxycholate ve PLA₂ 2 mL 198 mL karbonat tampon çözeltisi ekleyin. Bu çözüm onun hazırlık sonra 24 saat içinde kullanılmalıdır.
2. Taze domuz kalp zarını (FPP) mezbaha elde etmek ve Laboratuvar 1 saat içinde geri dönün.
   Not: FPP taşıma sırasında 4 ° C'de muhafaza edilmelidir. Adımları 1.2-1,10 sürekli bir termostat kontrollü su banyosunda sallayarak ile yapılmalıdır.
3. Bu adım 2 x 200 mL % 1 penisilin-streptomisin 10 ° Cfor 10 dk., bir 500 mL ölçek içeren fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile FPP tekrar iyice yıkayın.
4. FPP iki katmanlara bölmek ve yağ dokusu forseps ve makas ile kaldırın.
   Not: PBS 50 mL ekleyerek ıslak FPP yağ dokusu kaldırma sırasında her 20 dk devam et.
5. FPP 10 x 10 cm² adet makasla şekil. FPP %200 1 penisilin-streptomisin bir 500 mL ölçek 10 ° C'de 10 dk. yinelemek için bu adım 2 x içeren mL karbonat tampon çözeltisi (CBS) ile yıkayın.
6. Saf su için FPP aktarmak ve 12 h için 10 ° C'de ıslatın.
7. 10 x 10 cm² örnekleri 50 ml 200 U/mL PLA₂ ve 6 h için 37 ° C'de % 0,5 (w/v) sodyum deoxycholate çözüm içeren CBS emmek.
8. Örnekleri bu adım 2 x %1 penisilin-streptomisin için 10 dk. tekrar 10 ° C'de içeren CBS ile yıkayın.
9. CBS 200 U/mL PLA₂ ve 2 h 37 ° C'de % 0,5 (w/v) sodyum deoxycholate çözüm içeren 50 ml her örnek emmek.
10. Örnekleri % 1 penisilin-streptomisin 2 h. tekrarlamak için 10 ° C'de içeren CBS ile 10 x için bu adım en azından yıka. Örnekleri üzerinde düz tabak yerleştirin ve kuru onları sabit sıcaklık fırın 55 ° C'de sabit ağırlık
    Not: Örnek tamamen kurumuş gerekiyor. DPP örnek her 10 min tartmak ve tekrar 3 x veya ağırlığı kadar artık değiştirir.
11. Her DPP örnek bir trephine ile 10.5 mm çaplı daire şekli. Her DPP içinde steril mühürlü çantanı hazırla.
12. DPP örnekleri gama ışınlama (25 kGy) tarafından sterilize. DPP örnekler kullanmadan önce 4 ° C'de depolanan.
    Not: Tüm örnekleri 4 ° C'de altı aya kadar saklanabilir

2. hücre hazırlıkları inşaat sac

1. Otoklav siyah üsleri (doku taşıyıcı bileşeni) ve beyaz gerilim halkaları (doku taşıyıcı bileşeni) 30 min 1,5 mL santrifüj tüpleri, forseps, dahil olmak üzere, pens, makas, dişli için tüm aletleri ve doku taşıyıcı bileşenleri 121 ° C'de.
2. 20 mL döl-özgür % 10 sükroz çözeltisi hazırlamak. Sukroz 2 g ağırlık ve Ultrasaf Su 18 ml sukroz geçiyoruz. Otoklav 30 dk veya 0,22 µm filtre ile filtre çözümü için 121 ° C'de % 10 sükroz çözüm.
3. Otoklav dinamik perfüzyon sistemi aygıtlarını 121 ° C'de 30 dk, bir gaz da dahil olmak üzere Döviz ekipman, 500 mL Cam şişe, bir perfüzyon kültür kapsayıcı ve bağ tüpleri.
4. Autoclaved aletleri ve doku taşıyıcı bileşenleri hazırlayın. Siyah taban parçası doku taşıyıcı bir kültür tabak koyun.
5. Kurutulmuş bir DPP iskele toplar ve siyah Bankası Merkezi'nde koyardım. Bir beyaz gerginlik yüzük DPP iskele üzerinde koymak ve doku taşıyıcıya düzeltebilirim.
   Not: iskele doku taşıyıcıya tamamen sabit ve siyah taban ve beyaz gerginlik halka arasında boşluk yok olun. Eğer değilse, doku taşıyıcı ayrı ve iskele tekrar düzeltmek.
6. Rehidrasyon DPP iskele üzerinde 100 µL kültür ortamının ekleyin.
   Not: iskele de doku taşıyıcıya düzeltilmemişse, kültür orta kültür çanak sızmak.
7. İskele 37 ° C kuluçka koy ve 15dk için emmek sağlar.

3. hücre sayfa yapımı için hücreleri hazırlanması

Not: Bu 100 mm tabak hücre kültürü için protokolüdür. Şekil 1B inşaat çok katmanlı hücre yapısının şematik için bkz.

1. BMSCs¹³yalıtmak.
   Not: Bu yöntem bir çok katmanlı MSC cep sayfası oluşturmak için tasarlanmıştır. Sıçan BMSCs bu protokol için kullanılır. BMSCs bütün kemik iliği yapisan yöntemle izole edilmiştir ve BMSCs genişletilmiş vitro hücre yeteri kadar elde etmek için vardır.
   1. Otoklav 121 ° C'de aletleri forseps, dişli forseps ve makas gibi 30 dk için. 2 mL enjeksiyon şırınga ve BMSC Kültür (değiştirilmiş Dulbecco'nın kartal orta [DMEM], % 10 fetal Sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin) orta hazırlayın.
   2. 3-hafta-yaşlı erkek Sprague-Dawley (SD) rats servikal omur çıkığı tarafından ötenazi. 100 mL % 75 alkol çözeltisi 5 min için bir ölçek içinde hayvan emmek.
   3. Hayvan kabı dışına alıp eğilimli işlemi masaya yerleştirin. Arkadaki hayvan cilt makas ve forseps ile deşmek. Kalça kemiklerine ortaya çıkarmak için cilt ve kas dokuları yalıtmak.
   4. Kalça kemiklerine yalıtmak ve PBS 30 mL 50 mL santrifüj tüpü içinde koydu. İki kalça kemiklerine bir tüpün içine yerleştirin. Girdap santrifüj tüpü doku iyice yıkayın. 2 x bu adımı yineleyin.
   5. Her iki ucunda da kemiklerine makasla kesmek ve iliği kavite bulaşmasına neden.
   6. BMSC kültür orta 2 mL enjeksiyon şırınga ile Aspire edin. İğne iliği boşluğa yerleştirmek ve kültür orta ile kemik iliği dışarı floş. Her iki kalça kemiklerine bir 100 mm Kültür çanak içine dışarı floş.
   7. Her 100 mm Kültür yemeğin için kültür orta 2 mL kültür tabakta ekleyin. 37 ° C kuluçka ve 72 h için statik kültür kültür tabak koyun.
   8. Kültür bulaşık kuluçka makinesi üzerinden dışarı çıkar. Süpernatant ile 6 mL taze kültür orta yerine.
   9. Mikroskop altında birincil BMSCs gözlemlemek. Bunu, her 5-7 d BMSCs geçiş.
2. Kuluçka makinesi hücreleri al. Hücreler mikroskopla gözlemlemek ve hücre sayfa yapımı için uygun hücreleri seçin. BMSCs % 80 - % 90 izdiham ulaştığınızda, hücreleri numaralı seribaşı hücreler olarak seçilebilir.
3. Kültür orta kültür çanak kaldırın. Yavaşça 2 mL sıcak PBS hücrelerle yıkayın. Tüm PBS kültür çanak kaldırmak ve yapmak emin Hayır sıvı kalır. Yemek için 2 mL % 0.25 tripsin (veya başka bir dissociating çözüm) ekleyin ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
4. Tripsin etkisi kültür orta 2 mL ekleyerek durdurmak ve yavaşça çanak hücrelerden yıkayın. Hücre süspansiyon yeni 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Centrifugate hücreleri 225 x g 5 min için de.
5. Süpernatant kaldırın. 3 mL % 10 (w/v) sükroz çözeltisi içeren hücreleri resuspend.
   Not: % 10 (w/v) sükroz çözüm hücreleri yıkamak için aşağıdaki adımlarda bir tek tip hücre-hidrojel karışım elde etmek için kullanılır.
6. Hücre süspansiyon 10 µL Aspire edin ve hücre ile bir hemasitometre saymak. Bir sonraki adım için gerekli hacim hesaplamak. Bir hücre tablo için üç milyon BMSCs kullanılır.
7. Üç milyon hücreleri ayıklamak ve bir yeni 15 mL santrifüj tüpüne aktarabilirsiniz. Senaryo Özeti 225 x g 5 min için santrifüj kapasitesi.
8. Süpernatant kaldırın. 1 mL % 10 (w/v) sükroz çözeltisi içeren hücreleri resuspend. Hücre süspansiyon bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
   Not: 1,5 mL santrifüj tüpü kullanarak hücre hidrojel karışım hazırlamak için faydalıdır.
9. 5 dk. tamamen süpernatant kaldırmak ve hücre tortu elde etmek için 260 xg de hücreleri santrifüj kapasitesi.

4. BMSCs ve RAD16 hazırlanması-ben peptid hidrojel karışımı

Not: Şekil 1B inşaat çok katmanlı hücre yapısının şematik için bkz.

1. 20 µL % 10 (w/v) sükroz çözüm 1.5 mL santrifüj tüpü ekleyin. Yavaşça BMSCs resuspend ve bir tek tip süspansiyon elde edilir.
   Not: herhangi bir kabarcıklar resuspension sırasında oluşturmaz.
2. RAD16 20 µL eklemek-Ben peptid hidrojel süspansiyon üstündeki. Hafifçe karıştırın RAD16-ben peptid ve hücre süspansiyon pipet ucu. Yavaşça hücre süspansiyon ve hidrojel birlikte karıştığında, karışımı bir kaç kez pipette.
3. Doku gemisinden DPP iskele al ve yavaşça kültür orta bir pipet ucu ile Aspire edin.
   Not: DPP iskele tam olarak hücre hidrojel karışımı eklemeden önce rehydrated olun.
4. Karışım Aspire edin ve eşit DPP iskele ekleyin.
   Not: Karışım hacmi hakkında olurdu 40-50 µL. Bu karışımı 10 µL teker teker ortadan itibaren iskele dışa doğru eklemek için tavsiye edilir.
5. 1 mL kültür ortamının doku taşıyıcı altýna ekleyin. 37 ° C kuluçka 5 min için hücre levha koymak.
6. Kuluçka makinesi hücre sayfasından çıkar. Yavaşça kültür orta 4 mL kültür çanak ekleyin ve hücre sayfası bırakın. Statik kültür 2 h 37 ° C kuluçka hücre levha koymak.

5. bir dinamik kültür sistemi kullanarak 3D çok katmanlı hücre sayfasının Vitro kültür

Not: Şekil 1 c 3D dinamik sistem bir şematik için bkz.

1. Peristaltik pompa, gaz Satım donanımları, 500 mL Cam şişe, perfüzyon kültür konteyner ve bağ tüpler de dahil olmak üzere dinamik perfüzyon sistemi hazırlamak. Şekil 2' de gösterildii gibi dinamik perfüzyon sistemi monte.
2. Kültür orta 200 mL steril cam şişe ekleyin. Hücre kültür konteyner odanın içine yerleştirin.
   Not: üst yüzey hücre sayfasının yönüne dikkat edin.
3. Kültür orta 3 mL doku kapsayıcı içinde ekleyin ve konteyner kapatın. Dinamik perfüzyon sistemi da kuluçka makinesine koy ve pompa başlar. Peristaltik pompa debisi kültür 8 mL/dak. 48 h için dinamik perfüzyon sistemi hücre sayfasında ayarlayın.

6. çok katmanlı MSC cep sayfası alma

1. Otoklav doku taşıyıcı bileşenleri için 30 min 1,5 mL santrifüj tüpleri, forseps ve dişli forseps dahil olmak üzere, 121 ° C'de ve aletler.
2. Giriş kanalı konteyner kültür ortamına temini durdurmak için cam şişe dışarı çıkarmak.
   Not: kültür konteyner boş olduğunda peristaltik pompa durdurun.
3. Kültür konteyner hücre sayfasından çıkar ve bir kültür tabak koyun.
4. Bir forseps doku taşıyıcı hareketsiz başka bir dişli forseps beyaz gerginlik yüzüğü siyah tabanından ayırmak için kullanırsınız. Son olarak, çok katmanlı BMSCs hücre sayfası elde etmek.
5. Kısa koruma için her hücre sayfa 1.5 mL santrifüj tüpü forseps ile transfer edilebilir. DPP iskele santrifüj tüpü iç duvarına bitişik ve hücre levha yayıldı out santrifüj tüpü mümkün olduğu kadar.
6. Yavaşça kültür orta 1 mL hücre sayfası sokmak için santrifüj tüpü ekleyin. Santrifüj tüpü kapağı kapatın ve hücre sayfa 4 ° C'de depolayın
   Not: Hücre sayfası nakledilen veya en kısa zamanda analiz gerekir. Bu 4 h hücre sayfasında kullanmak için tavsiye edilir.

Results

Çok katmanlı kök hücre sayfası inşaat şematik resim 1' de gösterilen. Hücre sayfası iskele PLA₂ decellularization yöntemi tarafından hazırlanması için ilk adımdır. İskele üzerinde bağlı olarak, geçici 3D hücre yapısı kök hücre RAD16-1 peptid hidrojel ile karışımı ile inşa edilmiştir. Uygun kök hücre bioactivity ve en iyi mekanik gücü ile bir çok katmanlı hücre sayfası elde etmek için hücre sayfası dinamik perfüzyon sisteminde kültürlü. Dinamik besl...

Discussion

Mevcut iletişim kuralı çok katmanlı bir MSC sayfası oluşturmak için verimli bir yöntem bildirir. Bu hücre sayfasını en iyi mekanik güç, yüksek hücre tohumlama yoğunluğu ve olumlu kök hücre bioactivity sergiler. BMSCs örnek olarak kullanarak, 3D hücre yapısı hızlı bir şekilde RAD16 ile inşa edilmiştir-Ben peptid hidrojel. Dinamik perfüzyon sistemi kültürlü sonra çok katmanlı BMSC sayfası başarıyla alındı ve kök hücre işaretlerinin yüksek bir ifade BMSCs korumak.

Geçici çok katmanlı hücre yapısı...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fosfolipaz A2	Sigma-Aldrich	P6534
Sodyum deoksikolat	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Fosfat tamponu	Gibco BRL	89033
Penisilin streptomisin / amfoterisin ve nbsp;	Gibco BRL	15640055
Tampon bikarbonat	Sigma-Aldrich	C3041
Masa yoğunlaştırıcı	Changzhou Aohua Instrument Co.
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-014-CVR
Güney Amerika fetal sığır serumu	Gibco BRL	10270-106 / P30-3302
L-Glutamin	Corning Cellgro	25-005-CI
0.25 Tripsin / 2.21 mM EDTA	Corning Cellgro	25-053-CI
Biyogüvenlik kabini	Esco, Singapur	AC2-2S1
Sabit sıcaklık inkübatörü ve nbsp;	Esco, Singapur	CLS-170B-8
Santrifüj tüpü ve nbsp;	Corning	430790
EP tüp	Axygen	31617934
Santrifüj makinesi	TOMOS	1-16R
Sükroz	Sigma-Aldrich	S9378-500G
Pura Matrisi	BD	354250
Dinamik perfüzyon kültür sistemi	Minucells ve Minutissue	D-93077
Peristaltik pompa	Ismatec	IPC N8
Pompa hortumu	Ismatec	Nr.1306
MINUSHEET 1300	Regensburg		doku taşıyıcı bileşenleri
MINUSHEET	Regensburg		dinamik perfüzyon sistemi
MINUSHEET 0006	Regensburg		gaz değişim ekipmanları
MINUSHEET 0002	Regensburg		500 mL cam şişe
MINUSHEET 1301			perfüzyon kültür kabı