Method Article

Çoğaltılmış floresan immunohistokimyasal boyama, görüntüleme ve analiz lenfoma histolojik örneklerinde

DOI:

10.3791/58711

⸱

January 9th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, AnSteel Group General Hospital, 2Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore, 3Department of Pathology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 4Department of Haematology-Oncology, National University Health System

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tarif biz multiplex floresan immunohistokimyasal boyama ve lenfoma içinde birden fazla kanser ilişkili antijenleri eş zamanlı yerelleştirme için görüntüleme için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı tüm doku bölümleri içinde biyolojik colocalization analizine genişletilebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmunohistokimyasal (IHC) yöntemleri protein ifade tarafından ışık mikroskobu in-situ analizi için araştırma ve teşhis amaçlı güçlü bir araç vardır. Ancak, görselleştirme ve miktar geleneksel chromogenic IHC kullanarak bir tek doku bölümünde birden çok antijenleri zorlu. Çoğaltılmış görüntü burada işaretleri karmaşık tümör microenvironment bağlamında yorumlanmalıdır lenfoma araştırma ve teşhis, özellikle alakalı olduğunu. Burada bir iletişim kuralı için birden çok hedef belirli hücre türleri lenfoma ilgi kantitatif değerlendirilmesi etkinleştirmek için boyama çoğaltılmış floresan IHC açıklar. Yöntem sunumunun antikor doğrulama, antikor optimizasyonu, lenfoma alt türlerinden işaretçileri olan optimizasyon multiplex, boyama doku Mikroarray (TMA) slayt ve slayt, tarama veri analizi, özel ile takip Lenfoma için başvuru. Bu yöntemi kullanarak, bir işaretleyici faiz ve yüzde pozitif her iki ortalama yoğunluğu için bir puan daha fazla Nicel analiz kolaylaştırmak için oluşturulur. Çoğullama örnek kullanımını en aza indirir ve ilgi her işaretçi için mekansal bilgi sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lenfoid neoplazmlar lenfositler tarafından malign kontrolsüz çoğalması kaynaklanır. Bu hücreler bağışıklık sisteminin önemli bileşenleri ve kemik iliği, lenf düğümleri, dalak ve diğer mukoza ilişkili lenfoid sistemi gibi birincil ve ikincil bağışıklık organlara localize. Lenfoid neoplazmlar morfoloji, immunophenotype, genetik özellikleri ve klinik sunum dahil olmak üzere özellikleri, bir takımyıldızı üzerinde göre sınıflandırılır bozuklukları heterojen bir grup vardır. Her parametre bir rol oynar, lineage bir belirleyici özelliği, kalır ve B hücreleri, T hücreleri ve doğal öldürücü (NK) hücreleri1elde neoplazmlar tanıyan WHO sınıflandırma sistemi temelini oluşturur.

Anahtar lenfoma sınıflandırılması için lökosit yüzey işaretleyicileri lenfositler2çeşitli alt türlerinden karşı antikor karakterizasyonu olmuştur. İmmünhistokimya (IHC) geleneksel olarak böyle işaretleri analiz için kullanılan ve ışık mikroskobu görüntülenmiştir hücre ve doku esaslı molekülleri algılamak için spesifik antijen-antikor tanıma prensibi temel alır 3. ancak, genellikle birden çok renk sinyalleri bir tek doku bölümünde güvenilir bir şekilde ayırt etmek zor olduğu için geleneksel alan parlak chromogenic multiplex IHC tarafından tek bir slayda birden çok hedef tanımlaması sınırlamaları vardır — özellikle bir çok düşük ifade4ile antijenleri için. Görsel değerlendirme ve boyama miktar da öznel, analiz ve veri yorumu5' te değişkenlik neden olabilir.

Bu nedenle, geleneksel IHC formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) örnekleri üzerinde aynı anda birden çok hedef lenfoma gibi immunologically çeşitli hastalıklarda tespiti için mümkün değildir. Ayrıca, çevredeki bağışıklık hücreleri neoplastik lenfositler ayırt kez imprecise. Bu lenfoma roman biyolojik alaka bakarak çalışmaları engeller. Bu bağlamda, multiplex floresan IHC (mf-IHC) antijen coexpression nicel bir değerlendirme sağlar ve mekansal ilişki sınırlı korunması ise daha yüksek hassasiyet ile6,örnekleri olarak umut verici bir alternatif sunuyor7. Bu görüntüleme teknolojisi dijital görüntü analiz yazılımı ile ortaklık, veri yorumu daha verimli hale ve tümör ve microenvironment heterojenlik8,9çalışma kolaylaştırır. Bu iletişim kuralı yöntemi çoğullama tyramide tabanlı bir ayirt (Eğer) sinyali yükseltmek için uygulanır ve herhangi bir IHC doğrulanmış antikor türlerden herhangi bir ana bilgisayar, hatta aynı tür5,7 ' geliştirilen ile uyumludur , 10. tyramide tabanlı iletişim kuralı için fluorophore faiz dokuya doğrudan konjugasyon sağlar, böylece birden fazla lekeleri sıralı uygulama için izin önce her defasında, birincil ve ikincil antikor elimden antikor olan.

Çoğaltılmış bir strateji lenfomalarin bazilarinin varyant onların immünolojik desenleri ve hedefler belirleyerek teşhis ve tedavi sonuçları tahmin için faydalı olacaktır. Multiplex floresan IHC T ve B lenfosit işaretleri ve angioimmunoblastic T-Hücre Lenfomasi (AITL), T-foliküler yardımcı işaretleyicilerini bir panel incelenmesi için bizim laboratuvarında uygulanan alt türü olan periferik T Hücre Lenfomasi karakterize agresif tarafından klinik davranış ve tümör heterojenite11. Belgili tanımlık yarar bu yöntemin de nerede bir B-hücre reseptör eşzamanlı C-MYC ve BCL-2 ifadesi ile artan sinyal Bruton'ın Tirozin kinaz inhibisyon potansiyel terapötik kullanım öneriyor diffüz büyük B hücreli lenfoma içinde (DLBCL) resimli 12 .

Burada tüm antikor doğrulama kuralından seçime uygun denetim dokuların açıklamak ve lenfoma FFPE kullanarak çoğullama kurcalayarak lekeli slaytlar bir tarama kullanarak nihai bir analizini otomatik nicel patoloji görüntüleme sistem.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için kullanılan tüm dokularda Singapur NHG etki alanı belirli İnceleme Kurulu B altında elde edilmiştir 2014/00693 çalışma.

1. seçimi ve doğrulama antikorların

Not: herhangi bir çoğaltılmış paneli kurulması ile devam etmeden önce tüm antikorlar sağlam, yalnızca hedef antijen ilgi tanımlayan leke emin olun. Amacı özellikle doku bölümleri ilgi antijen tanıdınız antikorlar seçmektir.

  1. Pozitif ve negatif kontrol doku üzerinde geleneksel IHC5,13 gerçekleştirerek epitope alma ve antikor seyreltme gibi koşullar köklü araştırma kullanım veya IHC rutin klinik kullanımda olan bir antikor için onaylamak bölümler. İçin doku bölümleri insan kaynaklı uygun etik izinleri deneyler başlatmadan önce yerinde olduğundan emin olun.
    Not: Antijen ilgi ifade etmek için beklenen doku olumlu denetimleridir ve negatif denetimleri yapmak değil bunlar. Bağışıklık hücreleri B hücreleri de dahil olmak üzere, T hücreleri ve antijen sunan hücreler yanı sıra stromal ve epitel hücreleri karışımı içerdiğinden iyi huylu bademcik doku Lenfoma antijenleri için iyi doku denetimi olarak seçilir. İkinci yararlı negatif iç kontrol hizmet vermektedir.
  2. Bilinmeyen hedef için veya yetersiz yayımlanan veri ile ticari antikorlar, antikor doğrulama eşleşen pozitif oluşturarak gerçekleştirir ve negatif kontrol FFPE hücre blok14CRISPR knock-out veya siRNA kullanarak, knock-down antijen ilgi bir uygun hücre kültürünü standart moleküler biyoloji teknikleri ile. Bu FFPE hücre bloklar pozitif ve negatif kontrol dokular yerine göre adım 1.1 geleneksel IHC için kullanın.
    Not: HeLa veya 293T hücre hücre türü olmayan antijenleri için yaygın olarak kullanılan belirli, lenfoma hücre hatları transfect zor olduğu gibi. Lenfosit belirli olan antijenler lenfoma hücre hatları viral iletim veya Elektroporasyon ile gen teslim modu olarak (düşük etkinlik de olsa) kullanılabilir.

2. çok katmanlı masası için antikorlar ve Fluorophores sırası planlama

  1. Reaktifler son multiplex boyama için sırasını planlayın. Örneğin, burada çoklu iletişim kuralı sırasını başlangıçta olarak ilk, Bcl-6 planlandı; İkinci, Bcl-2; Üçüncüsü, C-Myc; Dördüncü, CD20; Beşinci, Ki67.
    Not: sıra üzerinde karar vermek için daha yüksek konsantrasyonlarda gerektiren bir zayıf benzeşimli antikorlar ilk son multiplex boyama lekeli. Mikrodalga sıyırma birden fazla mermi için dayanıklı olma olasılığı yüksek afinite antikorlar son nonspesifik boyama önlemek için çoklu protokol uygulanır.
  2. Masası'nda fluorophore ortak her antikor için planlıyoruz. Tablo 1 ve Tablo reçetesi seçimler bu örnekte bakın.
    Not: her antikor fluorophore ortak karar karşı antikorlar in localization-hücre ve doku benzer modeller ile hayalice ayrı fluorophores seçin. Bu spektral örtüşme ve zorluk unmixing ile en aza indirmek olacaktır.

3. Monoplex Tyramide-esaslı bir benzetim yapılmış 5-plex Multiplex Panel Eğer

Not: Bu örnekte, CD20 için iletişim kuralı, çok katmanlı bir sıra yukarıda açıklanan dördüncü antikor olarak planlanan ele alınmıştır. Ek sıyırma adım sayısını antikor bulunduğu sıra için farklı olacaktır.

  1. 3 µm ince bir microtome kullanarak pozitif ve negatif kontrol doku bölümlerini keser ve bölümleri mikroskop poli-L-lizin-kaplı cam slaytlar üzerine yerleştirir.
  2. Bir uygun takas çözüm 3 kullanma bölümlerine dewax x 4 dk için. %100 alkol, % 90 alkol ve % 70 alkol, 4 dk slaytları rehydrate. Slaytları 2-3 dakika için distile su koyun.
  3. Slaytları slaytlar sokmak için bir standart antijen alma arabellek (ticari olarak mevcut) mikrodalga güvenli cam kavanoza yerleştirin. Isı kaynaklı epitope alma (HIER) uygun bir mikrodalga pH9 antijen alma çözümü için 25 dk 98 ° C'de kullanarak gerçekleştirin.
    Not: Herhangi bir mikrodalga 800-1100 watt arasında değişen bir basınç ile kullanılabilir ve HIER buna göre optimize edilebilir. Bu durumda, bir çok fonksiyonlu mikrodalga doku işlemci (açık) HIER ve sıyırma için kullanıldı. Başlangıç ayarları belirli bir epitope alımı için geleneksel IHC üzerinden ön bilgi temel alır.
  4. Gerçekleştirin (Bu durumda, bir panel dördüncü antikor için üç) mikrodalga sıyırma ek Tur, her turda % 100 güç 98 ° c ve % 20 güç aynı sıcaklıkta korumak için 10 dakika için. En az 10 dk için distile su slaytları sakin.
    Not: mikrodalga adımları olduğu gibi önerilen multiplex Isıtma aynı sayısını için hedef antijen ortaya çıkarmak için monoplex Eğer adım sırasında sıyırma birden çok tur gerçekleştirmek. Bu yana CD20 dördüncü antikor planlanan, daha önce 3 x ve birincil antikor kuluçka yaptıktan sonra bir kez sıyırma mikrodalga.
  5. Kontrol ve ek mikrodalga sıyırma sırasında her 5 dk sonra arabellek doldurmak. Önemlisi, slaytlar birden çok sıyırma işlemler sırasında kurumasına izin vermeyin. Mikrodalgada slaytlar çekerken, distile su ayrı kavanoza koyup için forseps ve ısıya dayanıklı eldiven kullanın. Doğal olarak soğutmak antijen alma çözüm için bekleyin.
  6. 10 dakikadır bir ticari peroksidaz blok kullanarak doku peroksidaz aktivitesi engelleyin (%3 hidrojen peroksit alternatif bir reaktif kullanılabilir). Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) ve 5 min için Noniyonik deterjan ile yıkayın.
    Not: TBS 50 mM Tris-Cl, pH 7.5 ve 150 mM TBS-ö. yapmak NaCl.TBS oluşur
  7. Blok ile antikor eritici veya sığır serum albümin faiz birincil antikor ile kuluçka tarafından takip 15dk için (Örneğin, CD20 antikor seyreltici, 1:2,000 seyreltme bkz: Malzemeler tablo), oda sıcaklığında 30 dakika süreyle 3 x ile yıkayın TBS-D tampon 5 min her zaman için. Tamamen tüm çamaşır adımda slayt sokmak için yeterli TBS-D tampon olmalıdır.
    Not: Alternatif antikor seyreltici Sığır serum albümin kullanılabilir. Antikor seyreltici hacmi (için eksizyon örnekleri veya doku Mikroarray örnekleri) 400 µL için 50 µL (için biyopsi örnekleri) arasında değişen doku boyutunu bağlıdır.
  8. Bir uygun horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-15 dakika oda sıcaklığında birincil antikor kökeni tür olarak seçilen etiketli ikincil antikor. 3 x 5 min için TBS-D tampon ile her zaman yıkama.
  9. Bir uygun tyramide tabanlı floresan reaktif (1: 100, amplifikasyon Dilüent) uygulamak ve birincil antikor bağlama fluorophore konjugasyon sitelerde doku örneği için izin vermek için oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. 3 x 5 min için TBS-D tampon ile her zaman yıkama.
  10. Bir ek mikrodalga tabanlı birincil ve ikincil antikor kaldırmak için sıyırma gerçekleştirin. Gerektiği gibi sıra antikor konumunu temel alan yineleyin.
  11. Slayt soğumasını distile su koyun. 10 dk yıkama tarafından takip, DAPI (antikor Dilüent 1: 100 seyreltme) ile kuluçkaya 3 x 5 dk her zaman için TBS-D tampon ile. Mendil dokuyla olmadan slayttaki alanı kuru ve uygun montaj medya ile slayt monte.
  12. Slayt resim (6 ve 7 Bu protokol bölümlerine bakın) ve (pozitif ve negatif kontrol doku açık ayrımcılık tarafından tanımlandığı şekilde) boyama uygunluğunu belirlemek.
    Not: boyama desen doğru değilse, aşağıdakilerden birini veya birkaçını aşağıdaki parametreleri ayarladıktan sonra boyama monoplex Yinele: ısı alma sayısı adımlar, ısı alma, kuluçka dönemi/konsantrasyon antikor miktarı (birincil ve ikincil), sıra ve seçtiğiniz fluorophore bir antikor konumunu. Adım genellikle boyama monoplex uygun boyama için parametreleri uygun bir dizi elde etmek için en iyi duruma getirme birden fazla mermi gerektirir. Bu son multiplex set karar esnekliği sağlayacaktır gibi fluorophores her birincil antikor ile bir dizi test tavsiye edilir.

4. her antikor Multiplex protokolündeki için Monoplex tekrarı

  1. Antikor bulunduğu sıra temel adımları, sıyırma mikrodalga sayısını ayarlayarak diğer antikorları için benzer bir şekilde boyama monoplex tekrarlayın. Örneğin, monoplex için bir altı-plex çok katmanlı Masası'ndaki üçüncü antikor boyama işlemi sırasında iki mikrodalga sıyırma önce ve üç mikrodalga sıyırma adımlar birincil antikor kuluçka sonra gerçekleştirin.
    Not: Mikrodalga tabanlı sıra sıyırma de HIER örneğe sunar takdir etmek önemlidir. Spesifik bir antikor farklı epitope alma stratejisi gerektiriyorsa, bu multiplex sırasını planlarken dikkate alınması gerekir. Bu örnekte, Ki67 epitope alma için 30 dk pH 9, gerektirir. HIER 25 dk önce yapılır beri ihtiyaç KI67 sıralı protokolü, HIER ilave bir 5 dak'ya boyama vardır.

5. multiplex Protokolü boyama

Not: sadece tüm bileşenleri boyama monoplex kullanarak optimize edilmiştir sonra protokol boyama multiplex ile devam edin. Multiplex ve fluorophore her antikor için seçim sipariş nihai düzeni gösteren bir tablo tasarım ve monoplex boyama sonuçları gözden geçirin. Antikor konsantrasyon ayrıntılarını, boyama ve sıra süresi ve doğa ısı alma burada kullanılan her antikor için Tablo 1' de sağlanır.

  1. Kesme 3 µm ince bölümlerini pozitif ve negatif kontrol doku, de faiz (burada, FFPE örnekleri lenfoma) hedef doku bir microtome kullanarak ve bölümleri ( Tablo malzemelerigörmek) mikroskop poli-L-lizin-kaplı cam slaytlarda yerleştirin.
    Not: Pozitif ve negatif kontrol panelinde her antikor için eklenmesi ile birlikte gerçek örnekler multiplex için tavsiye edilir. Bu boyama iletişim kuralı doğru şekilde gerçekleştirildiğini onay için sağlar.
  2. Dewax, ısı kaynaklı epitope alma (HIER) yapmak ve doku peroksidaz aktivitesi olduğu gibi monoplex Protokolü adımları 3.3-3.5 blok.
  3. Daha önce monoplex Eğer adım kullanarak kararlı en iyi duruma getirilmiş multiplex sıra ilk birincil antikor ile kuluçkaya. Bu örnekte, BCL-6, saat 1:30 seyreltme antikor Dilüent 60 dk için oda sıcaklığında (bakınız Tablo malzemeler), multiplex Protokolü'nün ilk adımdı. TBS-D tampon 5 dakika yıkayın.
  4. Belgili tanımlık önce kullanılan birincil antikor türü üzerinde dayalı bir uygun HRP etiketli ikincil antikor ile kuluçkaya 5 min için TBS-D tampon ile 10 dk. Yıkama için oda sıcaklığında ( Tablo malzemelerigörmek) adım.
  5. (Bu örnekte, 1: 100 amplifikasyon seyreltici içinde Cy5 bkz: Malzemeler tablo) en iyi duruma getirilmiş tyramide tabanlı floresan reaktifi ile kuluçka, oda sıcaklığında 5 min için geçerlidir. TBS-D tampon 5 min için kuluçka sonra yıkayın.
    Not: Eğer en iyi duruma getirilmiş monoplex tyramide tabanlı floresan reaktif seçtiğiniz bağlıdır.
  6. Uygun bir mikroskop kullanarak ilk antikor boyama verimliliğini kontrol edin (bkz. Tablo malzeme).
    Not: örnek bir TMA veya tek slayt ise çekleri Imaging geçici kolaylıkla yapılabilir. Ancak, leke birden çok slaytta gerçekleştiriliyorsa, bu pratik olabilir ve bu adımı ihmal.
  7. Koşullar monoplex adımda optimize kullanarak iletişim kuralı ' İkinci antikor için mikrodalga sıyırma gerçekleştirin. Daha sonra ikinci birincil antikor boyama ile devam edin (burada, BCL2) ikincil antikor HRP etiketli ve floresan reaktif tyramide tabanlı (520, bak, Malzemeler tablo). Floresan mikroskop altında boyama ikinci tur tamamlandıktan sonra boyama verimliliğini kontrol edin.
  8. Benzer şekilde, üçüncü kullanma yordamı yineleyin sırada dördüncü ve beşinci antikorları (burada, c-Myc, CD20 ve ki67, sırasıyla, ile fluorophores 570, 540 ve 620, sırasıyla). Mümkünse her adım arasında görüntüleme denetimleri gerçekleştirmek.
  9. 10 dk için nükleer counterstain (DAPI, antikor Dilüent 1: 100 seyreltme) ekleyin ve sonra 2 x 5 dakika her TBS-D içinde yıkayın.
  10. Bir uygun montaj reaktif kullanarak slaytları bağlayın.

6. spektral Kütüphane slaytların hazırlanması

Not: Bölüm 6-8 Bu protokol bir spektral kamera ile görüntülü çoğaltılmış deneyler için benzersizdir.

  1. Kitaplık slaytları (tek-leke başvuru Images) her fluorophore, DAPI ve autofluorescence için spektral görüntü analizi için kullanılmak üzere aynı denetim doku oluşturmak.
    1. 2 x 3 µm ince bölümlerini faiz (burada, lenfoma örnek veya bir bademcik denetimi olarak) doku türü kesin bir microtome kullanarak ve bölümleri mikroskop poli-L-lizin-kaplı cam slaytlar üzerine yerleştirin.
    2. Her iki işlem slaytlar (tüm sıyırma ve adımları yıkama ile), monoplex protokolünü kullanarak ama antikor veya fluorophore ek olmadan.
    3. Adım 5,9 göre DAPI ile bir slayt leke ve (doku autofluorescence spektrum üretimi için) günahı bir slayttan ayrılmasını.
      Not: En iyi duruma getirilmiş monoplex slaytlar (ile DAPI olmadan bir tek floresans boya) spektral kitaplığı slayt her floresans boya spectra oluşturmak için kullanılabilir.
  2. Bu dizi uygun filtreleri kullanarak slaytları tarama ve görüntü analiz kitaplığa yükleyin.

7. spektral görüntüleme

  1. Monoplex slaytları tarama
    1. Filtreleri kullanılabilir standart epi-floresan filtreler (DAPI, FITC, CY3, Texas kırmızı ve CY5) istihdam fluorophore için uygun seçim.
      Not: Bu örnekte kullanılan belirli fluorophores için önerilen filtre küpleri Tablo 215dakika içinde gösterilir.
    2. Temiz bir sinyal almak için uygun pozlama süresi belirlemek için karşılık gelen floresans kanal bulunan her işareti inceleyin. En güçlü sinyali için işaretçiyi yiyecektik doku bileşen odaklanmak.
    3. Sabit pozlama süresi (antikor-fluorophore birlikte), her analit için (ticari bazı platformlar için pozlama farklılıkları hesap normalleştirme stratejileri olsa) piksel yoğunluğu karşılaştırılması çapraz-örnek izin vermek için belirleyin.
      1. Verilen bir kanal için bir sabit pozlama süresi üzerine karar vermek, bir canlı kamera ayarı canlı kamera görüntüsü yok pozlanmış alanlara kadar çekim hızı ayarlamak için kullanın ve bulunan tüm kanallar için bu işlemi yineleyin.
    4. (İşlev kullanılan yazılım varsa) monoplex slaytlar taramadan sonra benzetimli aydınlık alan görüntüler oluşturmak görsel olarak normal IHC desen ile Karşılaştırılacak ve boyama desen doğru (resim 1 ve Şekil 2 olup olmadığını belirlemek için ).
  2. Çoklu örnekleri tarama (TMA slaytlar / birden fazla örnekleri)
    1. Optik parametreleri monoplex görüntüleri (adım 6.1) taramak için açıklandığı gibi ayarlayın. İlk olarak, el ile veya otomatik olarak odak ayarlamak (makine tarama belirli görüntü yönergeleri izleyin). İkinci olarak, çekim hızı üzerinde bir TMA tüm çekirdeği veya slayt üzerindeki tüm alanları uygun şekilde maruz sağlamak floresan her kanal için ayarlayın.
      Not: çekim hızı ayarlamak için seçili alanı önemlidir. Kullanıcılar her filtre için en güçlü sinyali bölgesi seçmeniz gerekir (yani, Ki67 sinyal daha güçlü nongerminal merkezi bölgede bademcik germinal Merkez Bölgesi, bu nedenle, kullanıcılar uygun bir pozu ayarlamak germinal Merkez Bölge kullanmanız gerekir zaman). Kullanıcılar aynı zamanda bir oversaturation düzeltme işlevi varsa görüntüleme sisteminin kabul edebilirsiniz.
    2. TMA slaytları bir TMA tarama modu varsa uygun otofokus algoritması ile görüntüleme sistemi altında inceden inceye gözden geçirmek.
    3. Bütün doku bölümü slaytları için en iyi temsil eden tümör alanlarından en iyi görüntüleri seçmek için nitelikli bir patolog tarafından gözden slaytlar almak.
      Not: burada açıklanan protokolü üzerinde tanımlanmış mikroskop/görüntü analiz sistemi dayanır ( Tablo malzemelerigörmek). Diğer makineleri ve inceden inceye gözden geçirmek ve çözümlemek multiplex IHC slayt7görüntü analiz yazılımı vardır.

8. veri analizi

  1. Preanalysis değerlendirme ve planlama
    1. Başvuru slayt autofluorescence için autofluorescence analiz için taranmış görüntüleri dan çıkarmak için kullanın.
    2. Odaktaki olduklarından emin olmak için analiz öncesi ve eserler boyama olmadan resimleri gözden geçirin.
    3. Bir tümör marker (Örneğin, bu örnekte CD20) ilgi hücrelerini tanımlamak için kullanın ve hücre segmentasyon, Puanlama ve toplu iş çözümlemesi ile devam etmek için yaklaşımlar. Analizi için CD20 pozitif hücreleri seçin.
      Not: Örneğin, DLBCL örnekleri, hücre segmentasyon nükleer boyut üzerinde temel alır ve yoğunluk ama kullanılan görüntü analiz yazılımı belirli için tanımlanan parametreleri ve ayar analiz (Örneğin, bir DAPI demek, piksel yoğunluğu En azından 0,05; 2 yarma bir hassasiyetle 80-320 piksel arasında boyut [ağır tümör morfolojisi dayanmaktadır bir yazılım özel parametre budur: küçük tümör hücreleri, bölme için 0.7 - 1 uygundur; büyük tümör hücreleri için bölme kadar ayarlanabilir 4]).
    4. Tek tek görüntüleri gözden geçirmek ve doku segmentasyon tümör hücre zenginleştirilmiş bölgeleri seçin veya bölgeleri nekroz arearegion orand bol reaktif hücreleri ile çıkartmak için gerekli olup olmadığına karar vermek nitelikli patolog talebi. Ek doku segmentasyon gerekiyorsa, sonra uygun denetim bölgeleri (gibi tümör hücreleri/stroma/nekroz) seçin ve görüntü analiz yazılımı düzgün gibi bölgelerden tanımlayabilir kontrol edin
    5. Hücre segmentasyon doku bölümleme (varsa) sonra devam etmek isteği amaçlanan ayrılmasını kalitesini sağlamak için hücre bölümleme harita gözden geçirmek için nitelikli bir patolog yaklaşım5.
    6. En biyolojik/klinik için uygun olan yöntemi analiz belirli bir biyomarker ilgi (Örneğin, yüzde pozitif veya hücre başına ortalama yoğunluğu) belirlemek.
    7. Her işaretçisi (için yüzde pozitifliği) için cut-off değeri seçin.
    8. Optik yoğunluk olumlu cut-off değeri birlikte her işaretçi için bir patolog ile belirlemek. Frekans dağılımı marker yoğunluk/hücre içinde uygun istatistik yazılım analiz ederek çubuk grafikler oluşturmak ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: Bir yoğunluk değeri histogram sinyal yoğunluklarını dağıtım genel bir bakış sunar.
    9. Histogram üzerinden yaklaşık bir kesme belirlemek ve bu seçilen görüntüler üzerinde el ile kararlı kesintileri ile ilişkilendirmek için bir patolog inceleme ile doğrulayın. Bazı durumlarda, tek tip bir tek kesme boyama içinde değişkenlik nedeniyle mümkün olmayacak ve her örnek için bir el ile kesme değer-ecek var olmak gerekli.
      Not: Bölüm 8.1 görüntü analiz yazılımı içinde yapılmalıdır ( Tablo malzemelerigörmek) Aksi belirtilmediği sürece.
  2. Pozitif ve negatif hücreleri işaretleme
    1. Her işaretçisi ilgi (çubuk grafikler yoluyla veya el ile) belirlenmesi, kesme numarasına göre bir "IF" kullanın veya benzer mantığı formülü ile pozitif ve negatif hücreleri işaretlemek için işaretlenmiş değeri: numara 1 pozitif hücreler için numara 0 negatif hücreler için.
    2. Tüm işaretleri pozitif için her işaretçisi (ya 1 ya da 0) ayrı sütunlarda ürünleri ile işaretli değerini çarpın. Ürün 1 eşitse hücre tüm işaretler için olumlu olduğunu anlamına gelir. Pozitif ve negatif belirli bir işaretçi için bir If mantığı algoritma kullanıyoruz.
      Not: Bölüm 8.2 istatistikleri yazılımda yapılması gerekmektedir ( Tablo malzemelerigörmek).
  3. Yüzde ve sayısal verileri bir Özet Tablo kullanılarak oluşturuluyor
    1. Tanımlanan hücreleri (Örneğin, CD20 pozitif hücre veya hücreler CD20 negatif) içinde ilgi belirli işaretçileri için yüzde verileri oluşturmak (Şekil 6).
    2. Özet Tablo veri sayfasına ekler.
    3. CD20 gibi tek bir işaretleyici pozitifliği yüzdesini hesaplamak için topla işlevini CD20 pozitif hücreler CD20 toplamını kullanarak toplam sayısını saymak için Özet Tablo değer bölümü altında seçin+ hücreleri bölünmüş tarafından Toplam hücre sayısı. CD20 sonucudur+ hücre yüzdesi bir çekirdek veya bir çalışma numarası (Özet Tablo satırının seçime bağlıdır).
    4. Birden çok işaretçileri (Şekil 3). aynı yöntemle pozitifliği yüzdesini hesaplamak
    5. Sayısal veri oluşturmak. Her bir çekirdek veya her çalışma numarası her işaretçi için medyan normalleştirilmiş sayısı her işaret bir örnek (Şekil 4) içinde okudu tüm hücreleri ilgi ortalama yoğunluğu alarak ayıklayın.
      Not: Ortanca değer doğrudan Özet Tablo türetilemez. Bu formülü kullanarak elde edilebilir: medyan (IF (çalışma numarasının sütununu belirli çalışma numarası, normalleştirilmiş bir değer sütun =)).
  4. Verileri uygun bir grafik olarak çizme
    1. Sonuçları yüzde pozitif veya daha fazla istatistik test ve sunum için uygun bir şekilde ilgi bir hücreye işaretleyici başına ortalama yoğunluğu arsa.
    2. Bir görsel öğe numaraları ve dağıtım sağlamak için nokta araziler oluşturun.
      Not: veri çubuk grafiği ile temsil eden dağıtımı hakkında bilgi iletmek değil. Tahmini araziler de örnekleri16arasındaki fark büyüklüğü üzerinde durularak veri gösterimi için iyi bir yöntem olarak önerilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MF-IHC görüntüler için C-MYC ve BCL2 gen düzenlenmesi (çift-hit lenfoma) ile DLBCL örnek Şekil 1' de gösterilmektedir. Şekil 2 simüle alan parlak immunohistokimyasal görüntüleri gösterir. Şekil 3 yüzde veri nesil gösterir. Şekil 4 nesil sayısal veri için Ortalama bir formül ayrıntılarını görüntüler. Şekil 5 angioimmunoblastic T hücre lenfoma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MF-IHC patologlar diagnosticcriteria içinde lenfoid patoloji rafine ve biyolojik belirli hücre tiplerinin klinik sonuç bir tahmin doğru olarak rolü çözümlemek için etkinleştirmek için potansiyele sahiptir. Yeni bir araştırma yöntemi olarak mf-IHC giderek tümör hücreleri17birden çok bağışıklık parametre nicel ve mekansal tanımlaması uygulanır. Mf-IHC tümör biyolojik ortak bir ifade için algılama tekrarlanabilir ve güvenilir5olmak gösterilmiştir. Ancak, teknoloji doğmakta ola...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.D.J. PerkinElmer seyahat doğru Kullanıcı grubu toplantılarına fon aldı. Yazarlar hiçbir diğer ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.-B.N. ve A.D.J. Singapur Sağlık Bakanlığı'nın Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi geçiş ödüller tarafından (NMRC/TA/0020/2013 ve NMRC/TA/0052/2016) desteklenir. Yazarlar bir Yong Siew Yoon araştırma hibe Singapur Ulusal Üniversitesi Kanser Enstitüsü Vectra spektral görüntüleme mikroskop satın doğru gelen A.D.J. için kabul. Bu çalışmada Singapur NHG etki alanı belirli İnceleme Kurulu B tarafından onaylanmıştır (2014/00693).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antikor seyrelticiDAKOREF S3022Bloke Edici
Peroksidaz Bloke Edici ÇözeltiDAKOS2023Peroksit bloke edici
Vectra multispektral otomatik mikroskopPerkin ElmerVectra2.0.8Spektral görüntüleme
mutlak EtanolEMSURE1.00983.2500Rehidrasyon için etil alkol
Amplifikasyon SeyrelticiPERKIN ELMERFP1135Florofor seyreltici tampon
Anti-Fare IgG [Keçi] HRP-EtiketliPERKIN ELMERNEF822001EAİkincil antikor
Anti-Tavşan IgG [Keçi] HRP-EtiketliPERKIN ELMERNEF812001EAİkincil antikor
BCL2DAKOklonu 124 (Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)primer antikor
BCL6LEICANCL-L-Bcl6-564 (Lot No.6050438) (RRID-AB563429)primer antikor
CD20DAKOKlon L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)primer antikor
c-MYCABCAMY 69 klonu ab32072 (Lot NO. GR29511133)(RRID-AB731658)primer antikor
Cy 5PERKIN ELMERFP1171Uygun tiramid bazlı floresan reaktif
Graphpad Prism 7Grafik pediİstatistiksel yazılım
HistoClear Clearing AgentSIGMAH2779-1L
inForm Advanced
Görüntü Analiz Yazılımı		Perkin ElmerBilgilendirme Yazılımı 2.2.1Veri Analizi yazılımı
KI67DAKOKlon MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)birincil antikor
KOS MILESTONE çok fonksiyonlu doku işlemcisiIsı kaynaklı epitop alımı içinMilestone
MikrodalgaPANASONICNN-ST651M Mikrodalgasıyırma
MowiolSIGMA ALDRICH81381 Aldrich Mowiol® 4-88montaj ortamı
Opal 570PERKIN ELMERFP1488Uygun tiramid bazlı floresan reaktif
Opal520PERKIN ELMERFP1487B21Uygun tiramid bazlı floresan reaktif
Opal540PERKIN ELMERFP1494Uygun tiramid bazlı floresan reaktif
Opal620PERKIN ELMERFP1495Uygun tiramid bazlı floresan reaktif
Poli-L-lizin kaplı slaytFISHER SCIENTIFIC120-550-15Rutin histolojik kullanımda doku kesiti yapışması için slayt
Spektral DAPIPERKIN ELMERFP1490nükleik asit boyası
Hedef Alma Çözeltisi, pH 9.0 (10x)HIERDAKOS2367
Tampon salin (TBS). BASE20X4L yıkama
Tween 20SIGMA ALDRICHP1379-1LTween
için MikrodalgaTris Tampon için 1 BUF3030 Tampon için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swerdlow, S. H., et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).
  2. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  3. Dabbs, D. J. Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , Saunders. (2010).
  4. Kim, S. -W., Roh, J., Park, C. -S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  5. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  6. Anderson, M. W., Natkunam, Y. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. Jones, D. , Humana Press. 21-44 (2010).
  7. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
  8. Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
  9. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  10. Tóth, Z. E., Mezey, É Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  11. Ng, S. -B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
  12. Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364(2017).
  13. Kalyuzhny, A. E. Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , Humana Press. (2011).
  14. Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
  15. PerkinElmer. Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , PerkinElmer, Inc. (2012).
  16. Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
  17. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  18. PerkinElmer. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , PerkinElmer, Inc. (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Fluorescent ImmunohistochemistryLymphoma Tissue AnalysisAntibody Validation ProtocolMicrowave Antigen RetrievalTyramide Signal AmplificationTissue Microarray StainingSpectral Imaging AnalysisCell Segmentation MethodMarker Co expression AnalysisQuantitative Immunohistochemistry

Related Articles