Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Lithographically yapısal yüzeylerde genlerin immobilizasyon compartmentalized gen çalışmanın bir açık mikrosıvısal biyoreaktör sisteminde ifade işlemleri sağlar. Yapay hücresel sistemleri diğer yaklaşımlar aksine, gen ifade reaktifler ve atık ürünlerin eşzamanlı boşaltma ile sürekli bir tedarik için böyle bir kurulum sağlar. Bu boş hücre gen ifade işlemleri uygulama uzun bir süre dinamik gen düzenleyici görüş sistemleri gerçekleşmesi için önemli olan, üzerinde kolaylaştırır. Burada sadece ticari olarak mevcut bileşenleri kullanan DNA strand yer değiştirme reaksiyonları üzerinde dayalı bir basit-e doğru-kullanma tekniğinde tekniği kullanarak genetik biochips imalatı için detaylı bir protokol sağlar. Biz aynı zamanda bir polydimethylsiloxane (PDMS) bölümlere genler entegrasyonu üzerinde bir protokol sağlar-tabanlı mikrosıvısal sistemi. Ayrıca, sistem doğrudan gözlem DNA ve ifade karışımda bulunan moleküller arasındaki moleküler etkileşim için kullanılan toplam iç yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi ile uyumlu olduğunu göstereceğiz.
Giriş
Hücre-alerjik reaksiyonlar Biyokimya, biyoteknoloji ve sentetik biyoloji çeşitli uygulamalar için yoğun ilgi vardır gen ekspresyonu. Boş hücre ifade proteinlerin çok sayıda çalışma için temel yapısal biyoloji dersinde olduğunu saf protein örnekleri hazırlanması için vesile oldu. Örneğin, boş hücre sistemleri hücre tabanlı ifade kullanarak üretmek zor olan protein kompleksleri1 veya membran proteinleri2, ifade için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Özellikle, hücre ücretsiz-gen ekspresyonu reaksiyonlar da 19613çığır açan deneylerde Nirenberg ve Matthaei ile başlayan genetik kod yapısını aydınlat....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Bir zaman planı farklı bölümlerde yer alan adımlar için tamamlayıcı bilgiler (Bölüm 1) verilir.
1. küçük parça imalat
Not: gibi yüzeylerde, kullanım silikon gofret (100 mm çap, 0.525 mm kalınlığında) ile 50 nm kalın bir tabaka silikon dioksit veya cam slaytlar (24 mm x 24 mm, No 1.5; 22 mm x 50 mm, No 4). Uygulamaya bağlı olarak, diğer boyutları ve kalınlıkları daha uygun olabilir.
- Yüzeylerde üzerinden bir RCA temizlik temizlik yordamı (su, amonyak çözüm NH3(aq) % 30 ve hidrojen peroksit H2O%2 30, 5:1 oranında: 1)
- Bir ölçek kabı cam su ve amonyak çö....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İki adım litografi: Şekil 5 desen fluorescently etiketli DIS iplikçiklerinin çakışan bir cam slayt üzerinde tekniğinde bir işlemdir sonucunu gösterir.
Bir gen fırça floresan bir protein ifadesi: Şekil 6 immobilize DNA'dan floresan protein YPet ifade gösterir. Biz kısmen floresan protein ağartma ve kurtarma floresans sinyalinin gözlemleyerek gen ifade hızı değerlendirild.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bephore litografi DNA veya RNA desenli immobilizasyon için güçlü ve çok yönlü bir tekniktir. Henüz, yordam olan - çevirdiyseniz - başarısızlık için bir kaynak bulabilirsiniz birkaç adım içerir veya sistemin performansı düşer.
Bephore cips imalatı bir çok önemli biyouyumluluk yüzey sağlar substrat PEGylation adımdır. Ayrıca sonraki silanization için yüzey aktive beri burada, bir RCA yordamı ile temizlik adım önemlidir. Gerçek PEGylation sırasında belgili tanımlık substrate kurumasına gerekir. A.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.
Teşekkürler
Volkswagen Vakfı (grant no. 89 883) ve Avrupa Araştırma Konseyi (Hibe Sözleşmesi No 694410 - AEDNA) tarafından bu proje için finansal destek minnetle anıyoruz. YÜKSEK LİSANS-S. Destek DFG GRK 2062 aracılığıyla tarafından kabul eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 50 nm silikon dioksit içeren silikon gofret (Befor substratı) | Siegert Gofret | Kalınlığı (&mikro; m): 525 ± 25, Çap (mm): 100 | |
| Silikon gofret (PDMS ana kalıp için) | Siegert Gofret | Kalınlığı (&mikro; m): 525 ± 25, Çap (mm): 76,2 (3") | |
| Cam slaytlar no. 4 Menzel | 22 mm x 50 mm | ||
| Cam slaytlar no. 1.5 | Yardımcı | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5.000 | |
| Susuz toluen | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Entegre DNA Teknolojileri ( IDT) | ||
| Phusion HF Tamponlu Yüksek Kaliteli PCR Master Karışımı | New England Biolabs | M0531S, | PCR kiti |
| Sihirbaz, SV, Jel ve PCR Temizleme Sistemi | Promega | A9281 | Spin-kolon PCR temizleme kiti |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Hücresiz ekspresyon sistemi |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE boru (ID: 0,8 mm, OD: 1,6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | mikro direnç teknolojisi | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | mikro rezistans teknolojisi | Photoresist geliştiricisi | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Yapışma arttırıcı | |
| İki bileşenli silikon yapıştırıcı | Picodent | Twinsil | |
| UV korumalı sarı folyo | Lithoprotect (MicroChemicals aracılığıyla) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Fotolitografi maskeleri | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180x240 mm | |
| Dik mikroskop | Olympus | BX51 | Fotolitografi ve floresan görüntüleme |
| 60x suya daldırma objektifi | Olympus | LumPlanFl | , NA 0.9 |
| 20x suya daldırma objektifi | Olympus | LumPlanFl | Olympus BX51, NA 0.5 |
| Kamera | Fotometri | Coolsnap HQ | Olympus BX51 ile kullanılır |
| Işık kaynağı | EXFO | X-Cite 120Q | Olympus BX51 |
| ile kullanılır Ters mikroskop | Nikon | Ti2-E | Floresan Gen ekspresyonunun görüntülenmesi |
| 4x objektif | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Nikon Ti2-E |
| Kamera | ile kullanılır Andor | Neo5.5 | kullanılır Nikon Ti2-E |
| ile kullanılır Işık kaynağı | Lümen | SOLA SM II | Nikon Ti2-E |
| Kafes kuluçka makinesi | Okolab | cesur çizgi | Nikon Ti2-E |
| Basınç Kontrol Cihazı | ile kullanılır Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA konsantrasyon ölçümü | |
| Plazma temizleyici | Diener | Femto | 200 W, numune bir Faraday kafesindeyken 0,8 mbar'da çalıştırılır |
Kaynaklar
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
