Yöntem makalesi

CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

DOI:

10.3791/58710

⸱

7 Ocak 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tumor Initiation and Maintenance Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 3Department of Bioengineering, University of California, San Diego

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması için basit ve ivedi soruşturma akut miyeloid lösemi (AML) hücre çoğalması içinde birden çok aday genlerin rolünün bir kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemi açıklar paralel. Bu teknik ölçeklenebilir ve de diğer kanser hücre hatlarında uygulanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gene pertürbasyon çalışmalar yoğun bireysel gen AML patogenezinde rol araştırmak için kullanılmaktadır. Tam gene bozulma ulaşmak için birçok bu çalışmalar yapmış karmaşık gen nakavt modelleri kullanın. Bu çalışmalar nakavt fareler ile genotip fenotip ilişkileri araştıran bir zarif ve zaman test sistemi sunarken, aday genler değerlendirmek için hızlı ve ölçeklenebilir bir yöntem bu AML hücre çoğalması bir rol veya AML modelleri hayatta kalma oynamak paralel sorgu birden fazla aday gen hızlandırmak yardımcı olacaktır. Genom düzenleme teknolojileri son gelişmeler önemli ölçüde bizim yeteneği benzeri görülmemiş ölçekte bir genetik tedirginlikler gerçekleştirmek için gelişmiş var. Genom düzenleme bir tür hedef hücre genom hızlı ve etkili değişiklik yapma için kullanılan yöntemi CRISPR Cas9 göre sistemidir. Kolaylık ve CRISPR/Cas9-aracılı gen-silme ölçeklenebilirliğini yapar çok sayıda gen sorgulama için en cazip tekniklerden birini fenotipik deneyleri. Burada, nükleer silahların yayılmasına karşı önemli bir rol oynayabilir genlerin rolünün veya insan yaşama araştırmak için CRISPR/Cas9 aracılı gen-kesinti yüksek üretilen iş akış sitometresi-tabanlı rekabet deneyleri ile kombine kullanarak basit bir tahlil mevcut ve fare AML hücre hatları.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son birkaç on yıl çok sayıda araştırma çabalarının anahtar moleküler yolları akut miyeloid lösemi (AML) patogenezinde katkısı belirlenmesi üzerinde duruldu gördüm. Geleneksel olarak, gen-bozulma AML hücrelerdeki koşullu nakavt fareler veya kısa saç tokası RNA (shRNA) kullanılarak yapılmıştır. Nakavt fareler gen-silme spatio-temporal kontrolü için gelişmiş bir sistem sunarken, gen nakavt fareler üreten emek, zaman alıcı ve pahalı. Ayrıca, gen-knockouts rekombinasyon stratejileri kullanarak kolayca ölçeklenebilir; değildir Bu stratejileri kendilerini de paralel olarak çeşitli genler sorgulama için borç yoktur. RNA müdahale yöntemleri için küçük müdahale RNA (siRNA) veya shRNA kullanarak knock-down endojen mRNA'ların keşfi sonra birçok grup AML belirli genlerin rolünü araştırmak için RNA müdahale teknikleri kullanmaya başladı. Fare ve insan AML hücreleri geleneksel transfection lipid tabanlı yöntemleri kullanarak transfect Rootkitler zor olduğundan, çoğu gen işlevi AML hücrelerinde çalışmak için lentivirally istihdam veya retrovirally kodlanmış shRNA çalışmalar. Son keşfi düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) kümelenmiş ve ilişkili Cas enzimler (CRISPR-Cas9) teknolojileri1,2,3gen hedefleme devrim. CRISPR-Cas9 kullanarak, belirli genler ve genomik bölgeler silinmiş, düzenlenemez veya verimliliği ve kolaylığı ile etiketlenmiş. CRISPR-Cas9-esaslı gen-düzenleme şimdi genotip fenotip ilişkileri farklı hücre tipleri basitlik, etkinlik ve bu tekniğin geniş uygulanabilirliği nedeniyle soruşturma için seçtiğiniz yöntemi olarak ortaya çıkıyor. CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemleri da yönteminin seçimi AML, sadece bireysel genler sorguluyor, ama birden çok gen dizilmiş veya havuza alınan genetik ekranlarda hedef için bir yol amaçlı olarak da paralel potansiyel olarak birkaç genleri araştıran hale geliyor AML-bağımlılıkları4,5,6.

Bu makale, gen-bozulma istikrarlı CRISPR-Cas9-aracılı gen-yüksek üretilen iş akış sitometresi tarafından takip düzenleme temel alan AML hücrelerinin büyümesini üzerinde etkisini ölçmek için bir basit rekabetçi büyüme tahlil açıklar. Bu yöntem basit, verimli ve ölçeklenebilir paralel AML hücrelerinde birkaç genlerin rolünün araştırılması için orta-den geçerek deneyler için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. üreten AML hücre satırı klonlar istikrarlı ve etkin Cas9 yüksek ifadesi ile

  1. Cas9 lentivirus imalatı
    1. 0. gün: 10 mL (BSL2) DMEM % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve penisilin ve L-glutamin bir 10 cm doku kültürü tabak içinde bir Biyogüvenlik seviye 2 ile plaka 4 x 106 293T hücrelerde hücre kültür hood sertifikalı. Çanak 37 ° C kuluçka makinesine koyun.
    2. 1. gün: Kaplama 293T hücreleri % 70 – 80 birleşmesi 1 gün olmalıdır. Öğleden sonra aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak transfection gerçekleştirin.
    3. Transfection orta, Kültür Medya ve transfection reaktif için oda sıcaklığında ısıtın. Transfection için tüm gerekli plazmid çözülme.
    4. PsPAX2, pMD2.G, 0.9 µg ve pLenti-Cas9 plazmid 9 µg transfection orta 5 mL tüp içinde 500 µL ile mix 9 µg.
    5. 14 ml Yuvarlak alt tüp transfection orta 1.7 mL ekleyin. Transfection reaktif 57 µL doğrudan tüp duvarına dokunmaktan kaçının için tüp transfection ortamda içine ekleyin.
    6. Yavaşça tüm plazmid mix transfection reaktif ekleyin ve hafifçe yan tüp dokunarak karıştırın. 20-30 dakika oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya. Bu arada, orta numaralı seribaşı 293T plaka değiştirin.
    7. Transfection karıştırmak dropwise plaka ekleyin ve hafifçe etkili karıştırma için yan plaka rock. Plaka 37 ° C kuluçka makinesine koyun.
    8. 2. gün: hücreleri değil rahatsız veya plaka yerinden süpernatant transfection plaka yavaşça Aspire edin. Süpernatant atmak. 10 mL taze % 10 DMEM orta aşağı yavaşça hücreleri kekii önlemek için plaka taraftan kaydırarak ekleyin.
    9. 3. gün: transfection plaka süpernatant yavaş yavaş içeren 10 cm steril enjektör çizerek virüs toplamak. Süpernatant şırınga toplandıktan sonra steril 0,45 µM filtre şırıngaya takın ve şırınga ve filtre bir taze, steril 15 mL polipropilen konik tüp üzerinde tutun. Yavaşça süpernatant 0,45 µM filtreden 15 mL polipropilen konik tüp içine içeren virüs filtre uygulamak için şırınga Dalma.
    10. Viral şartına orta aliquots 2 ml her birinin 2 mL cryovials-80 ° C'de depolayın
  2. AML hücresi satırlarının iletim
    1. Gün -1: 1 mg/mL rekombinant insan fibronektin parçası stok 10 µg/ml steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile sulandırmak. Kat sigara doku kültürü onaylı BSL2 hücre kültür mahallede 6 iyi plaka 2 mL 10 µg/mL rekombinant insan fibronektin parça çalışma çözeltisi ile tedavi. Plaka gecede buharlaşma ve mağaza oda sıcaklığında kaybını önlemek için sarılmak şal şal.
    2. 0. gün: Cas9 içeren viral süpernatant çözülme. Rekombinant insan fibronektin parçası çözüm tamamen kaplı kalenin hemen önce spinfection Aspire edin. Cas9 ile viral şartına Orta 2 mL plaka ekleyin ve 1.300 x g 35 ° C'de 90 dk için de spin Bu viral parçacıkların spinfected iyi eklemek yardımcı olur.
    3. Bu arada, transduced için hücreleri saymak ve 2 x 106 hücre 15 mL polipropilen konik tüp içinde aşağı spin. Süpernatant Aspire edin ve Pelet 2 mL taze kültür ortamının resuspend.
    4. Spinfection sonra tüm viral süpernatant spinfected de kaldırmak ve atın. Retroviral parçacıkları süpernatant de spinfected altına eklenir. Bu, yukarıdaki adımı ortamından 2 ml resuspended 2 x 106 hücre ekle.
    5. Plaka 1.300 x g çok kısa bir süre (1-2 dk) hücreleri altındaki yerleşmek izin vermek yeterli, tekrar çevir. Plaka da kuluçka yerleştirin ve gece kuyuya bağlı spinfected viral parçacıkların ile iletim için bırakın.
    6. 1. gün: hücre yoğunluğu bağlı olarak aşırı büyüme önlemek için transduced hücrelere daha fazla orta ekleme.
    7. 2. gün: pLenti-Cas9 plazmid Blasticidin direnç işaretçisi olduğundan, 10 µg/mL doz (kontrol) MOLM13 transduced ve untransduced adlı Blasticidin veya fare MLL AF9 lösemi hücreleri hücre ifade Cas9 seçimi için ekleyin.
      Not: Ne zaman tüm untransduced kontrol hücreleri ortadan Cas9 transduced MOLM13 veya MLL AF9 lösemi hücreleri Blasticidin yelpazesi tam olarak kabul edilir. Böylece optimal bir doz istihdam MOLM13 ve MLL AF9 lösemi dışında hücre hatlarında bir doz yanıt eğrisi bu deneme önce gerçekleştirilmelidir. Titrasyon, viral süpernatant da düşük iletim hızları durumunda gerçekleştirilebilir.
  3. Yüksek-Cas9 ifade hücrelerin seçimini klon.
    Not: Biz bazı AML hücre hatlarında klon seçimi gerekli olmayabilir fark etmişsinizdir: toplu Cas9-Blasticidin seçili nüfus zaten yüksek verim genom düzenleme vardır. Bu durumda, adım 1.3 atlamak ve western Blot tarafından Cas9 ifade toplu Cas9-blasticidin AML hücrelerinde değerlendirmek için adım 1.4 için devam etmek mümkündür. Hala gen düzenleme verimliliği rekabet deneyleri için devam etmeden önce bu toplu Cas9-AML hücrelerdeki (adım 1.5) değerlendirmek önemli olacaktır. Tek yüksek-Cas9 klonlar yelpazesi farklı tek Kılavuzu RNA'ların (sgRNAs) bir dizi test ederken özellikle önemlidir genom düzenleme değişkenliği azaltır tahmin.
    1. Tek hücreli bir nevi Cas9 Blasticidin adı bundan böyle MOLM13-Cas9 ve MLL-AF9-Cas9 hücreleri, sırasıyla, MOLM13 ve MLL AF9 lösemi hücreleri onaylı BSL2 mahallede bulunan bir FACS sıralayıcısı kullanarak seçili gerçekleştirin. Sıralama 5 – 10 yuvarlak alt doku kültürü tedavi 96 iyi kalıplara gerçekleştirilebilir.
    2. Bir kez MOLM13-Cas9 tek ve MLL-AF9-Cas9 klon seçilmiş ve tek tek adında, 10-20 klonlar 10 µg/mL Blasticidin kültür Cas9 ifade bakım sağlamak için medya ile genişletin.
  4. İfade istikrarlı Cas9 protein immunoblotting tarafından kontrol edin.
    1. MOLM13 ve MLL AF9 lösemi nükleer ekstraksiyon kiti başı olarak üreticinin iletişim kuralını kullanan tüm seçili Blasticidin klonların nükleer özleri olun. Cas9 protein ifade Anti-bayrak m2 antikor pLenti-Cas9 plazmid Cas9 beri bir N-terminal bayrak epitope bağlı kullanarak kontrol edin.
    2. Toplam protein 50 µg her nükleer özü Bis-Tris jel ve üst grup de ayrılır kadar 120 V jel çalıştırmak % 10 üzerine yükleyin.
    3. Membran TBST arabellek için 1s içinde %5 süt çözelti ile engelleyin.
    4. Membran ile Anti-bayrak M2 antikor gecede 4 ° C'de 1 µg/mL nihai bir konsantrasyon, 1:1,000 seyreltme kuluçkaya.
    5. Ertesi gün, membran TBST arabellek ile yıkama ve 1:5,000 (son konsantrasyon 0,16 µg/mL) 1 h için oda sıcaklığında bir seyreltme, HRP konjuge anti-fare ikincil antikor ile kuluçkaya.
    6. Membran TBST ile iyice yıkayın ve ECL substrat kullanarak leke geliştirmek.
    7. 3-4 klon Cas9 yüksek protein ifadesi ile daha fazla fonksiyonel analiz (Şekil 1) Western blot tarafından görüldüğü gibi seç.
  5. Seçili klonlar yüksek Cas9 etkinliğinde sağlanması
    1. Lentiviral süpernatant bir sgRNA kodlama vektöründen insan hedefleme sgRNAs ile hazırlamak veya adım 1. 1'açıklandığı gibi AAVS1 safe Harbor anlaşmasının locus fare.
    2. Üst Cas9 ifade MOLM13 transduce veya yukarıda açıklanan spinfection yöntemini kullanarak anti-AAVS1 sgRNA lentiviral süpernatant ile MLL AF9 lösemi klonlar. 2,5 µg/mL ile puromisindir 4 gün için seçin.
    3. Genomik DNA ekstraksiyon kiti üretici yönergelerine göre kullanarak kendi vahşi tipi denetim ile birlikte puromisindir seçimden sonra genomik DNA ' MOLM13-Cas9 veya MLL-AF9-Cas9 lösemi klonlar arındırmak. 2 x Taq polimeraz ve Tablo 1' de listelenen PCR programı ana karışımı kullanarak bir PCR ile AAVS1_test_primers gerçekleştirmek için bir şablon olarak DNA'ın kullanım 50 ng.
    4. PCR ürünü üzerinde % 2 özel jel çalıştırmak ve jel-268 baz çifti grubun bir jel ekstraksiyon kiti başı olarak üreticinin iletişim kuralı kullanarak arındırmak. Sanger sıra jel AAVS1_target-frag_F astar kullanarak PCR ürünü saf.
    5. Düzenleme verimliliği tarafından düzenlenmiş AAVS1 karşılaştırılması ve wildtype dizileri online web tabanlı araçlar (Şekil 2) kullanarak değerlendirmek.

2. klonlama ve AML-Cas9 hücrelerdeki sgRNAs iletim

  1. Orta-den geçerek sgRNAs klonlama
    1. 4-6 sgRNAs gene bir örümcek ağı-esaslı CRISPR tasarım yazılımı kullanarak ilgi için tasarım. Orada bir dizi CRISPR tasarım aracı kullanılabilir online sgRNA dizileri oluşturmak http://crispr.mit.edu/ bir giriş DNA sıralamasına dayanan gibi vardır.
      1. Yıldız işareti ile alanlara uygun bilgileri doldurun. Hedef genom sgRNA tasarım için tıklayın. Hedef sıra sıra kutusuna yapıştırın ve tıkırtı üstünde boyun eğmek düğme.
    2. PKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - klonlama için W sgRNA ifade plazmid, nükleotit "CACC" anlamda oligo ve ters çıkarılan antianlamlı oligo için "AAAC" siparişi vermeden önce önüne ekleyin. Premix sipariş anlam ve anti-anlamda oligos bir 96-şey plaka Oligo-Mix bir oligonükleotid sentez şirketten etiketli.
      Not: Biz yaptık pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - kullanımı sgRNA klonlama için BbsI kısıtlama sitenin W plazmid. -Dibi takdirde diğer sgRNA ifade plazmid kullanılır, sgRNA oligonucleotides için kullanılan çıkıntılar buna göre değiştirilmesi gerekebilir.
    3. Ayrı U alt 96-şey kalıp Tavlama plakaetiketli al. 1 µL ana bir karışımını yapmak T4 PNK, 10 T4 DNA ligasyonu arabellek x 1 µL ve reaksiyon tavlama başına su 6 µL.
    4. Ana karışımı 8 µL tavlama plaka her şey için ekleyin. 100 µM 1 µL, mantıklı ve antianlamlı oligo (veya karışık anlamda-anti-sense oligos 2 µL) ana karışıma ekleyin. 2-3 kez pipet yavaşça karıştırın için kısaca kuyu dibine karışımları almak için plaka spin.
    5. PCR makinede aşağıdaki tavlama programı kullanmak: 37 ° c, 2 dk 30 sn 95 ° C'de 30 dk takip tarafından yavaş soğutma-0,1 oranında 22 ° c ° C/s. Tavlama sonra Seyreltilmiş OligoMixetiketli taze bir 96-şey plaka almak. Bu plaka bir çok kanallı pipet kullanarak yukarıdaki tepki su (1: 200) ile gelen fosforile ve tavlanmış oligos sulandırmak.
    6. PKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - Özeti 5 µg BbsI Restriksiyon enzimi (10.000 adet/mL) 1,5 µL ile W vektör uygun bir arabellek 37 ° C'de 2 h için daha sonra ligasyonu linearize kullanarak.
    7. Tüp ligasyonu plaka etiketli bir taze 96 iyi tabak alıp 20 BbsI ng sindirilmiş pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W vektör istenen sgRNA tüp ligasyonu başına bir şey için. Bu, Seyreltilmiş OligoMix plaka fosforile, tavlanmış oligos 2 µL Ekle.
    8. 10 x T4 ligaz arabelleği 1 µL ve T4 DNA ligaz enzim 1 µL ekleyin. Yavaşça ile çok kanallı pipet pipet ve ligasyonu mix 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
      Not: Tüp ligasyonu karışımları daha sonra dönüştürme adımı için-20 ° C'de muhafaza edilebilir.
    9. Bu arada, kimyasal olarak yetkili E. coli tezcan 90 µL buz ligasyonu adım sonundan önce 10 dk hücreleri.
    10. Bir çok kanallı pipet kullanarak, yetkili hücre 10 µL aliquots ayrı 96 iyi kalıp her kuyuya olun.
    11. De yetkili hücreleri, pipet yukarı ve aşağı yavaşça içeren içine adım 2.1.8 ligasyonu karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
    12. Pipet 5 µL doğrudan bir 6 içine yukarıdaki reaksiyon gelen bakteri DNA Mix de plaka LB-agar 100 µg/mL ile ampisilin içeren. Her dönüşüm reaksiyonlar için yineleyin.
    13. Her dönüşüm reaksiyonu ayrı olarak etiketli içine de bir 6-şey plaka plaka. Yaklaşık 5-8 cam boncuk her şey ve bütün 6-şey plaka 8-10 kez dairesel hareketlerle salla ekleyin.
    14. Her şey bir steril 20 µL pipet ucu ile 1-2 tek kolonileri seçim ve LB agar ve 100 mg/mL ampisilin ile steril 10 cm Petri kabına üzerinde dikkatle etiketli bir nokta haline çizgi. LB plaka çizgiler sonra sadece alt tüp yuvarlak 14 mL içeren ortamda karşılık gelen bakteriyel klon numarası ile işaretlenmiş 3 mL LB-ampisilin clone çizgiler için kullanılan ucu dışarı atmak.
    15. Bakteriyel plaka doğrudan Sanger için göndermek insan U6 organizatörü ileri astar ile sıralama.
    16. Klonlanmış sgRNAs sıra onay sonra üreticinin yönergelerine göre Mini hazırlık seti kullanarak karşılık gelen 14 mL tüp DNA'dan arındırmak.
    17. Spektrofotometre ile konsantrasyon ve her biri mini preps kalitesini ölçmek. Her mini hazırlık'a 15 ng/µL ve pipet konsantrasyon sgRNA klonlar plakaetiketli bir 96 iyi tabak içine normalleştirmek.
      Not: Bu plaka-20 ° C'de depolanan veya doğrudan virüs hazırlık için kullanılan.
  2. SgRNA yapıları ve iletim viral imalatı
    1. 96-iyi biçimde sgRNA lentiviral parçacıklar üretimi için izleyin "shRNA/sgRNA/ORF yüksek üretilen iş Viral üretim (96 iyi)" Broad Enstitüsü genetik pertürbasyon platformu (GPP web Portal) iletişim kuralından (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/public/Resources/Protocols).
    2. Steril tüpler, viral süpernatant 200 µL aktarmak ve hemen-80 ° C'de dondurmak.
    3. Gün -1: bir düz dipli sigara-doku kültürü tedavi 96 iyi plaka ile 10 µg/mL BSL2 hücre kültür başlıklı bir konsantrasyon, rekombinant insan fibronektin parçasının 100 µL kat. Buharlaşma kaybı önlemek ve tezgah gece bırakın sarılmak wrap kullanarak plaka sarın.
    4. 0. gün: rekombinant insan fibronektin parçası her kuyudan çıkarın. Her sgRNA oda sıcaklığında viral süpernatant çözülme. Viral süpernatant ile 50 µL her tüp her iyi ve iletim levha kaplı ekleyin. İletim plaka 1.300 x g 35 ° C'de 90 dk için de spin
    5. Spinfection sonuna doğru kültür şişeye hücrelerden MOLM13-Cas9 (klon B3) saymak. Kuyuda 100 µL birim başına 10.000 hücreler kullanın. Ölü cilt göz önünde bulundurarak tüm iletim kuyuları için hücreleri saymak.
    6. 90 dk spinfection sonra 50 µL yavaş yavaş plaka eğerek ayarlanmış bir çok kanallı pipet kullanarak kuyulardan süpernatant kaldırın. MOLM13-Cas9 klon B3 hücre kültürünün 100 µL her şey yavaş yavaş aşağı belgili tanımlık kenar kayan için ekleyin.
    7. 1.300 x g 2 dk 35 ° C'de hücreler alt yerleşmek izin vermek için de plaka Döndür. Plaka da 37 ° C doku kültürü sınıf kuluçka aktarın.
    8. 1. gün: 100 µL taze orta de içeren her sgRNA için Cas9-MOLM13 transduced veya son Orta hacim 200 µL öyle ki Cas9-MLL-AF9 lösemi hücreleri ekleyin.

3. rekabetçi büyüme tahlil

  1. Gün 3: 72 saat (3 gün) iletim sonrası, akış sitometresi (FACS) tarafından her şey BFP pozitif hücreleri içeren sgRNA yüzdesini kontrol edin. Bir hücre canlılığı boya işaretlemek ve ölü hücreleri çözümleme dışı bırakmak için kullanın.
  2. Hücrelerin bir kısmı yeni kuyu taze orta ile aşırı büyüme sırasında tahlil önlemek için her FACS analiz sonra yeniden kaplama devam edin.
  3. FACS analiz 2-3 günde BFP pozitif (BFP + ve) hücreleri BFP negatif (BFP-ve) meslektaşları (Şekil 3) karşılaştırıldığında göreli oranı kontrol etmek için yineleyin. BFP pozitif hücrelerinin (FlowJo veya benzer FACS analiz yazılımı kullanarak) her zaman için yüzdesi analiz.
    1. FCS dosyaları her örnek için FlowJo yazılım için sürükleyin. Çift tıkırtı üstünde herhangi bir örnek eğe ve yan dağılım (SSC) FSC ile X ekseni ve SSC Y ekseninde vs ileri dağılım (FSC), bir nokta Leke arsa. Tüm hücreleri kapı.
    2. Geçitli hücreler üzerinde çift tıklayın ve onları canlılığı leke (Y ekseni) FSC yüksekliği (H) veya alan (A) nokta leke vs üzerinde arsa. Kapı canlılığı olumsuz (canlı) hücreleri leke.
    3. Çift Kapılı canlı hücreleri üzerinde tıklayın ve BFP (Y ekseni üzerinde) FSC (A) vs eksen çizmek. Kapı BFP + ve hücreleri. Bu kapılardan grubu sekmesi altında Tüm örnekleri için seçilen örnek sürükleyerek tüm örnekleri için geçerlidir.
    4. Tüm örneklerin Analizi tablo oluşturmak için Tablo Düzenleyicisi üzerinde tıklatın. BFP + ve sayısı bir örnek tabloya sürükleyin ve Bordro dökümü tüm örneklerinin BFP + ve hücreleri yüzdesini gösteren bir tablo oluşturmak için Tablo Düzenleyicisi'ni görüntüle düğmesini tıklayın. Tabloyu bir xls kaydedin.
  4. Orantılı artış hesaplamak veya % BFP pozitif hücreler zamanla canlı hücre nüfus içinde düşüş gösteren ve bu oran kontrol sgRNAs (örneğin, luciferase, şifreli veya GFP sgRNA) BFP pozitif hücrelerinin oranı karşılaştırın.
  5. 3. gün taban çizgisi olarak kullanarak denetimlerin yanı sıra, faiz, gene(s) de dahil olmak üzere farklı sgRNAs için BFP pozitif hücrelerinin oranını arsa.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim çalışmada, ilk MLL-AF9 translocation Cas9-blasticidin lentiviral plazmid kodlama yüksek titresi virüs taşıyan MOLM13 insan AML hücre kültürünü transduced. Elimizde, sıralanmamış MOLM13-Cas9 hücreleri yüksek düzey Cas9 ifade Western blot tarafından göstermedi ve aynı zamanda ne zaman de verimli gen için düzenleme yöntemi kullanılarak denenecektir gerçekleştirmedi toplu7daha önce açıklanan. Bu nedenle, tek hücre klonlar kurmak ve Western blot (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, biz aday genler akış sitometresi insan/antikorundan AML hücrelerinde (Şekil 5) kullanarak AML hücre hatlarında rolünü araştırmak için bir CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet büyüme tahlil yürütmek için detaylı bir protokol tanımlamak. Testin amacı iki ya da üç hafta boyunca bir orta-den geçerek ölçekte bakım gen silinmesiyle AML hücre çoğalması etkisini belirlemektir. Bazı kritik adımlar dikkatle açıklanan protokolünden yükseltme kolaylaştırmak için izlenmesi gereken. Cas9 lentivirus üret...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.D A2A ilaç (New Jersey) ve Salgomed tedavi (San Diego) için bir danışmandır. Diğer yazarların herhangi bir çakışma olmadığını bildirmek için vardır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCW-Cas9 plazmid Eric Lander & David Sabatini (Addgene plazmid # 50661) ve pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - hediyesiydi W plazmid Yusa laboratuarından (Addgene plazmid #67974. Akış Sitometresi çekirdek SBP tıbbi Discovery Enstitüsü'nde akışı analizi ve sıralama ile zamanında yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bayan Tata Anıtı Vakfı A.D. için destek kabul etmek istiyoruz Ayrıca aşağıdaki finansman kaynakları destek kabul etmek istiyoruz: NIH/ncı P30 CA030199 Kanser Merkezi Grant sponsorluğunda, V-Vakfı ve San Diego ncı kanser merkezleri (C3) #PTC2017to A.J.D.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BAYRAK-M2 Antikorsigma-aldrichF3165, lot # SLBS3530V
Anti-fare AntikoruInvitrogen31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maksimum Hassasiyet SubstratıThermo Fisher34095
ChemiDoc Görüntüleme SistemiBIO RAD17001401
Sorvall Legend RT santrifüjThermo Scientific
BlasticidinThermo FisherR21001
SYTOX KırmızıTermo BalıkçıS34859
Opti-MEMTermo Balıkçı31985062
DMEMTermo Balıkçı11965-092
RPMITermo Balıkçı11875-093
Penisilin-StreptomisinTermo Balıkçı15140122
L-Glutamin (200 mM)Thermo Fisher25030081
Fetal Sığır Serumu (FBS)SAFC12303C
tek gRNA vektörüAddgene #67974pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nükleer ekstraksiyon kitisigma-alorichNXTRACT
XtremeGENE 9sigma-alorich6365787001
RetronectinTakaraT100B
Akış sitometresiBD Biosciences
T4 PNKNEBioLabsM0201S
T4 DNA ligasyon tamponuNEBioLabsB0202S
T4 DNA Ligaz enzimiNEBioLabsM0202S
AmpisilinFisher bilimselBP1760-25
LB agarFisher scientificBP9724-500
LB Et suyuFisher scientificBP9731-500
Qiagen mini hazırlık kitiQiagen27104
NanoDrop SpektrofotometreThermo FisherNanoDrop Bir
Rekombinant Murin IL-3Peprotech213-13
Rekombinant Murin IL-6Peprotech216-16
Rekombinant Murin M-CSFPeprotech315-02
Kararlı yetkin hücrelerNEBiolabsC3040I
10 cm Doku Kültürü kaplarıFisher Scientific353003
Hücre lizis çözeltisiQiagen158906
Protein çökeltme çözeltisiQiagen158910
DNA hidrasyon çözeltisiQiagen158914
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28704
BbSINew England BioLabsR0539S
APEX 2.0x Taq Kırmızı Master KarışımKiti Genessee Scientific42-138
PuromycinFisher scientificBP2956100
50 mL polipropilen konik tüplerFisher scientific1495949A
15 mL polipropilen konik borularFisher scientific1495970C

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  3. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  4. Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
  5. Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
  6. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  7. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  8. Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).
  9. Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
  10. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
  11. Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
  12. Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
  13. Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
  14. Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
  15. Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
  16. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  17. Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CRISPR Cas9Flow CytometryCompetition AssayGene KnockoutAML Cell LinesSingle Guide RNALentiviral TransductionBFP Positive CellsFlow Cytometry AnalysisGenetic Dependencies

İlgili makaleler