Burada, biz yeni bir floresan polyacrylamide jellerin toplam protein algılaması için teknik boyama özetleyen bir detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Ag+algılar bir gümüş iyon özgü Floresans tahrik sonda protokol kullanır-protein kompleksleri ve geleneksel chromogenic gümüş lekeler belirli sınırlamaları ortadan kaldırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama
Bu makalede
Özet
Özet
Gümüş boyama polyacrylamide Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) takip jelleri bantlarında protein görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir Renkölçer tekniktir. Klasik gümüş lekeleri yüksek arka plan boyama, zavallı protein kurtarma, düşük tekrarlanabilirlik, miktar ve kütle spektrometresi (MS) ile sınırlı uyumluluk için dar bir doğrusal Dinamik Aralık gibi bazı dezavantajları var. Şimdi, bir fluorogenic Ag+ sonda, TPE-4TA, kullanımı ile floresan bir gümüş boyama yöntemi polyacrylamide jellerin toplam protein görselleştirme için geliştirdik. Bu yeni leke geleneksel gümüş lekeleri zahmetli gümüş azaltma adımda önler. Ayrıca, floresan gümüş leke iyi tekrarlanabilirlik, ışık hassasiyeti ve protein bulunması, yapım o bir yararlı ve pratik protein jel leke doğrusal miktar gösterilmektedir.
Giriş
Birçok boyama yöntemi Jel Elektroforez takip, örneğin Coomassie parlak mavi, gümüş leke, Floresans gibi Renkölçer boya kullanarak proteinler görselleştirmek için kullanılan veya radyoaktif1,2, etiketleme olmuştur 3 , 4. gümüş boyama olarak kabul edilir en hassas teknikleri için basit ve ucuz reaktifler gerektiren protein algılama biri olmak. İki büyük aile sınıflandırılabilir:5,6ammoniacal gümüş leke ve gümüş nitrat leke. Alkali ammoniacal gümüş yönteminde, gümüş-diamin karmaşık amonyak ve sodyum hidroksit ile üretilen ve metalik gümüşe asidik formaldehit çözümünü kullanarak geliştirme sırasında düşük. Leke temel proteinler için verimli bir şekilde karşılar ama asidik ve tarafsız proteinler için güvenliği aşılan bir performansı gösterir ve ayrıca, klasik glisin ve taurin elektroforetik sistemleri için sınırlı olduğunu. Buna karşılık, gümüş nitrat lekeleri yüksek biyo-benzeşme protein gümüş iyonların yararlanmak, öncelikle sulfhydryl ve karboksil grupları yan zincirlerinden ve asidik protein daha verimli bir şekilde leke eğilimi7. Bağlama gümüş iyonu sonra (genellikle formaldehit ve sodyum tiyosülfat içeren metal karbonat çözeltisi imal) gelişmekte olan bir çözüm görselleştirmek için bir kahverengi koyu rengi inşa Metalik Gümüş tahıl için gümüş iyonları azaltmak için uygulanır protein bantları.
Gümüş boyama gelişimi 1970'li yıllarda8beri onun çok yönlü ve yüksek hassasiyet için bilinen olmasına rağmen yöntem sık kadar zor kabul edilir. Gümüş boyama yöntemleri zaman sınırlı adımlar ve düşük tekrarlanabilirlik göster. Gümüş leke rengi genellikle tek tip ve kontrol etmek zordur, azaltma adım bağımlı olmadığından gümüş leke nicel bir yöntem değildir ve böylece, jel karşılaştırma çalışma ve protein miktar9için tavsiye edilmez. Duyarlılık içinde en iyi duruma getirilmiş yöntemleri de10boyama daha fazla üniforma sağlayabilir aldehitler yararlanmak olabilir. Ancak, daha fazla akış aşağı analiz protein aldehitler tarafından polietilenin nedeniyle pahasına bu. Hızlı iletişim kuralları çoğunlukla birleştirmek ya da uzlaşma tekrarlanabilirlik ve leke5tekdüzelik süresini kısaltmak için adımları kısaltabilirsiniz. Sonuç olarak, orada çok sayıda gümüş türevleri içinde protein jel, her belirli gereksinimleri uyacak şekilde en iyi duruma getirilmiş boyama boyama; Örneğin, basitlik, duyarlılık veya peptid kurtarma oranı için aşağı akım analizi. Bu öznitelikler de birbirlerine bir etkiye sahip ve bir iletişim kuralı tüm gereksinimlerinin karşılanması zor olabilir.
Bu çalışmada, biz yeni bir floresan gümüş boyama yöntemi polyacrylamide jel protein algılama için tanıtmak. Bu yöntemde, bir fluorogenic sonda gümüş iyonları, TPE-4TA (şekil 1), gümüş emdirilmiş proteinler11görselleştirmek için kullanıyoruz. TPE-4TA toplama kaynaklı emisyon (AIE) ilke tarafından tasarlanmıştır. Bu sigara-sulu çözüm içinde çözünmüş zaman yayıcı ama gümüş iyonlarının varlığında son derece yayıcı. Geleneksel gümüş lekeleri chromogenic geliştirilmesinde adım gelişen bir fluorogenic ile değiştirerek, floresan gümüş yöntemi azaltılmış bir arka plan ile toplam proteinlerin sağlam boyama sağlar.
Ayrıca, floresan gümüş leke için yaygın olarak kullanılan SYPRO Ruby leke ile karşılaştırılabilir ve geleneksel gümüş lekeleri ile ulaşılabilir protein miktar iyi dinamik bir doğrusal Aralık gösterdi. Jel bir ultraviyole lamba ile sık kullanılan jel dokümantasyon sistemleri üzerinde yansıma (uyarma dalga boyu: 302/365 nm kanal; emisyon: ~ 490-530 nm) birçok biyolojik laboratuarlarında.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hazırlık jel
Not: Gösteri jel sonra kısa bir süre12SDS-sayfa boyama için hazırlamak için standart bir protokol izler. Kısaca, aşağıdaki adımları örnekleri hazırlanması tarif ve Elektroforez jel.
- SDS-sayfa % 4 - % 12 Bis-Tris protein jelleri (1 mm, 15-şey) ile gerçekleştirmek bir mini jel tankı kullanarak dolu ile 2-(N -morpholino) ethanesulfonic asit (MES) arabellek.
- Distile su, lityum Lauryl Sülfat (LDS) arabellek ve örnek azaltma Ajan karışımı ile örnekleri sulandırmak.
- Ardından normal stok tutarı (5 µL) ve bundan sonra iki kat dilutions hisse senedi (8192 x 2 x 13 dilutions) bir dizi ilk yol, iki katına stok (10 µL) yükleyin.
- Jel 30 dk için 200 V sabit voltaj çalıştırın.
2. jel fiksasyonu
- Elektroforez sonra 50 RPM (her biri için 30 dk) x 2 oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de bir orbital Çalkalayıcı üzerinde 100 mL solüsyon % 40 ethanol/10% Asetik asit jelleri daldırın
- Jelleri 3 x 10 dk her ultrasaf su temiz bir kap içinde yıkayın. Çamaşır, kritik bir adımdır. Sabitleme çözümden asit içinde belgili tanımlık fluorogenic gelişmekte olan adım düzgün kaldırılmaz ise aşırı TPE-4TA asit tarafından etkinleştirilecek ve güçlü arka plan Floresans jel içinde yol.
3. hazırlık AgNO3Çözüm ve jel gümüş emprenye
- AgNO3 çözüm (%0,0001) yapmak emprenye için ilk olarak, AgNO3 10 mL % 0,1 AgNO3 hisse senedi çözüm hazırlamak için ultrasaf su 0,01 g geçiyoruz. Sonra 100 µL % 0,1 AgNO3 hisse senedi çözüm çalışma çözüm yapmak için ultrasaf su 100 mL ekleyin.
Not: Kullanmadan önce karanlıkta AgNO3 çözüm saklanmalıdır. - Jel 100 mL 50 RPM mühürlü cam kap içinde bir orbital Çalkalayıcı 1 h için çözüm üzerinde gümüş ile hamile. Gümüş emprenye ışık alüminyum folyo ile korunan bir duman başlık altında gerçekleştirmek için önemlidir.
- 2 x 60 için temiz bir kapta jel ultrasaf su (yaklaşık 100 mL) ile yıkayın s.
4. Fluorogenic geliştirme jel
- Boya stok çözüm (0,1 mM) hazırlamak TPE-4TA boya 3.0 mg 50 mL ultrasaf su ekleyin. Bir kaç dakikalığına çözüm solüsyon içeren temizleyicide ve boya dağıtılması yardımcı olmak için bazı NaOH çözüm (örneğin 1 M) ekleyin.
- Boya molekül tamamen tasfiye edilir emin olmak için 365 nm UV lambanın altında çözüm Floresans denetleyin. Yalnızca zayıf veya nonemissive çözümleri tam çözülme belirtir.
Not: TPE-4TA yapıldı boya protokol son zamanlarda Xie vd tarafından rapor aşağıdaki sentezledim. 10 TPE-4TA çözüm çok kararlı ve karanlıkta aylarca tutulabilir. - 100 mL fluorogenic geliştirilmesi çözeltisi (10 µM) hazırlamak ultrasaf su 90 mL 10 mL TPE-4TA stok çözeltisi ekleyin. PH metre kullanarak çözüm pH kontrol ve 7-9 sodyum hidroksit çözüm (1 µM) kullanmaya ayarlamak.
- Jel 100 mL fluorogenic geliştirilmesi çözeltisi ile temiz ve yapışmalı konteyner aktarın. Jel tamamen çözümde dalmış olduğundan emin olun. Konteyner mühür. Işıktan yap da gecede 50 RPM oda sıcaklığında bir orbital Çalkalayıcı üzerinde salla. Alternatif olarak, kuluçka adım da yaklaşık ~ 2 h AIE gelişmekte olan çözüm ile 80 ° C arasında boyama ve sonra oda sıcaklığında bırakarak için ön ısıtma ile kısaltılabilir.
5. destaining ve görüntüleme
- Temiz bir kaba jel transfer ve 100 ml % 10 etanol için 30 dk destain.
Not: Jel yıkamak için su tek başına kullanılabilir. Ancak, daha zaman destaining için % 10 etanol çözümü kullanmak verimli olur. Bu destaining işlem için 30 dk dan itibaren azaltmak için yardımcı olur. - Ultrasaf su 5 min için jel durulayın.
- Görüntü 365 nm kanal veya 302 nm kanal bir jel dokümantasyon makine tarafından jel.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tarafından floresan gümüş leke lekeli protein bantları 365 nm UV lambası altında yoğun bir yeşil Floresans sergi. Bütün 14 protein grupları (10-200 kDa), yukarıdan aşağıya doğru açıkça görülebilir, iyi tarafından SYPRO Ruby boya (Şekil 2)10lekeli 14 kırmızı renkli olanlar ile birleştiriliyor.
İle ilgili nicel protein algılama, jelleri görüntüleme sistemi otomatik yordamları k...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan bir roman floresan gümüş yöntemi polyacrylamide jeller proteinler için boyama. Bu strateji geleneksel gümüş lekeleri ve floresan lekeleri bütünleştirir. Proteinlere olduğu gibi diğer gümüş gümüş iyonu seçmeli bağlama lekeleri ama son derece hassas fluorogenic gümüş kullanır boyama patlatır gümüş ilişkili proteinler kadar ışık için TPE-4TA sonda. Fluorogenic sonda TPE-4TA oldukça düşük konsantrasyon nanomolar Aralık11, gümüş iyonları hissi olabilir b...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Bu floresan gümüş boyama üzerinde bir patent başvurusu şikayetçi oldu.
Teşekkürler
Yazarlar Patrick Chan Ming Wai Lau merkezinde onarıcı tıp, Karolinska Institutet, onun teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. S. X. İsveçli Araştırma Konseyi (Grant No 2017-06344) destek için minnettar olduğunu.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
LDS Numune Tamponu (4X) | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reaktif |
%4-12 Bis-Tris Protein Jelleri, 1.0 mm, 15 kuyulu | Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Prekast jel |
| Numune Azaltıcı Ajan (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reaktif |
| MES SDS Koşu Tamponu (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reaktif |
| Mini Jel Tankı | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Ekipman |
| 300W Güç Kaynağı (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Ekipman |
| Lekesiz Protein Merdiveni | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Örnek |
| Gümüş nitrat | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reaktif |
| Etanol | Bragg ve diğerleri. | 42520J | Reaktif |
| Asetik asit | J.T. Baker | 103201A | Reaktif |
| Milli-Q Sentezi A10 | M & Omega Sağlar; cm su | ||
| jeli dokümantasyon sistemi (c600 model) | Azure biosystems-Equipment |
Kaynaklar
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
