Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin

10.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58640

⸱

17 Kasım 2018

 , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Bu makalede

Özet

Antijen spesifik T hücreleri ayırdetmek veya tedaviler nedeniyle onların son derece düşük frekanslı kullanmak zordur. Burada, bu hücreler zenginleştirmek için antijen spesifik T hücrelere bağlayabilirsiniz bir manyetik parçacık geliştirmek için bir protokol sağlar ve daha sonra bunları birkaç genişletmek için hundred-fold karakterizasyonu ve tedavisi için.

Özet

Hem zenginleştirmek ve antijen spesifik T hücreleri genişletmek için bir araç geliştirdik. Bu gibi durumlarda yararlı olabilir A) antijen spesifik T hücrelerinin varlığını tespit, B) antijen spesifik yanıt dinamikleri sonda, C) anlamak için nasıl antijen spesifik yanıt-e doğru hastalık durumu otoimmünite gibi etkiler, D) etrafındaki sisi ortadan türdeş olmayan Yanıt için antijen spesifik ya da E T hücreleri) antijen spesifik hücreleri tedavi için kullanmaktadır. Araç üzerinde bir manyetik parçacık antijen spesifik ve T hücre co-stimulatory sinyalleri eşlenik ve yapay antijen sunan hücreler (aAPCs) vadeli temel alır. Teknoloji üretmek basit olduğundan, sonuç olarak, bu kolayca diğer laboratuvarlar tarafından kabul edilebilir; Böylece, Buradaki amacımız imalat ve aAPCs sonraki kullanımını ayrıntılı olarak tarif etmektir. Biz aAPCs için antijen spesifik ve co-stimulatory sinyalleri eklemek, onları antijen spesifik T hücreleri için zenginleştirmek için kullanmak ve antijen spesifik T hücreleri genişletin açıklar. Ayrıca, mühendislik tasarım konuları antijen spesifik T hücreleri karakterize ile deneyimimizin deneysel ve biyolojik bilgileri temel alarak vurgular.

Giriş

Birçok immunotherapies yükselişi ile karakterize ve bağışıklık yanıtı kontrol edebilmek için bir ihtiyaç vardır. Özellikle, adaptif bağışıklık yanıtı özgüllük ve dayanıklılık hücrelerin nedeniyle ilgi biridir. Son zamanlarda, antijen reseptör chimeric T hücre tedavileri kanser tedavisi için onaylanmış olan; Ancak, antijen-reseptörleri kanser1olarak belirli antijenleri yerine ortak hücre yüzey antijeni CD19, kapalı dayanır. Özgüllüğü immunotherapies ayrıca denetim ve sınırlı dinamik bağışıklık yanıtı kanser veya otoimmünite içinde anlama eksikliği muzdarip.

Antijen spesifik yanıt eğitim sorunları biridir onların son derece düşük frekanslı, Örn., antijen spesifik T hücrelerdir 1 her 10 /4 106 T hücreleri2,3. Böylece, hangi T araştırmak için hücreler varsa veya Yanıt, hücreleri ya zenginleştirilmiş genişletilmiş ve olması gereken veya onların sinyal kuvvetlendirilmesine gerekir. Pahalı ve zor antijen spesifik hücreleri genişlemesi üzerine odaklanmış güncel teknikler kullanarak besleyici hücreleri korumak. Antijen spesifik T sinyalinin yükseltecek üzerinde odaklanmak güncel teknikler hücreleri, enzim bağlı immunospot (ELISPOT) tahlil gibi bu T hücreleri4yeniden kullanımı sınırla. Son olarak, düşük duyarlılık nedeniyle sık sık bu iki teknik antijen spesifik numaralandırma için Birleşik olarak gerekir.

Bu sorunlara yönelik olarak manyetik nanoparçacık tabanlı yapay antijen sunan hücre (aAPC)5,6,7,8geliştirdik. AAPC bir antijen spesifik sinyal peptid yüklü MHC kompleksi (pMHC) - ve co-stimulatory moleküller - functionalizedÖrneğin., bir anti-CD28 antikor-antijen spesifik T hücreleri hem de zenginleştirmek ve sonra daha sonra kendi genişleme (Şekil 1) teşvik. Parçacıklar böylece olmak hem antijen spesifik elektrodlar karşılamak için özelleştirilmiş henüz deneyler ve hastalar arasında standart maliyet-etkin bir piyasada ürün olabilir. Performans zenginleştirme ve genişleme süreci yüzlerce binlerce kat genişleme antijen spesifik CD8 + T hücreleri için sonuçlarında ve frekansları neden olabilir kadar sadece bir hafta sonra 60 yüzde karakterizasyonu veya büyük terapötik kullanım etkinleştirme hücre sayısı. Burada, biz nanopartikül aAPCs, nanopartikül özellikleri seçiminde bazı kritik tasarımları yapmak tarif nasıl ve yalıtma ve nadir antijen spesifik CD8 + T hücreleri genişleyen bu parçacıklar kullanan bazı tipik sonuçlar gösterilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bütün fareler Johns Hopkins Üniversitesi'nin kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan yönergeleri başına muhafaza.

1. istenen antijen peptit dizisi ile dimerik Binbaşı MHC kompleksi immünglobulin füzyon Protein (MHC-Ig) yükleyin.

Not: H - 2 Kb kullanıyorsanız: IG, daha sonra takip adım 1. 1 '; ayrıntılı iletişim kuralı H kullanıyorsanız-2Db:Ig, daha sonra takip adım 1.2 ile ayrıntılı iletişim kuralı.

  1. Etkin peptid sırası içine H - 2 Kb yükleme: IG.
    1. Gerekli arabellek hazırlayın. Denatürasyon arabellek 150 mM NaCl ve 15 mM Na2CO3 bir çözüm deiyonize suyla yapma ve 11,5 için pH ayarlama hazırlayın. Renaturation arabellek deiyonize suyla 250 mM Tris HCl çözeltisi yapma ve 6,8 için pH ayarlama hazırlayın.
      Not: Genellikle, bu yaklaşık 5 mL denatürasyon ve renaturation arabellekleri 1 mg, H - 2 Kb gerektirir: IG.
    2. H - 2 Kb denatüre: Gelişmiş peptit bağlantısına izin Ig. H - 2 Kb getirmek: için IG konsantrasyonu arasında 0.5-2 mg/mL fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile. H - 2 Kb seyreltik: 100-200 µg/mL denatürasyon karşılıkları tampon ve 15 min için oda sıcaklığında kuluçkaya için izin 5-10 birim ile son bir konsantrasyon için Ig.
    3. Peptid 50 molar fazlalığı ekleme sırası için H - 2 Kb (genellikle hisse senedi peptid tutulur-80 ° C'de 1 mm): IG çözüm.
      Not: Genellikle peptid antijenleri en az % 10'u içerisinde çözünmüş gerekir dimetil sülfoksit (DMSO) ve sonra yavaş yavaş çözünen kalır PBS'ye ekledi. Amino asit dizisine bağlı olarak DMSO miktarı artmış gerekebilir.
    4. Renature H - 2Kb: IG peptid ile. Peptid, eklenmesi hemen ardından getirmek çözüm pH 7.4 için renaturation arabellek ekleyerek. Etkisiz çözüm 4 ° C'de 48 h için kuluçkaya için izin
    5. Konsantre ve peptid yüklü H - 2 Kb yıkayın: IG. santrifüj yoğunlaştırıcı 50 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO), ile kullanan peptid yüklü H - 2 Kb yıkamak için üreticinin yönergeleri izleyin: IG çözüm 3 kez PBS ile en az 1 mg/mL konsantre. ve bir spektrofotometre konsantre ölçmek.
  2. Etkin peptid sırası H içine yükleme-2Db:Ig.
    1. Gerekli arabellek hazırlayın. Bir çözüm 131 mM sitrik asit, 150 mM NaCl ve 124 mM Na2HPO4 deiyonize suyla yapma ve pH 6.5 ayarlayarak denatürasyon arabellek hazırlayın. Renaturation arabellek 120 mM Tris HCl çözeltisi deiyonize suyla yapma ve 8.8 için pH ayarlama hazırlayın.
      Not: Genellikle, bu yaklaşık 5 mL denatürasyon arabelleği ve renaturation arabellek 1 mL H 1 mg için gerektirir-2Db:Ig.
    2. H denatüre-gelişmiş peptit bağlantısına izin 2Db:Ig. H getirmek-2Db:Ig konsantrasyonu son konsantrasyonu 0.5-2 mg/mL PBS ile. Sonra seyreltik H-100-200 µg/mL 5-10 birim denatürasyon arabellek karşılıkları ile son bir konsantrasyon için 2Db:Ig.
    3. Peptid 50 molar fazlalığı ekleyin (genellikle hisse senedi peptid tutulur-80 ° C'de 1 mm) sıra h-2Db:Ig çözüm ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya için izin
    4. B2 mikroglobulin ekleyip renature H-peptid ile 2Db:Ig. Logosuna 2 kat molar fazlalığı b2 mikroglobulin ekleyin. O halde, çözüm pH 7.4 için renaturation arabellek ekleyerek getiririm. Etkisiz çözüm 4 ° C'de 24 h için kuluçkaya için izin
    5. Konsantre ve peptid yüklü H yıkama-santrifüj yoğunlaştırıcı ile 50 kDa MWCO, kullanan 2Db:Ig. peptid yüklü H - 2 Kb yıkamak için üreticinin yönergeleri izleyin: 3 kez ile PBS, Ig çözüm konsantre en az 1 mg/mL ve ölçmek bir spektrofotometre konsantrasyon.

2. eşlenik MHC-peptid kompleksi ve manyetik nano tanecikleri yüzeyine Co-Stimulatory molekülleri nanopartikül yapay antijen sunan hücreler oluşturmak için. Partikül büyüklüğü ve uygulama bağlı olarak üç farklı yöntemden birini kullanın.

Not: Proteinler parçacıkların yüzeyine çekimlerine bir takım farklı teknikler kullanılabilir. Burada, 3 ayrı yaklaşımlar açıklanmıştır: Amin kaplı parçacıklar (adım 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-kaplamalı parçacıklar (adım 2.2) ve anti-biotin kaplı parçacıklar (adım 2.3). Bu işlemler de iki bildiri yayınlanmış6,7yöntemleri bölümünde ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Biyogüvenlik duman kukuIeta hisse senedi aAPC parçacıklar kısırlık korumak için steril çözümleri ile tüm adımları gerçekleştirin.

  1. Kat antijen spesifik ve uyarıcı sinyalleri manyetik parçacıklar (Şekil 2) Amin kaplı için. Bu işlem için 100 anlatılan nm, Amin kaplı superparamagnetic nano tanecikleri.
    Not: antikor bir amin kaplamalı partikül yüzeyine bağlamak için detaylı iletişim kuralları https://www.micromod.de/en/technotes-2.html nerede nasıl thiolate için antikorlar ve eşlenik maleimide için functionalize teknik notu 201 açıklar bulunabilir parçacıklar ve 202 Amin kaplı parçacıklar maleimide fonksiyonel grubu ile functionalize için gerekli işlemi açıklar. Burada, sadece hafif değişiklikler MHC-IG ve co-stimulatory sinyalleri bu parçacıklar için bağlı için vurgulanır.
    1. Thiolate antikorlar ile Traut'ın reaktif (teknik notu 201).
      1. 10 x PBS-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) arabellek (0.1 M PBS ve 100 mM EDTA) hazırlayın. PBS-EDTA arabellek x 10 1:10 at karşı antikorlar için eklemek oranı ücretsiz thiols karşı antikorlar için eklendi oksidasyonunu önlemek için.
      2. Traut'ın reaktif (2-iminothiolane) 20 molar aşırı antikor için ekleyin ve karıştırma ile Oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya. Traut'ın reaktif (Kuru toz) içinde bir kimyasal duman hood thiol gruplarına Amin grupları dönüştürür solunum önlemek için ölçmek.
      3. İyice 1 x 3 kez santrifüj yoğunlaştırıcı 50 kDa MWCO ile kullanarak PBS-EDTA arabellek ile yıkama ve son hacmi 500 µL. ölçmek kadar antikor çözüm kullanarak konsantrasyonu konsantre üreticinin yönergeleri izleyin bir Spektrofotometre.
    2. Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) kullanarak maleimide grupları için Amin fonksiyonel gruplar üzerinde manyetik nanopartikül dönüştürmek Siklokekzan-1-karboksilat (Sulfo-SMCC, teknik notu * 202).
      1. PBS-EDTA arabellek x 10 1:10 at karşı antikorlar için eklemek parçacık oranı.
      2. Sulfo-SMCC deiyonize su ve girdap konsantrasyonu 1 mg/mL resuspend için geçiyoruz. Bir kimyasal duman hood maleimide gruplarına Amin grupları dönüştürür solunum önlemek için içinde Sulfo-SMCC (Kuru toz) ölçmek.
      3. Parçacıkların her milimetre kare yüzey alanı için Sulfo-SMCC çözümü 0,016 nmol ekleyin. 100 nm parçacıkların 1 mg için 0.3 mg Sulfo-SMCC kullanın. Oda sıcaklığında 1,5 saat için tepki olanak sağlar.
      4. 1 x 3 kez bir manyetik alan ile manyetik bir sütun kullanarak PBS-EDTA arabellek parçacıklar yıkama ve PBS-EDTA arabellek x 1 500 µL içinde resuspend.
        Not: Eğer 200 daha küçük parçacıklar kullanarak nm, burada, 100 nm parçacıklar açıklandığı gibi büyük olasılıkla kalıcı mıknatıslar olmayacaktır için yıkama veya amaçları konsantre partiküller çekmek için güçlü. Böylece, daha küçük parçacıklar yıkamak için manyetik alan yükseltmek için ferromanyetik alanlarda oluşan manyetik bir sütun kullanın.
    3. Tepki parçacıklar thiolated antikorlar (teknik notu 201) ile maleimide functionalized.
      1. Parçacıklar bir cam mercek şişe ekleyin, bir mini-manyetik heyecan çubuğu eklemek, sadece bir santim yukarıda bir manyetik heyecan tabak yerleştirin ve Manyetik parçacık çözümü karıştırma ikna etmek.
      2. Karıştırma, thiolated antikorlar (antikor parçacıkların her 1 mg için 0.5 mg) dropwise ekleyin. Gecede oda sıcaklığında tepki olanak sağlar.
      3. 3 kez manyetik alanını kullanarak 1 x PBS arabellek ile yıkama ve 1 x PBS 500 µL içinde resuspend. Etiket ve 6 aya kadar 4 ° C'de depolayın.
        Not: maksimum konjugasyon verimliliği ortaya çıkar maleimide functionalized parçacıklar hemen thiolated protein ile karıştırılır.
  2. Kat antijen spesifik ve uyarıcı sinyalleri manyetik parçacıklar (Şekil 3) NHS kaplı için. Bu işlem için 200 anlatılan nm, NHS kaplı superparamagnetic nano tanecikleri.
    1. Resuspension arabellek, arabellek su verme ve depolama arabellek hazır olun. Resuspension arabellek 25 mM 2-(N-morpholino) olan ethanesulfonic asit (MES) ara 20 ayarlanır pH %6.0 0,01 ile. Su verme arabellek bir 100 mM Tris-HCl pH 7.4 çözümdür. Depolama arabellek bir çözümdür 10 mM PBS ve % 0,01 pH 7.4 ara.
    2. Lyophilized parçacıklar 1 mL resuspension tampon resuspend. Girdap şiddetle hiçbir toplamları görünür hale gelene kadar en az 15 dk için.
    3. Manyetik parçacıklar süpernatant kaldırmak için resuspension arabellek ve transfer cam mercek şişe 0.5 mL ile resuspend için manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Girdap yok toplamları görünür hale gelene kadar.
    4. Toplam protein resuspended parçacıkların 1 mg başına 0.1 mg ekleyin. Girdap karışımı ve karıştırma süre 2,5 h için oda sıcaklığında tepki.
    5. Arabellek Şoklama 0.1 mL ekleyin ve karıştırma sırasında oda sıcaklığında 30 dakika tepki.
    6. Mercek şişe manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve parçacıklar yıkayın. Süpernatant kaldırmak için açık olana kadar bekleyin. Parçacıklar manyetik standından kaldırmak için hiçbir toplamları görünür hale gelene kadar resuspension tampon ve girdap 1 mL ekleyin. Üç kez bu adımları tekrarlayın ve parçacıklar 1 mL resuspension tampon resuspend. 4 ° C'de parçacıklar 6 aya kadar saklayın.
  3. Kat antijen spesifik ve uyarıcı sinyalleri anti biotin kaplı manyetik parçacıklar (Şekil 4). Bu işlemi için 50-100 nm, Anti-biotin superparamagnetic nano tanecikleri açıklanmıştır.
    1. Biotinylate MHC-IG veya co-stimulatory molekül.
      1. Ayarlamak protein konsantrasyonu 0.5-2 mg/mL PBS arabelleği. Sulfo-NHS-biotin konsantrasyonu 10 mg/mL deiyonize su, resuspend ve 20-fold molar uyarıcı için aşırı antikor ekleyin. 45 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
      2. Bir 50 kDa MWCO santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak kez PBS 3 ile iyice yıkayın, son hacmi 500 µL. ölçmek kadar bir spektrofotometre kullanarak antikor çözüm konsantrasyonu konsantre üreticinin yönergeleri izleyin.
    2. Eşlenik biotinylated MHC-IG ve/veya co-stimulatory sinyalleri Anti-biotin nano tanecikleri. 500 µL hisse senedi Anti-biotin parçacıkların için uyarıcı antikor 0.5 nmol ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
    3. Konjuge aAPC nano tanecikleri yıkayın. Bu parçacıklar 200 daha küçüktür çünkü nm, manyetik bir sütun ıslak ve manyetik kürsüye.
    4. Parçacık/protein süspansiyon sütununu ekleyin. Tüm protein/tamamen sütun girmek parçacıkları izin.
    5. Sütun için üç kez PBS 0.5 mL ekleyerek yıkayın.
    6. Manyetik standından sütun kaldırma, PBS 0.5 mL için sütun ekleme ve pistonu, Ermeniyi cam mercek şişe içine parçacık aAPCs kullanarak elute. Parçacıklar 4 ° C'de 6 aya kadar saklayın.
      Not: Parçacıklar 6 aya kadar 4 ° C (-değil var dondurulmuş) stabildir. Daha yüksek sıcaklıklarda parçacıkların işlevselliğini azaltabilir ve bazı partikül toplama (veri gösterilmez) gözlemlenmiştir. Bu önemli ölçüde parçacıkların raf ömrü azalır gibi oda sıcaklığında uzun bir süre için tutmayın.

3. yapay antijen floresan antikor algılama kullanarak hücre nano tanecikleri sunulması Protein içeriğine karakterize eder.

Not: Bu yararlı bir kalite kontrol üretilen yapay antijen sunan hücreler var. Ayrıca, uyarıcı sinyal miktarı eşdeğer aAPC dozlarda toplu işlemleri ve çeşitli aAPC türleri arasında üretmek için kullanılır (Örn., farklı boyutlarda).

  1. Kaplamalı aAPCs parçacık konsantrasyonu ölçmek.
    1. Hisse senedi çözüm çekimsiz parçacıkları kullanın ve 1:2 doz titrasyon PBS bir çözüm rastlamak bir 96-şey düz oturaklı doku kültürü tabak iyi başına 100 µL ile yapabilirsiniz.
    2. Parçacıklar bir plaka okuma spektrofotometre 405, üzerinde okuma nm bilinen parçacık konsantrasyonu standart bir eğri oluşturmak için.
    3. Konjuge aAPCs örneğini alın, PBS içinde 100 µL toplam bir birime sulandırmak ve spektrofotometre üzerinde okuyun.
  2. Fabrikasyon aAPCs örneği kaldırmak ve floresan antikor ile leke.
    1. Kaldırmak için ne kadar örnek hesaplamak için parçacık yüzeyinde antikorları sayısını tahmin ediyoruz.
      Not: Bu teknikler için yaklaşık 1000 antikorlar/µm2 parçacık yüzey alanının yoğunluğu varsayıyorum. Floresans tespit edebilmek için yaklaşık 1011 MHC-IG-CD28 molekülleri floresan test başına toplam gerektirir.
    2. AAPCs 100 µL kadar hacmi PBS içinde getirmek, boyama antikorlar 1: 100 seyreltme eklemek ve 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya
      Not: örnek antikorlar başarıyla kullanılan Birleşik FITC sıçan-anti fare IG λ1, λ2, λ3 hafif zincir, R26 MHC-IG ve FITC konjuge fare Ermeni/Suriye hamster IgG, anti anti-fare CD28 algılamaya G192-1, klonu algılamak için 46 klon.
  3. Parçacıklar yıkama ve floresan bir floresan plaka okuyucu üzerinde okuyun.
    1. Manyetik (2. adımda açıklandığı gibi) lekeli aAPC kesirler üç kez PBS 0.5 mL ile yıkayın.
    2. PBS 0.5 mL ile yıkanmış aAPCs elute.
    3. Eluted aAPCs, 100 µL olduğu gibi adım 3.1 absorbans kullanarak toplama okumak için 96-şey düz oturaklı bir tabak ekleyin.
    4. Kalan 400 µL alın, iki 200 µL aliquots ayrıldı ve siyah, polistren 96-şey, düz oturaklı plaka iki kuyu için ekleyin. Plaka aşağı 1:2 oranında 100 µL çözüm alarak ve de en az dört kez PBS 100 µL her sahiptir sonraki kuyu ile karıştırma titre.
      Not: Ortalama birden fazla ölçü Gürültü ölçüm azaltmak için çoğaltır.
    5. Aynı siyah 96-şey tabağında, floresan antikor leke, 1: 200 bir iyi 200 µL PBS ve en az 12 kuyuları için 1:2 oranında aşağı titrating ile de ekleyerek için kullanılan standart bir eğri olun.
    6. Sonra aAPC ve floresan antikor plaka üzerinde plaka floresan plaka okuyucu ile okumak.
  4. Parçacık başına protein miktarını hesaplamak. Nerede antikor konsantrasyon bilinmektedir standart eğri değerleri karşılaştırarak antikor konsantrasyonu belirlemek, antikor antikor boyama 1:1 oran varsayarak algılandı. Tespit edilen antikor bu konsantrasyon absorbans tahlil tarafından belirlenen parçacıklar konsantrasyonu ile bölünerek antikor Parçacık başına numarası verecektir.

4. antijen spesifik CD8 + T hücrelerle hazırlanan nanopartikül yapay antijen sunan hücreler zenginleştirmek.

  1. CD8 + T hücreleri izole et.
    1. Servikal çıkığı tarafından takip isoflurane maruz hayvanlara ötenazi.
    2. Dalak ve lenf bezleri wildtype C57BL/6j fareler kaldır ve PBS bir çözümde yer. Organları macerate ve hücreleri aracılığıyla bir steril 70 µm hücre süzgeç PBS sık yıkama ile elute.
    3. Sigara - CD8 + T hücreleri ortadan kaldırmak için bir dokunmadan CD8 + T hücre izolasyon kit kullanın ve üreticinin yönergeleri izleyin.
      Not: En az 3 x 106 CD8 + T hücreleri her antijen koşulu gerektirir.
  2. CD8 + T hücreleri bağlamak için nanopartikül aAPCs ekleyin.
    1. Yalıtım 100 µL % 0.5 Sığır serum albumin (BSA) ve 2 mM EDTA PBS içinde bir birime konsantre.
    2. Numarasını belirleyin 1011 aAPC bağlı oranına dayanarak hesaplayarak eklemek için aAPCs peptid-MHC-IG her 106 CD8 + T hücreleri için yüklü.
    3. AAPC parçacıklar kuluçkaya ve CD8 + T hücreleri 4 ° C'de sürekli bir steril 5 mL polistiren karıştırma ile 1 h için alt tüp yuvarlak.
  3. İlave medya ve T hücre büyüme faktörü (TCGF) elute ve CD8 + T hücreleri kültür için hazır olun.
    1. İlave medya için 1 x esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pyruvate, 0,4 x vitamini çözüm, 92 µM 2-mercaptoethanol, 10 µM siprofloksasin ve % 10 fetal Sığır serum (FBS) ile komple RPMI 1640 medya (ile glutamin) ek.
    2. TCGF olmak için iletişim kuralları zaten kurulmuş ve başvurulan burada9izleyin.
      Not: TCGF T hücreleri büyümek için gerekli ek uyarı sinyalleri ile sağlamak için gerekli olan insan bağışıklık sitokinler içi bir kokteyl var. TCGF IL-2 gibi bilinen T hücre uyarıcı sitokinlerin için takas 7 Il veya IL-15; Ancak, her buna göre T hücre yanıt kutuplaştırmak. Burada açıklanan protokol bu kokteyller ile optimize edilmemiş; Böylece diğer teknikleri-müşavire danışılmalıdır için konsantrasyonları ve10,11TCGF örneklerle kullanılırsa birleşimleri listelenir.
  4. Yıkama ve aAPC ve CD8 + T hücre karışımı zenginleştirmek.
    1. 2. adımda açıklandığı gibi Manyetik parçacık aAPCs yıkayın. Ancak, ilk PBS tampon % 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ile kullanarak yıkama, ikinci kullanarak desteklenen medya ve üçüncü kullanarak desteklenen medya % 1 ile TCGF.
    2. AAPCs ve 500 µL % 1 ile desteklenmiştir medya zenginleştirilmiş CD8 + T hücre elute TCGF.
    3. Bir hemasitometre ve plaka bir 96 U popolu tabak içinde % 1 ile desteklenmiştir medya kuyu başına 160 µL'yı kullanarak hücreleri saymak bir konsantrasyon 2, 5 x 105 CD8 + T hücre/mL, TCGF.
    4. AAPCs ile kullanarak yalıtma sadece peptid-MHC-IG yüzeyde (co-stimulatory hiçbir sinyalleri), o zaman tam adım 4.5 yüklü eğer. Her iki peptid yüklü MHC-Ig tarihinde yüzey ve co-stimulatory sinyalleri ile aAPCs kullanarak yalıtma, adım 5'e devam edin.
  5. Zenginleştirilmiş kesir yüzeye co-stimulatory sinyalleri ile kaplı manyetik parçacıklar ekleyin ve uyarıcı sinyalleri T hücrelerinin yüzeyinde ortak küme için bir manyetik alan ekleyin.
    1. Zenginleştirilmiş kesirler ekimolar bir (veya daha çok uygulama bkz: Bölüm aAPC özellikleri denetlemek için hakkında bağlı olarak) eklemek, peptid yüklü MHC-Ig tarihinde parçacık sayısı için uyarıcı antikor.
    2. 4 ° C'de 1 h için zenginleştirilmiş CD8 + T hücre bağlanacak co-stimulatory manyetik parçacıklar izin
    3. Manyetik alan iki Neodim N52 disk mıknatıs 1.9 cm (0,75 inç) uzunluğu arasında kültür plaka yerleştirerek ekleyin.
      Not: Son derece güçlü bir alan N52 disk mıknatıslar var. Onları mıknatıslar arasında boşluk ekleyiciler ile birbirinden kaldırmak zor olduğu gibi ve ne zaman onları kültür tabaklarda koyarak saklamak için her ikisi de özen gösterilmelidir. Kuluçka makinesi metal bileşenleri için yapışmasını üzerinden mıknatıslar en aza indirmek için 50 mL konik tüp Styrofoam kaplar hem alt hem de üst yer onları.

5. genişletin ve antijen spesifik CD8 + T hücrelerle hazırlanan nanopartikül yapay antijen sunan hücreler algılamak.

  1. İçinde oksijen %5 aAPCs ve CD8 + T hücreleri ile 96 U popolu iyi plaka eklemek CO2, 37 ° C kuluçka 3 gündür. 3 günde 80 µL hücrelerle %2 TCGF ve yer ile desteklenmiştir medya kuyu başına da kuluçka 7 güne kadar yem.
  2. 7 günde 5 mL yuvarlak sayımı için alt tüp içine uyarılmış hücre hasat.
  3. Bir kez tüm çözüm hasat edilir, hasat PBS 0.5 ml % 0.05 sodyum azid ve % 2 ile resuspend hücrelere aşağı spin FBS. Trypan mavi ile boyama ve hemasitometre üzerinde hesap tarafından canlı hücreleri hesaplama.
  4. İki yeni 5 mL antijen spesifik boyama için alt tüpler yuvarlak içine 50.000-500.000 sayılan hücre kaldırma. Bir tüp soydaş peptid-MHC leke için kullanılacak olan ve diğer tüp konağımız sigara lekesi için arka plan boyama belirlemek için kullanılır.
  5. İlgili konağımız ve PBS 100 µL % 0.05 sodyum azid ve % 2 ile tüplerde konağımız sigara biotinylated MHC-IG (2. adımda açıklanan tekniği kullanarak) 1 µg eklemek allophycocyanin (APC) ile FBS-Konjüge fare Anti-fare CD8a, klon 53-6,7 (seyreltme oranı 1: 100) 4 ° C'de 1 h için
  6. İkincil streptavidin ekleyin ve ölü leke yaşamak. Santrifüjü yoluyla aşırı biotinylated MHC-IG PBS ile yıkayın. Phycoerythrin (PE) 1:350 oranında tüm örneklerini leke-4 ° C'de 15 dakika canlı/ölü tamir edilebilir yeşil ölü hücre leke streptavidin ve 1: 1000 oranında etiketli
  7. Özgüllüğü ve antijen spesifik hücreleri belirlemek için bir akış sitometresi üzerinde tüm örneklerini okuyun.
    1. Fazla ikincil yıkama ve canlı/ölü leke Santrifüjü tarafından ve PBS arabelleği % 0.05 sodyum azid ve % 2 ile 150 µL ile resuspend FBS bir akış sitometresi okumak için.
  8. Sayı ve antijen spesifik hücreleri veri analiz yazılımı ile yüzde belirlemek.
    1. Antijen spesifik hücreleri yüzde belirlemek için aşağıdaki kapıları ilgili sipariş canlı + lenfosit + (yan dağılım tarafından ileri dağılım), CD8 + ve Dimer + kullanın. Dimer + kapı sigara-konağımız soydaş leke için karşılaştırarak belirle.
    2. Dimer + sigara konağımız MHC-IG leke soydaş MHC-IG leke yüzdesi çıkararak antijen spesifik bir örnek hücrelerde yüzdesini belirlemek.
    3. Bu yüzde antijen spesifik hücre kullanarak, tarafından sayılır, hücre hücre antijen spesifik sonuç sayısı zenginleştirme ve genişleme verimli sayısı ile çarpın.
      Not: Tazminat bu panelinde kullanılan fluorophores spektral çakışma olduğundan akış sitometresi üzerinde kurulmuş olması gerekir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Başarılı zenginleştirme ve genişleme antijen spesifik T hücrelerinin tamamlamak için peptid yüklü MHC-IG ve co-stimulatory molekülleri başarıyla aAPC parçacık iliştirilmesi gerekir. Parçacık Eki 3 yöntemleri üzerinde bağlı olarak, biz başarılı konjugasyon yordam sonucu (Şekil 5a) temsilcisi bazı veriler sağlar. Nitekim, ligand yoğunluğu çok düşük ise, o zaman olacak bu 100 yukarıdaki ligandlar arasındaki doğrusal Aralık etrafında oluştuğu antijen spesifik CD8...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Nanopartikül yapay antijen sunan hücreler (aAPCs) üzerinde esaslı bir roman antijen spesifik T hücre izolasyon teknoloji oluşturduk. Nanopartikül aAPCs peptid-MHC bırakmak antijen spesifik T hücre bağlama ve harekete geçirmek co-stimulatory harekete geçirmek yanında yüzey üzerinde yüklenmiş. aAPCs da paramagnetic ve böylece bir manyetik alanını kullanarak nadir antijen spesifik T hücreleri zenginleştirmek için kullanılabilir. Biz en iyi duruma getirilmiş ve anahtar nanopartikül özellikleri boyut, ligand yoğunluğu ve liga...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar aşağıdaki rakip mali interest(s) ilan: NexImmune ve Johns Hopkins Üniversitesi arasındaki Lisans Sözleşmesi altında Jonathan Schneck üniversitede bu konuda açıklanan ürünler satışı, tarafından alınan telif pay hakkına sahiptir Makale. O da NexImmune kurucusu ve sermaye şirket sahibi. NexImmune'nın Yönetim Kurulu ve Bilimsel Danışma Kurulu üyesi olarak hizmet vermektedir. Bu düzenlemelerin şartları gözden geçirilmiş ve onun çıkar çatışması ilkelerine uygun olarak Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmış.

Teşekkürler

J.W.H. NIH kanser nanoteknoloji Eğitim Merkezi Johns Hopkins Enstitüsü'nde NanoBioTechnology, Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu (DGE-1232825) ve kemerler Vakfı bursu destek için teşekkürler. Bu eser destek Ulusal Sağlık Enstitüleri (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland İnovasyon Girişimi ve Coulter Vakfı (JPS) tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DimerX I: Rekombinant Çözünür Dimerik İnsan HLA-A2:Ig Füzyon ProteiniBD Biosciences551263
DimerX I: Rekombinant Çözünür Dimerik Fare H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I: Rekombinant Çözünür Dimerik Fare H-2K[b]:Ig Füzyon ProteiniBD Biosciences550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000GE Yaşam Bilimleri28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000GE Yaşam Bilimleri28932257
Saflaştırılmış İnsan Beta 2 MikroglobulinBio-RadPHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanopartiküllerMicromod79-01-102
Super Mag NHS Aktif Boncuklar, 0.2 ve mikro; mOkyanus NanoteknolojiSN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi130-105-637
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217
Sulfo-SMCC Çapraz Bağlayıcı ve nbsp;ProteoChemc1109-100mg
2-İminotiyoolan hidroklorürSigma-AldrichI6256 Sigma 
96 Kuyu Yarım Alan Mikroplaka, siyah polistirenCorning3875
FITC Sıçan Anti-Fare Ig, &anda; 1, λ 2, & λ 3 Hafif Zincir  Klon & nbsp; R26-46   BD Biosciences553434
FITC Fare Anti-Ermeni ve Suriye Hamsteri IgG  Klon & nbsp; G192-1BD Biyolojik Bilimler554026
B6. Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenik PMEL) farelerJackson Laboratuvarı005023
C57BL/6J (B6 vahşi tip) farelerJackson Laboratuvarı000664
CD8a+ T Hücre İzolasyon Kiti, FareMiltenyi130-104-075
MS SütunlarıMiltenyi130-042-201
LS SütunlarıMiltenyi130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PEBiolegend405203
0.75 inç & N52 disk mıknatısları;K & J MagneticsDX8C-N52
APC anti-fare CD8a Antikoru, klon 53-6.7Biolegend100711
CANLI / ÖLÜ Sabitlenebilir Yeşil Ölü Hücre Leke Kiti, 488 nm uyarma için ThermoFisherL-34969
Serisi

Kaynaklar

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11(2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149(2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572(2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Yapay antijen sunan hücrelerZenginleştirme genişletme tekniğiAkış sitometrisi analiziCD8+ T hücresi izolasyonuPeptit yüklü MHC-IgT hücresi büyüme faktörüBiyotinillenmiş MHC-IgStreptavidin konjugatlı antikor
Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.