Method Article

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

DOI:

10.3791/58634

⸱

October 25th, 2018

 ,  ,  , 
1Physics Department, Technical University of Munich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lithographically yapısal yüzeylerde genlerin immobilizasyon compartmentalized gen çalışmanın bir açık mikrosıvısal biyoreaktör sisteminde ifade işlemleri sağlar. Yapay hücresel sistemleri diğer yaklaşımlar aksine, gen ifade reaktifler ve atık ürünlerin eşzamanlı boşaltma ile sürekli bir tedarik için böyle bir kurulum sağlar. Bu boş hücre gen ifade işlemleri uygulama uzun bir süre dinamik gen düzenleyici görüş sistemleri gerçekleşmesi için önemli olan, üzerinde kolaylaştırır. Burada sadece ticari olarak mevcut bileşenleri kullanan DNA strand yer değiştirme reaksiyonları üzerinde dayalı bir basit-e doğru-kullanma tekniğinde tekniği kullanarak genetik biochips imalatı için detaylı bir protokol sağlar. Biz aynı zamanda bir polydimethylsiloxane (PDMS) bölümlere genler entegrasyonu üzerinde bir protokol sağlar-tabanlı mikrosıvısal sistemi. Ayrıca, sistem doğrudan gözlem DNA ve ifade karışımda bulunan moleküller arasındaki moleküler etkileşim için kullanılan toplam iç yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi ile uyumlu olduğunu göstereceğiz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre-alerjik reaksiyonlar Biyokimya, biyoteknoloji ve sentetik biyoloji çeşitli uygulamalar için yoğun ilgi vardır gen ekspresyonu. Boş hücre ifade proteinlerin çok sayıda çalışma için temel yapısal biyoloji dersinde olduğunu saf protein örnekleri hazırlanması için vesile oldu. Örneğin, boş hücre sistemleri hücre tabanlı ifade kullanarak üretmek zor olan protein kompleksleri1 veya membran proteinleri2, ifade için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Özellikle, hücre ücretsiz-gen ekspresyonu reaksiyonlar da 19613çığır açan deneylerde Nirenberg ve Matthaei ile başlayan genetik kod yapısını aydınlatmak için kullanıldı.

Son zamanlarda, boş hücre Yöntemler Biyoteknoloji ve sentetik biyoloji4,5,6yenilenmiş bir ilgi olmuştur. Boş hücre sistemleri biyolojik olmayan bileşikler ile artar ve bileşenleri çeşitli biyolojik kökenli daha kolay7birleştirilebilir. Boş hücre sistemleri onlar "büyümek ve bölmek" yapmak değil bariz dezavantajı olsa bile, bu temel metabolik fonksiyonları ile açık boş hücre Biyoreaktörler hazırlamak ve onlara sağlanan basit karbon ve enerji ile metabolitleri sentezlemek için akla yatkın girişleri8. Sentetik biyoloji gelişmekte olan alanı içinde boş hücre sistemleri bir daha öngörülebilir "kasa" uygulanması için sentetik biyolojik fonksiyonların olacağıma söz veriyorum.

Şu anda, boş hücre gen ifade tepkiler are ikisinden biri istimal dışarı araba hücre ayıklar (farklı kaynaklardan gelen bakteri, Maya, böcekler gibi), veya (Örneğin, farklı uygulamalar için en iyi duruma getirilmiş transkripsiyon/çeviri sistemleri prokaryotik ve Ökaryotik gen ekspresyonu, üretim zar proteinleri, vb). Yaygın bir iletişim kuralı (yaygın olarak adlandırdığı TXTL) bakteri hücre özü hazırlanması için son zamanlarda V. Noireaux ve iş arkadaşlarınızla9tarafından sağlandı. Biyofiziksel özellikleri iyice karakterize10edilmiş ve TXTL sistem zaten başarılı bir şekilde karmaşık biyokimyasal görevleri bir dizi yapmak için kullanılmıştır: Örneğin, fonksiyonel bacteriophages yolu ile Meclisi Feyc genom11, bakteriyel protein filamentler12sentezi veya boş hücre gen devreleri13,14uygulamaları ifade boş hücre.

Başka bir sistem içinde boş hücre sentetik biyoloji popüler saf bileşenleri15,16' dan yeniden saf sistemidir. TXTL sisteme göre enzimler veya protein yıkımı makine içermez. Doğrusal DNA bozulması, RNA molekülleri proteinler mi bir sorun daha az saf sisteminde, çürüme yolları aslında dinamik işlevleri uygulanması için önemlidir. TXTL sistemi (RecBCD) aracılığıyla doğrusal gen şablonları eksonükleaz bozulma etkisini azaltmak için eklenecek son koruma GamS protein vardır. TXTL ve saf sistemi ticari olarak kullanılabilir.

Bir tema yakından boş hücre biyolojisi kaygıları bölünebilme biyokimyasal reaksiyonlar üzerinde etkisi ve daha fazla yapay hücre benzeri yapıları veya protocells17,18,19 oluşturma çalışma ilgili. ,20. Araştırma yapay hücrelerde genellikle veziküler bölmeleri fosfolipitler veya diğer amphiphiles yapılmış içinde bir biyokimyasal reaksiyon sistemi encapsulation içerir. Bu tür sistemlere bölünebilme temel yönlerini veya cellularity ve kendi kendini kopyalayan yapıları keşfetmek için yardımcı olsa da, onlar kapalı sistemler tipik sorunlarla karşı karşıya: yokluğunda işleyen bir metabolizma ve uygun membran taşıma mekanizmaları, bu bölümlere tepkiler uzun bir süre için çalışan tutmak zordur - yakıt molekülleri kullanılır ve atıklar birikir.

Bölünebilme böyle hücre taklit eden bölmeleri içinde için ilginç bir alternatif genetik materyal photolithographic yöntemlerle uzamsal kuruluştur. İmmobilizasyon "genlerin bir yonga üzerinde" on yıldan fazla öncülük Weizmann Enstitüsü Bar-Ziv grubu tarafından21. Çözülmesi gereken önemli konular arasında belirsiz adsorpsiyon DNA ve proteinler çip yüzeyinde potansiyel denatürasyon idi. Bar-Ziv vd immobilizasyon silikon dioksit yüzeylerde resist moleküllerin emin uzun Polietilen glikol (PEG) ayırıcı için reaktif bir terminal silane oluşan "Daisy" olarak adlandırdığı bir adanmış fotolitografi resist geliştirilen biyouyumluluk ve ışınlama ultraviyole (UV) ışık ile üzerine bir reaktif Amin içine dönüştürülmüş bir photocleavable headgroup. Daisy bir çip yüzeyinde (ile birkaç kilo baz-çifti (kbp) uzunlukları) gen-uzunluk DNA molekülleri hareketsiz için kullanılabilir gösterilmiştir. Bir polimer fizik açısından bakıldığında, bir katı substrat aşılı polimer fırçalar sistemleri temsil. DNA Polielektrolit yapısı nedeniyle bu fırçaların uyum kuvvetle ozmotik ve diğer iyon özel efektleri22,23tarafından etkilenir.

En önemlisi, substrat immobilize genleri hala işlevsel ve kopya etmek ve içine çevrilmiş RNA ve protein olabilir gösterilmiştir. Gene fırçalar için RNA polimeraz çözüm24erişilebilir ve transkripsiyon/çeviri karmaşık makromoleküllerin karışımı yüzeyde denatüre değil. Onlar sürekli olarak küçük habercisi moleküller ile ve hangi atık ürünlerin kaldırılan25 olabilir üzerinden sağlanan bir açık mikrosıvısal reaktör sisteminde çalıştırılabilir immobilizasyon bir yüzey üzerinde genetik bileşenlerinin avantajlarından biri olduğunu , 26.

Biz son zamanlarda sadece ticari olarak mevcut bileşenleri dayanıyordu ve fingerprinting DNA strand işgaline tepkiler için kullanılan Bephore (için biyouyumlu elektron ışını ve fotorezist)27, olarak adlandırılan bu yöntem bir türevi geliştirilmiştir yapay hücre çip tabanlı oluşturulması için bir basit uygulamak multistep litografi yordam gerçekleştirilmesi. Yordamı şematik bir bakış Şekil 1' de gösterilen. Biyouyumlu PEG katman üzerinde immobilize photocleavable grubu içeren DNA saç tokası molekülleri dayanır. Photocleavage saç tokası, hangi DNA yoluyla bağlı yolu ile çıkıntı aracılı strand işgali molekülleri ("yerinden" DIS sıra içeren) ilgi olabilir bir tek iplikçikli çıkıntı dizisi sunar.

Bephore uygulamak potansiyel olarak daha basit olmakla birlikte, Daisy çok yoğun ve temiz gerçekleştirilmesinin sağlar "gen fırçalar", hangi belirli uygulamalarda avantajları vardır. Prensip olarak, ancak, Daisy ve Bephore litografi kolayca birlikte. DNA iplikçik deplasman DNA yapılanma için altın fırçalar kullanan bir ilgili litografi yöntemi daha önce Huang vdtarafından geliştirilmiş, ancak boş hücre gen ifade28,29bağlamında kullanılmıştır değil.

Aşağıdaki protokolünde DNA üretim ayrıntılı bir açıklaması için Bephore yöntemini kullanarak boş hücre gen ekspresyonu fırçaları sağlar. Biz nasıl gen cips cihazlarında ve genlerin bir yonga üzerinde dağınık şekilde yapılandırılmış immobilizasyon için çok adımlı fotoğraf-litografi kullanımını göstermek açıklanmaktadır. Biz de tepki odaları imalatı ve havacilik üstünde-küçük parça gen ifade reaksiyonlar performansı için uygulama tartışıyorlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Bir zaman planı farklı bölümlerde yer alan adımlar için tamamlayıcı bilgiler (Bölüm 1) verilir.

1. küçük parça imalat

Not: gibi yüzeylerde, kullanım silikon gofret (100 mm çap, 0.525 mm kalınlığında) ile 50 nm kalın bir tabaka silikon dioksit veya cam slaytlar (24 mm x 24 mm, No 1.5; 22 mm x 50 mm, No 4). Uygulamaya bağlı olarak, diğer boyutları ve kalınlıkları daha uygun olabilir.

  1. Yüzeylerde üzerinden bir RCA temizlik temizlik yordamı (su, amonyak çözüm NH3(aq) % 30 ve hidrojen peroksit H2O%2 30, 5:1 oranında: 1)
    1. Bir ölçek kabı cam su ve amonyak çözüm mix ve karışımı karıştırma sırasında sıcak tabakta 70 ° c ısı.
    2. Hidrojen peroksit ve substrat ekleyin. Daha yüksek performans için birden çok yüzeylerde (özellikle küçük cam slayt) bir politetrafloroetilin (PTFE) sahibi yerleştirin.
    3. 30 dk sonra belgili tanımlık substrate almak, bir yıkama şişe su ile iyice durulayın ve azot silahla kuru. Hemen substrat PEGylation ile devam edin.
      Dikkat: cilt ve göz koruma giymek ve duman mahallede çalışma. Atık konteyner karışımından gaz yayımı için izin vermek için sıkı bir şekilde kapatmayın.
  2. Yüzey PEGylation
    Not: Tekrarlanan dondurma ve çözme Biotin-PEG-Silane stokunun yoğunlaşma Hava nem nedeniyle silane reaktivite azaltır. Bu nedenle, uygun miktarda Biotin-PEG-Silane 5 mL tüpler hazırlamak (Örneğin 10-20 mg) ve onları kullanım kadar dondurma önce kuru argon ile doldurun.
    1. Biotin-PEG-Silane vortexing (5 mg/mL) tarafından kuru Toluen geçiyoruz.
    2. Cam petri kabına (120 cm çapında, 2 cm yükseklik) içinde belgili tanımlık substrate duman mahallede yerleştirin.
    3. Tüm yüzeyini örten substrat üzerine (≈200 µL bir tek cam kapak notu için bir büyük silikon gofret için bir kaç mL) çözüm pipette ama belgili tanımlık substrate kenarına akan çözüm kaçının.
    4. Petri kabına kapatın. Belgili tanımlık substrate kurutma azaltmak için ek bir kapak ıslak kağıt havlu ile ekleyin.
    5. İzopropil alkol, yaklaşık 40 ml 30 dk sonra ekleyin o zaman belgili tanımlık substrate almak, tekrar iyice izopropil alkol ile durulayın ve azot silahla kuru (pegile yan cam slaytlar için unutmayın). Belgili tanımlık substrate kullanmak kadar karanlıkta saklamak.
      Dikkat: cilt ve göz koruma giymek ve duman mahallede çalışma.

2. immobilizasyon için genleri hazırlanması

Not: Astar dizileri, DNA modifikasyonlar ve örnek bir PCR Protokolü tamamlayıcı bilgiler (Bölüm 2-4) verilir.

  1. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) tarafından ilgi gen yükseltmek için değiştirilmiş astar kullanın. Bir astar floresans mikroskobu içinde görüntüleme için bir fluorophore taşır ve diğer astar DIS serisinden DIS sıra tek iplikçikli PCR boyunca tutmak için triethylene glikol ayırıcı tarafından ayrılır.
  2. Bir spin sütun arıtma kit kullanarak DNA arındırmak ve onun konsantrasyonu bir emme foto ölçüler kullanarak ölçün. Konsantrasyon-meli değil var olmak 100'den çok daha düşük nM.
  3. 1 konsantre 5 M NaCl çözüm kullanarak m NaCl konsantrasyonu ayarlayın. Yüksek tuz konsantrasyonu DNA fırça montaj işlemi22kolaylaştırır.

3. fotolitografi

Not: Photocleavable DNA (PC) sadece sarı ışık ortamında ele alınmalıdır. Sarı folyo üniteleri için geleneksel beyaz ışık lamba ışığında filtre uygulamak için kullanılabilir.

  1. Belgili tanımlık substrate hazırlanması
    1. Bephore-mix (1 µM streptavidin, 1,5 µM PC DNA, 7.5 µM PH DNA ' 1 x PBS (fosfat tamponlu tuz)) hazırlamak ve pasivasyon (10 µM DIS DNA, 1 mg/mL BSA (Sığır serum albümin), 1 x PBS etiketsiz) karıştırın. Her ikisi de karanlıkta buzdolabında birkaç hafta boyunca saklanabilir.
    2. Substrat bir cam kesici kullanarak veya bir neşter ile bir kenar üzerine basarak bir silikon gofret bir kristal çizgi boyunca kırma (bir kaç cm2) daha küçük parçalar halinde kes. Bir basit hizalama işareti merkezine cam kesici kullanarak substrat kenarına doğru kısa bir çizik oluşturun. Darbe küçük parçacıklar çip azot silah ile kapalı.
    3. İki bileşenli silikon yapıştırıcı, Örneğin bir pipet ucu ile karıştırarak iki damlacıkları mix ve tutkal çip, (Şekil 2A) tırmalamak ucuna etrafındaki alanı boş bırakarak yüzey için geçerlidir. Tutkal hidrofobik bir bariyer çamaşır adımları kolaylaştırır ve incubations için gerekli DNA miktarını azaltır sağlar. Daha sonraki bir adımda tutkal kolayca soyulmuş.
    4. 10 µL kuluçkaya (veya gerektiği kadar çip kapsayacak şekilde) çip (RT) Oda sıcaklığında Bephore karışımı. Kuluçka sırasında fişi bir kutusunda, Örneğin bir pipet ucu kutusu kısmen buharlaşma azaltmak için su.
    5. 1 h, yıkadıktan sonra çipi birkaç kez (5 x 50 µL ile) kaldırmak için 1 x PBS ile pipetting tarafından Bephore-mix ilişkisiz.
    6. Çip kurutma olmadan mümkün olduğu kadar tampon al ve 10 µL pasivasyon-Mix RT. adlı yonga üzerinde kuluçkaya
    7. 2 h sonra birkaç kez (10 x 50 µL ile) 1 x PBS ile ilişkisiz pasivasyon aracıları kaldırmak için pipetting tarafından çip yıkayın.
  2. Projeksiyon litografi
    Not: 60 x su daldırma amaç dik bir mikroskopla litografi için kullanılabilir. Aydınlatma kez bağlıdır amaç, ışık kaynağı, maske, yüzey yoğunluğu substrat (silikon çip ya da cam slayt) ve istenen DNA. 60 x amacı ile tipik pozlama süreleri değişmektedir aşağıdaki bölgeleri çakışan iki aşamalı litografi bir dakika (15 s için silikon çipler, 45 s cam slaytlar için) 2-3 dk tam bir pozlama için. UV ışığı engeller bu yana üstünde tepe-in belgili tanımlık substrate (hariç erimiş kuvars) bir kapak fişi kullanmayın.
    1. Yazdırılan bir photomask kesmek (örnek litografi maskeleri ve takıma giren bölüm 5 ile ek dosyasına bakın) uygun maske tutucu sığması için uygun bir boyut için hangi eklenebilir alan stop (Şekil 2B) konumunda. Kesin çok adımlı litografi için maskeyi kutusunda hizalama işaretleriyle hizalayın.
    2. Yüzey mikroskopisi slaytta yer ve mikroskop sahne alanı'na taşıyın. İçin desenlendirme Bephore cam slaytların siyah folyo (Örneğin yedek folyo baskılı photomasks gelen) arasında mikroskobu slayt ve litografi için karanlık bir arka plan sağlamak için Bephore slayt ekleyin.
    3. Aydınlatma yol, odak substrat yüzeyine kırmızı filtre takın ve Örneğin çizik ucundaki bölge maruz kalacağı, substrat bölgesine gidin.
    4. Maske tutucu Ekle, aydınlatma engellemek ve UV filtresi (Şekil 2C) değiştirin. Düşük ışık şiddeti, çekim açın ve hızlı bir şekilde maske belgili tanımlık substrate üzerinde odaklanmak için kamerayı kullanın.
    5. Kameranın ışık yolunu engellemek ve yüksek ışık yoğunluğu, substrat istenen pozlama süresi için aydınlatmak.
    6. Örnek--dan mikroskop ve dikkatlice kadar arabellek mümkün olduğunca--dan belgili tanımlık substrate kurutma olmadan sökün.
    7. 10-20 µL dis-sıra ile DNA'ın ekleyin. Yüzey kurumasını tutmak için bir ıslak kutuya koyun. 2 h (oligonucleotides adlı bir micromolar konsantrasyon) veya birkaç saat/gece (yaklaşık 100 nM konsantrasyon kbp-uzun DNA) RT., substrat DNA kuluçkaya
    8. DNA küçük parça--dan kaldırmak ve 1 x PBS ile birkaç kez yıkayın. DNA kaybı (özellikle için daha uzun parçaları) azaltmak için belgili tanımlık substrate alınan DNA depolamak ve onu yeniden kullanabilir.
  3. Çok adımlı litografi
    Not: tek bir alanda iki veya daha fazla pozlama için tam hizalama için açısal kayma önlemek için sahne alanı'nda örnek tutmak. Kadar çip kuru değil emin olun. Bir yüzey üzerinde farklı bölgelerde birkaç DNA fırçanın konumlandırma için bir motorlu sahne alanı'na götürmek için belirlenmiş alanda veya bir substrat uygun hizalama işareti kullanın.
    1. İlk maruz kaldıktan sonra (Bölüm 3.2), substrat DNA dis-sıra ile kuluçkaya. Tüm bağlayıcı siteleri ilk maruz kalma sonucunda işgal önemlidir. Bu nedenle, oligonucleotides (10 µM) yaklaşık 3 h, RT için kuluçkaya
    2. Dis etiketli genler hareketsiz için onları birkaç saat için yüzey üzerinde yer veya RT bir gecede o zaman örnek yıkayın ve pasivasyon karıştırmak için başka bir 2 h RT. devam et sonraki pozlama ile ekleyin.
    3. Ek pozlama için önceki adımları tekrarlayın (3.2.3 - 3.3.2).

4. PDMS aygıtları

Not: Tercihen, temiz oda içinde çalışırlar. McDonald et al. tarafından açıklandığı gibi standart bir protokol PDMS cihaz imalatı izler 30

  1. Ana kalıp üzerinden fotolitografi imalatı
    1. Bir silikon gofret (76.2 mm çap, 525 µm kalınlık) sonication aseton yüksek güçte 5 min için temizleyin ve izopropil alkol ve de-iyonize su ile durulayın. Daha sonra gofret 15dk için 150 ° C'de sıcak bir tabak yerleştirin.
    2. İsteğe bağlı olarak, resist gofret için yapışma geliştirmek için 2-3 mL yapışma organizatörü ekleyin ve 3000 devir / dakikada 120 ° c 2 min için gofret için 30 s. ısı spin.
    3. 2-3 mL fotorezist hakkında eklemek ( Tablo malzemelerigörmek). 15 gofret spin s 500 rpm, daha sonra 30 için 3000 rpm'de s. Bu 20 µm kalın bir tabaka fotorezist içinde sonuçlanmalıdır. Oda sıcaklığında 10 dakika dinlenmek fotorezist katman izin.
    4. Öncesi pozlama fırında sıcak bir tabak 50 ° c için 2 dk sonra 85 ° c 5 min için gofret yerleştirin.
    5. Gofret bölmeleri planı ile photomask altında yerleştirin. Tercihen, maske aligner kullanın. Photomask 64.000 dpi çözünürlüğe sahip olmalıdır (litografi maskeleri ve takıma giren bölüm 5 ile ek dosyasına bakın).
    6. Gofret photomask UV-ışık (ben-line 5-10 mW/cm2) ile 1 min için maruz.
    7. Sonrası pozlama fırında 50 ° C 2 min için ve daha sonra 85 ° C 5 min için gofret yerleştirin. Sakin olun ve oda sıcaklığında 1 h için dinlenmek gofret ver.
    8. Gofret geliştirici 3 dakika ile bir yemek kabı hafifçe Tantanacı süre yerleştirin. Gofret izopropil alkol ile durulayın ve azot silahla kuru. Gofret için 45 dk 130 ° c sıcak bir tabak yerleştirin.
  2. PDMS aygıt hazırlanması
    1. Mix PDMS Bankası ve Ajan 10:1 oranı ve gofret tabaka yaklaşık 5 mm kadar kapalı bir kapta üzerine gofret oluşturmuştur pour kür PDMS. Sadece 1 mm kalınlık PDMS cihazın elde etmek için bunun yerine kat PDMS ile gofret için 2 dk 100 RPM spin.
    2. Bir desiccator kap yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika için bir vakum (yaklaşık 85 kPa) uygulayın. Sonra yaklaşık 70 ° c 1-2 h bir fırın için PDMS ısı.
    3. PDMS aygıt gofret ayırın. Her parça bir bölmeleri içerir PDMS döşeme kesti. PDMS mikrosıvısal kurulum için bağlı olmanız durumunda, (1 mm çap) olarak bir giriş ve çıkış kaynağı kanal ucunda delikler.
    4. De-iyonize su ve izopropil alkol PDMS temiz ve azot silahla kuru. PDMS tozsuz saklayın.

5. bölümlere gen ekspresyonu

Not: Aşağıdaki yordam bir örnek tutucu (Şekil 3) Meclisi compartmentalized gen ekspresyonu gözlem için bir ters mikroskobunun ile sıcaklık kontrolü için bir kafes kuluçka açıklar. Sahibi hazır malzeme ve araçları (3.5-5 mm kalınlığında Polivinil klorür (PVC) plastikler, vida ve somunlar, matkap) kullanılarak oluşturulan ve mikroskoplar farklı türde uyacak şekilde özelleştirilebilir. Öyle ki her iki kesiminde sahibi aynı zamanda hazır mısın 5.1 ve 5.2 açıklanan adımları gerçekleştirilmesi gerekiyor.

  1. Alt tutucu derleme
    1. Bephore çip hizalama işareti (Örneğin bir çizik bile) ile hazırlamak ve çift taraflı yapışkan bant (Şekil 3B) kullanarak çip tutucu yapıştırın. Çip yeter de artar PDMS cihaz büyük olması gerekir.
    2. Bir veya birden çok gen yonga üzerinde hareketsiz (bkz. Bölüm 2 ve 3).
    3. Alt tutucu orta deliğin etrafında vakum bazı yağ ekleyin, sonra chip sahibi takın.
      Not: Chip sahibi şimdi alt sahibine yağ aracılığıyla x-y-uçak yongasında yeniden konumlandırma için olasılığını koruyarak bağlı kalır.
  2. Top tutucu derleme
    1. Adım 4.2.1 spin kaplama yordamı kullanarak bölmeleri ile ince bir PDMS çip hazırlamak. PDMS olabildiğince az atık ve habercisi moleküller karşılığında difüzyon tarafından izin vermek bir yana bir kanal açık bırakarak kesti.
    2. Temiz bir cam kapak notu (24 mm x 24 mm, No 1.5) ve oksijen plazma 42 için PDMS çip (yan bölmeleri olmadan) arka s (200 W ve Faraday kafesi örnekte ile 0.8 mbar işletilen).
    3. PDMS çip cam slayt merkezinde yukarı işaret bölmeleri ile yerleştirin. 70 ° C'de 1 h için PDMS ile cam fırında
    4. Top tutucu büyük deliğin etrafında vakum bazı yağ ekleyin.
    5. Deneme başlamadan önce temiz cam slayt ve PDMS 42 için oksijen plazma ile chip s PDMS hidrofilik işlemek için.
    6. Cam kaymak ile PDMS top tutucu ( Şekil 3 c) üzerine yerleştirin ve cam yağ (Şekil 3 c) üzerine hafifçe bastırın.
  3. Tutucu derleme
    1. Bir boş hücre ifade sisteminin 100 µL hazırlamak ve buz üzerinde tutun.
    2. Dikkatle tampon bellek küçük parça--dan kaldırmak ve bir kez ifade boş hücre sistemi 10 µL ile yıkayın. Sonra 60 µL ifade boş hücre sistemi çip üzerine ekleyin ve iki bileşenli silikon yapıştırıcı (zaten Şekil 3B') çipi kenarlarını kaldırın.
    3. 20 µL üzerine PDMS ifade sisteminin ekleyin. Damlacık PDMS üzerine koyduktan sonra hızlı bir şekilde bölmeleri de ıslak stereoskopik mikroskop ve hava kabarcıkları olmadan kontrol edin. Hava kabarcıkları ise boş hücre ifade sistemin geri kalanı ile yıkayın çalışın.
    4. İki birleştirmek için sahibinin ve odalar ve DNA fırçalar hizalamak, stereoskopik mikroskop altında çalışmak ve tutma kolu, alt sahibi çok hareketsiz sabitleyen iki vidayı adet ve wingnuts her iki el ile kolayca erişilebilir (şekil 3D-F ).
    5. Top tutucu alt yuvasına takın ve boş hücre ifade sistem damlacıkları (3D şekil) sigorta dek indirin. Stereoskopik mikroskop bölmeleri ve hizalama işareti x-y-uçak benzer bir bölgede olup olmadığını kontrol edin, aksi takdirde cam slayt üzerinde üst tutucu üst tutucu ve yeniden pozisyon yukarı çekin.
    6. Tutucu alt tarafında dokundukları kadar aşağıdan wingnuts canı cehenneme. Dikkatle wingnuts, bölmeleri ve x-y-uçak üzerinden kolu alt kısmındaki küçük parça tutucu (Şekil 3E) yongasında hizalama sıkın. Bir kez temas halinde wingnuts sadece çok nazikçe sıkın (Şekil 3F).
      Not: Bu adım biraz tecrübe gerektirir ve deneysel kurulum üzerinde bağlıdır. Mikroskop altında PDMS ile cam arasında sıvıdan kaynaklanan girişim uygulanan kuvvet çok küçük, çok yüksek bir bölme ipuçları ortasına bir alt floresan yoğunluğu (DNA fırça veya ifade proteinler) alınan süre olduğunu gösteriyor basınç (Ayrıca bkz: tamamlayıcı bilgiler, Bölüm 6).
    7. Sünger Anti-buharlaşma kasa içine su ile sprey ve tutucu kutusuna ekleme. 5 mL şırınga iki bileşenli silikon yapıştırıcı ile doldurun ve kutusu (Şekil 3 g) imzalamak için kullanabilirsiniz.
    8. Belgili tanımlık kutu için ısı kontrollü mikroskop aktarmak ve DNA fırça ve floresan mikroskopi tepki görüntü. Aydınlatma bile, bir boş hücre ifade sisteminde floresans DNA fırça kaybolur. Yine de, fırça, etkinlik, aynı fırça ifadeden tekrarlanan Gen tarafından gösterildiği gibi korur.
      Not: bir Bephore cam slayt yerine silikon çip kullanırken, PDMS ve Bephore çip (ilk/son) konumunu, objektif ile daha küçük çalışma mesafeler kullanımı için izin değiştirilebilir.

6. sürekli ifade mikrosıvısal cihazlarda

Not: Deneysel kur üzerinden Şekil 4Agösterilen parçalarý monte edilir. Isı kontrollü sahne montajı hakkında ayrıntılı bilgi tamamlayıcı bilgiler (Bölüm 7) verilir.

  1. İfade boş hücre sistemi ve boru
    1. Bir örnek tüp (yaklaşık 200 µL) ifade boş hücre sistemi hazırlamak. Polistren boncuk ile floresan boyalar etiketli bir tedarik kanal üzerinden akış hızı daha sonra izlemek için eklenebilir.
    2. Tüp bir basınç denetleyicisine bağlanma. Yaklaşık 12 saat boyunca soğuk tutar bir büyük buz rezervuar tüpü yerleştirin. Buz gerekirse tekrar doldur.
      Not: akış direnci değişiklikler, Örneğin ile uzun vadeli yardımcı olabilir hava kabarcıkları nedeniyle deneyler bile bir basınç denetleyicisi için alternatif olarak, bir şırınga pompa ifade boş hücre sistemi sürekli akış oranını sağlar.
    3. PTFE ifade boş hücre sisteme içeren tüp bağlamak boru (0.8 mm iç çap), ısıtmalı sahne alanı'na ulaşır. Bir şırınga iğnesi (çapı 0.9 mm) 1-2 cm adet künt uçları ile sızmak ve tek parça PTFE boru içine yerleştirin. Daha sonra bağlantı ucuna PDMS olarak görev yapacak. Sahne ve Tüp (Şekil 4 c) arasındaki boru uzunluğu en aza indirmek deneyin.
    4. PTFE boru soğutmak için bir buz su deposu ve peristaltik pompa ile bağlantılı olan büyük kauçuk tüp etrafında sarın. Onları Scotch tape (Şekil 4 c) ile birlikte teyp.
  2. Top tutucu derleme
    1. Oksijen Plazma PDMS Chip'le düz tarafı temiz (42 s) ve giriş ve çıkış PDMS (Şekil 4B) montaj delikleri ile mikroskobu slayt üzerinde yerleştirin. Cam delikler kafa delme bir cam ile önceden delinmiş. Mikro-Odalar cam slayt dönük olmadığından emin olun.
    2. Çift taraflı yapışkan bant PDMS tutucu düz kenarına uygulayın. Arka plan floresans yapışkan bandı üzerinden önlemek için sahibinin iki delik arasındaki bölgede siyah folyo (Örneğin bir litografi maskesi gelen) bir parçası sopa.
    3. PDMS çip ile cam slayt sahibi için sopa.
    4. Tedavi PDMS ve ekli cam ile PDMS sahibi slayt ile bir plazma oksijen plazma temizleyici (42 s).
    5. Top tutucu büyük deliğin etrafında vakum gres uygulayın ve PDMS tutucu (Şekil 4B) ekleyin. PDMS sahibi şimdi x-y yönde yeniden konumlandırma için olasılığını koruyarak en iyi sahibine bağlı kalır.
    6. PTFE boru PDMS yonganın giriş şırınga iğne konektöre bağlayın. Top tutucu aracılığıyla PDMS erişimini kolaylaştırmak için üst plastik tabak kısaca bu ve aşağıdaki adımı için kaldırılabilir.
    7. PTFE (yaklaşık 5 cm) (Şekil 4 d) çıkış, bir şırınga iğne konektörlü boru ikinci bir parça yerleştirin.
    8. Her yöne taşımak ücretsiz şekilde PDMS tutucu top tutucuya yerleştirin. Yer ısıtmalı sahneye gevşek top tutucu gibi Şekil 4E içinde herhangi bir wingnuts sıkma olmadan.
    9. Mikroskop ile PDMS bölmeleri konumuna gidin ve onları kameranın görüş alanı içinde merkezi. Sahne bu noktadan hareket değil.
    10. Top tutucu PDMS ile sahne alanı'ndan kaldırın.
  3. Isıtmalı sahne ve Bephore cam slayt
    1. 37 ° C'ye ısıtılmış sahne sıcaklık ayarlayın
    2. Bephore cam slayt (No 4) çift taraflı yapışkan bant, mikroskop'ın görüş alanı merkezinde yaklaşık hizalama işareti kullanarak ters floresan mikroskop ısı kontrollü aşaması için gen fırçalarla tutkal. Bu hizalama işareti konumlandırma bölmeleri kabaca aynı bölgeye indirdi sağlar.
    3. Gen fırça karşılık gelen floresans kanalda fotoðraf ve kamera görüntü konumunu işaretleyin.
    4. Arabellek gen fırça kaldırmak, ancak kuru gitmesine izin vermeyin. Hücre - özgür ifade sisteminin 20 µL gen fırçaya ekleyin ve silikon yapıştırıcı çerçeveyi kaldırmak için cımbız kullanın.
  4. Derleme mikrosıvısal kurulum
    1. İfade boş hücre sistemi PTFE boru doldurdu ve PDMS cihazın alt kısmında görüntüleninceye kadar basınç örnek tüp ekleyin. Ayrıca, mikro-Odalar PDMS tarih üzerine ifade boş hücre sisteminin 10 µL pipet. Bölmeler hava kabarcıkları ücretsiz olduğundan emin olun.
    2. Dikkatli bir şekilde cam slayt üzerine üst tutucu alt ve mikro-Odalar gen fırça ile hizalayın. PDMS ve hizalama işareti aynı odak düzlemi ulaşmadan x y konumunu ve yönünü gen fırça (Şekil 4E) PDMS cihazla tam olarak hizalamak için PDMS tutucu arkasında küçük vidaları kullanın.
    3. Konumda tutun ve cam slayt üzerine PDMS wingnuts boyunca top tutucu mikroskop sahne alanı'na (Şekil 4E) bağlantı vidaları sıkılaştırılması tarafından tuşuna basın.
    4. İfade boş hücre sistemi ve monitör kaynağı kanalından (akış oranları arasında saat 0.5-5 µl önerilir) Floresan boncuk akışını içeren tüp (Şekil 4F) basıncı artırmak. Gerekirse, camına PDMS baskısı wingnuts sıkma tarafından artırmak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki adım litografi: Şekil 5 desen fluorescently etiketli DIS iplikçiklerinin çakışan bir cam slayt üzerinde tekniğinde bir işlemdir sonucunu gösterir.

Bir gen fırça floresan bir protein ifadesi: Şekil 6 immobilize DNA'dan floresan protein YPet ifade gösterir. Biz kısmen floresan protein ağartma ve kurtarma floresans sinyalinin gözlemleyerek gen ifade hızı değerlendirild...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bephore litografi DNA veya RNA desenli immobilizasyon için güçlü ve çok yönlü bir tekniktir. Henüz, yordam olan - çevirdiyseniz - başarısızlık için bir kaynak bulabilirsiniz birkaç adım içerir veya sistemin performansı düşer.

Bephore cips imalatı bir çok önemli biyouyumluluk yüzey sağlar substrat PEGylation adımdır. Ayrıca sonraki silanization için yüzey aktive beri burada, bir RCA yordamı ile temizlik adım önemlidir. Gerçek PEGylation sırasında belgili tanımlık substrate kurumasına gerekir. A...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volkswagen Vakfı (grant no. 89 883) ve Avrupa Araştırma Konseyi (Hibe Sözleşmesi No 694410 - AEDNA) tarafından bu proje için finansal destek minnetle anıyoruz. YÜKSEK LİSANS-S. Destek DFG GRK 2062 aracılığıyla tarafından kabul eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
50 nm silikon dioksit içeren silikon gofret (Befor substratı)Siegert GofretKalınlığı (&mikro; m): 525 ± 25, Çap (mm): 100
Silikon gofret (PDMS ana kalıp için)Siegert GofretKalınlığı (&mikro; m): 525 ± 25, Çap (mm): 76,2 (3")
Cam slaytlar no. 4 Menzel22 mm x 50 mm
Cam slaytlar no. 1.5Yardımcı24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-SilaneLaysan BioMW 5.000
Susuz toluenSigma Aldrich (Merck)244511
StreptavidinThermo-Fisher ScientificS888
DNAEntegre DNA Teknolojileri ( IDT)
Phusion HF Tamponlu Yüksek Kaliteli PCR Master KarışımıNew England BiolabsM0531S,PCR kiti
Sihirbaz, SV, Jel ve PCR Temizleme Sistemi PromegaA9281Spin-kolon PCR temizleme kiti
PURExpressNew England BiolabsE6800SHücresiz ekspresyon sistemi
PDMS Dow CorningSlygard 184
FluoSpheresThermo-Fisher ScientificF8771
PTFE boru (ID: 0,8 mm, OD: 1,6 mm)BolaS 1810-10
EpoCore 20mikro direnç teknolojisi  Photoresist
mr-Dev 600mikro rezistans teknolojisi  Photoresist geliştiricisi
Ti-PrimeMicroChemicalsYapışma arttırıcı
İki bileşenli silikon yapıştırıcıPicodentTwinsil 
UV korumalı sarı folyoLithoprotect (MicroChemicals aracılığıyla)Y520E212
Equipment
Fotolitografi maskeleriZitzmann GmbH64.000 dpi, 180x240 mm
Dik mikroskopOlympusBX51Fotolitografi ve floresan görüntüleme
60x suya daldırma objektifiOlympusLumPlanFl, NA 0.9
20x suya daldırma objektifiOlympusLumPlanFlOlympus BX51, NA 0.5
KameraFotometriCoolsnap HQOlympus BX51 ile kullanılır
Işık kaynağıEXFOX-Cite 120QOlympus BX51
ile kullanılır Ters mikroskopNikonTi2-EFloresan Gen ekspresyonunun görüntülenmesi
4x objektifNikonCFI P-Apo 4x LambdaNikon Ti2-E
Kameraile kullanılır AndorNeo5.5kullanılır Nikon Ti2-E
ile kullanılır Işık kaynağıLümenSOLA SM IINikon Ti2-E
Kafes kuluçka makinesiOkolabcesur çizgiNikon Ti2-E
Basınç Kontrol Cihazıile kullanılır ElveflowOB1 MK3
NanoPhotometerImplenDNA konsantrasyon ölçümü
Plazma temizleyiciDienerFemto200 W, numune bir Faraday kafesindeyken 0,8 mbar'da çalıştırılır
, , , GmbH GmbH BX51 ile kullanılan Olympus ile kullanılır ile kullanılır ile ile kullanılır

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
  2. Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
  3. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
  4. Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
  5. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
  6. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  7. Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
  8. Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113(2014).
  9. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  10. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104(2011).
  11. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
  12. Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
  13. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
  14. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771(2015).
  15. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  16. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
  17. Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
  18. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  19. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
  20. van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583(2018).
  21. Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
  22. Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
  23. Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
  24. Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
  25. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
  26. Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
  27. Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
  28. Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
  29. Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
  30. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Strand DisplacementBephore LithographyGene ImmobilizationMicrofluidic IntegrationTIRF MicroscopyPDMS CompartmentsFluorescence MicroscopySubstrate PEGylationPhotocleavable DNASelf re Expression System

Related Articles