Yöntem makalesi

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

DOI:

10.3791/58727

⸱

7 Ocak 2019

 ,  , 
1Team Mechanobiology, Immunity and Cancer, Institute for Advanced Biosciences, INSERM U1209, CNRS UMR5309, 2Université Grenoble Alpes, 3Pôle Recherche, Centre Hospitalier Universitaire des Alpes

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz insan makrofajlar proteomik imzaları elde edilir ve bu düşük oksijen çevre makrofaj polarizasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için geçerli bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri doku homeostazı için yanıt Bulaşıcı patojenler için arasında değişen fizyolojik fonksiyonları bir dizi yer vardır. Bu hücrelerin çeşitli işlevlerini etkinleştirme durumlarına hangi da polarizasyon denir ilişkilidir. Bu çeşitli kutuplaşmalar hassas moleküler açıklaması makrofaj biyoloji alanında bir önceliktir. Şu anda çok boyutlu bir yaklaşım nasıl polarizasyon çevre sinyalleri tarafından kontrol edilir açıklamak gerekli olduğunu kabul edilmektedir. Bu raporda, biz insan makrofajlar içinde çeşitli kutuplaşmalar proteomik imza elde etmek için tasarlanmış bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı etiket içermeyen bir miktar jel-şeker ve Lys C/tripsin-sindirmek hücresel lizis içerik elde makrofaj protein ifade temel alır. Biz de bağlı olarak çözüm sindirim ve isoelectric alternatif olarak kullanmak için ayırma odaklanan bir protokol sağlar. Oksijen konsantrasyonu dokularda ilgili bir çevre parametresi olduğundan, biz nasıl atmosferik kompozisyon keşfetmek için bu iletişim kuralını kullanmanız veya düşük oksijen ortamı makrofaj polarizasyon sınıflandırılması etkiler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri apoptotik hücreler kaldırılması da dahil olmak üzere ve hücre dışı matriks1/ remodeling doku homeostazı için yanıt Bulaşıcı patojenler için arasında değişen fizyolojik fonksiyonları bir dizi yer vardır. Bu hücreler kutuplaşmalar olarak da adlandırılan bir birçok olası etkinleştirme devlet çevirir güçlü fenotipik plastisite2 ile karakterizedir. Bu çeşitli kutuplaşmalar hassas moleküler açıklaması makrofaj biyoloji3alanında bir önceliktir. Sözde M1/M2 ikilemi M1 pro-inflamatuar temsil eder ve anti-inflamatuar makrofajlar M2 temsil eder kullanarak bu kutuplaşmalar sınıflandırmak için önerilmiştir. Bu model de akut enfeksiyonlar, alerji ve obezite4gibi çeşitli patolojik durumlar sığar. Ancak, kronik iltihaplı doku ve kanser, o bu sınıflandırma makrofajlar belirli hücresel ortamlar5,6', mevcut geniş fenotipik repertuar kavramak değiştiremiyor gösterilmiştir 7. makrofaj kutuplaşma daha iyi belirli microenvironmental sinyalleri8entegre etmek için bir çok boyutlu modeli kullanarak açıklanan geçerli fikir birliği olduğunu. Bu sonuç insan makrofajlar M1/M2 model elde edilen kutuplaşmalar9tanımlamada yetersiz olduğunu gösteren transcriptomic analizi ile doğrulanmıştır.

Çalışma insan makrofajlar içinde çeşitli kutuplaşmalar proteomik imzalarını edinmek için bir protokol sağlar amaçlamaktadır sundu. Biz çeşitli oksijen düzeyleri ortamlarda insan makrofajlar ayırt etmek ve peptidler etiket içermeyen bir miktar gerçekleştirmek için tüm makrofaj Proteom elde etmek nasıl açıklar. Bu miktar çeşitli proteinlerin ifade düzeylerinin karşılaştırılması sağlar. Kök hücre araştırma bir çevre anahtar parametreyi10olarak oksijen önemini ortaya koyduğu gibi bu doku parametre insanlarda makrofaj polarizasyon etkisi nasıl anlamak arıyoruz. Oksijen kısmi basınç aralığı %3 20 (Toplam atmosferik basınç) % 20 kabaca ne genellikle (tam değer %18,6 su varlığı çekerken civarındadır bir hücre kültür kuluçka kullanılır için kaynakçalara insan vücudunda bulundu hesap).

Önceki çalışma alveoler fonksiyonel üzerinden interstisyel makrofajlar farklıdır ve morfolojik nokta sayısı11 ve bu farklılıkların muhtemelen kısmen maruz kalan12oldukları farklı oksijen seviyesi nedeniyle vardır göstermiştir. Ayrıca, kemik iliği türevi makrofajlar bir düşük oksijen çevre12' ye maruz kaldığında bakteri işbirliği için artan bir yetenek göstermek. Tam tersi bir etki için insan makrofajlar THP1 Ayrıştırılan13buldum, ama bu sonuçlar oksijen regülatörü makrofaj biyoloji olduğunu ve insan makrofajlar moleküler düzeyde bu rolü açıklamak için gerekli fikir destek. Bir önceki çalışmada, bu sorunlara yönelik olarak proteomik yaklaşım başvurdum. Aynı anda binlerce proteinler için ifade düzeylerini ölçme tarafından oksijen polarizasyon etkisi vurgulanır ve yeni moleküler işaretleyicilerin görünümünü bir liste sunuyoruz. Ayrıca bu bulgular bazı makrofajlar işlevlerine ilişkilendirmek başardık. Özellikle, fagositoz apoptotik hücre oranı ALOX15 upregulation için proteomik analizi14tarafından ortaya bağlı IL4/IL13-polarize makrofajlar içinde artış olmuştur bulduk. Bu da çalışmanın, biz böyle bir analiz gerçekleştirmek açıklar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kanı örnekleri (LRSC) sağlıklı, de-tanımlanan bağışçılardan EFS (Fransız Ulusal kan servisi) protokolünün bir parçası olarak bir yetkili (CODECOH DC-2018-3114) elde edilmiştir. Bağış kan kullanım için imzalanmış izin verdi.

1. kitle iletişim araçları ve arabellek hazırlık

  1. Makrofaj orta [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)] hazırlamak ve 37 ° c sıcak
  2. Hazırlamak makrofaj orta + AB plazma (SAB) üzerinden % 10 insan serumu (0,22 µm filtre) filtre sonra 37 ° C sıcak (sevk makrofaj orta + % 10 SAB bundan sonra).
  3. Sıralama arabellek [1 fosfat tamponlu tuz (PBS) + %0.5 Sığır serum albumin (BSA) + 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) x] hazırlamak, (0,22 µm filtre) filtre ve 4 ° C'de korumak

2. izolasyon periferik kan mononükleer hücre (PBMCs) Leukoreduction sistem odası (LRSC)

  1. Yoğunluk gradient hücre ayrılık çözümü 15 mL koymak ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL aralıklarla tüp LRSC almadan önce oda sıcaklığına (RT) sıcak olabilir bu yüzden.
    Not: Yoğunluk sıcaklığına bağlıdır. Bu ürün 4 ° C'de saklandığı şekliyle, RT için equilibrate bu yüzden bu adımı önceden yapılmalıdır
  2. LRSC 50 mL aralıklarla tüp içine boş ilâ 50 mL 1 x PBS ekleyip karıştırın. Çok yavaş, 25 mL. yoğunluk gradient çözüm adımı sırasında 2.1 ısıtılan 15 mL üstüne adımı 2.2 hazırlanan karışımı ekleyin.
    Not: Bu adımı aşamalarında karıştırmak değil dikkatli olun. Kan yoğunluk gradient çözüm bu aşamada herhangi bir rahatsızlık olmadan eklenmesi gerekir.
  3. Her iki Santrifüjü tüpler için 700 x g olmadan sonları itibariyle 25 dk santrifüj kapasitesi.
    Not: yoğunluk gradient Santrifüjü sonunda alt katmanlardan dön vardır: eritrositler ve granülosit şekillendirme Pelet, yoğunluk gradient çözüm aşaması, PBMCs ve plazma tabakası.
  4. Bir damlalıklı ile aspirating olmadan plazma faz üzerinden geçmek ve PBMC katman yeni bir 50 mL aralıklarla tüp içine toplamak. İlâ 50 mL 1 x PBS PBMCs çamaşır adım ve 300 x g, 10 dk santrifüj olarak ekleyin.
  5. Süpernatant Aspire edin ve Pelet 40 mL makrofaj orta resuspend.

3. manyetik etiketleme ve CD14 yalıtım+ hücreleri (monosit)

  1. Malassez odasında PBMCs saymak. PBMCs (genellikle 100 ile 300 x 106 hücreler) deney için gerekli miktarda çekmek, bir Santrifüjü tüp ve 300 x g, 10 dk santrifüj yerleştirebilirsiniz.
  2. Süpernatant Aspire edin ve içinde adım 10 1.3 sırasında hazırlanan sıralama arabelleği 80 µL Pelet resuspend7 PBMCs. Ekle 20 µL CD14 lastikteki başına 10,7 PBMCs. Mix iyi ve sürekli ajitasyon altında 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
  3. Bir çamaşır adım ve 300 x g., 10 dk santrifüj süpernatant Aspire edin ve 108 PBMCs başına arabellek sıralama 500 µL Pelet resuspend gibi 107 PBMCs başına arabellek sıralama, 1 mL ekleyin.
  4. Bir sütun ayırıcı manyetik alana yerleştirin. Sütun arabellek sıralama 3 mL ile durulama tarafından hazırlayın.
  5. Hücre süspansiyon sütuna uygulanır. Sütun hücreleri izole olmak sayısına bağlıdır (burada, LS sütunlar için en çok 109 PBMCs kullanılır). Akışı aracılığıyla içeren etiketlenmemiş hücreleri toplamak.
    Not: Bu adımda itibaren tüm tüpler (negatif ve pozitif seçimleri) daha sonra farklı adımları kontrol etmek için akış sitometresi tarafından tutulur.
  6. Sütun 3 x 3 mL arabellek sıralama ile yıkayın. Etiketlenmemiş hücreleri aynı tüpten 3.12 adımından geçen toplamak. Çamaşır adımları ekleme sıralama arabellek, köşeni kuru değil dikkatli olun. Bir koleksiyon tüp sütununun altında yerleştirin ve ayırıcıyı kaldırmak.
  7. Arabellek sütuna sıralama 5 mL pipet. Hemen manyetik olarak etiketli hücreleri sıkıca sütuna pistonu iterek sifonu çek. CD14 saflığı artırmak için+ hücreleri, eluted kesir ikinci bir sütun üzerinde zenginleştirilmiş.
  8. Yeni bir sütun ile 3.4-3.7 adımları yineleyin.

4. monosit kaplama

  1. Monosit Malassez odasında say. CD14 saflığı kontrol+ hücreleri akış sitometresi tarafından. Monosit deney için gerekli miktarda çekmek ve Santrifüjü tüpte koyun.
  2. 300 x g. aspiratı süpernatant, 10 dk santrifüj kapasitesi ve monosit Pelet makrofaj ortamda resuspend. Hücreleri plaka ve SAB + 25 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşma ikna etmek için 50 dk 1 h. için orta Aspire edin ve eski yerine koymak o ile makrofaj orta + % 10 yerleşmek izin.

5. makrofajlar gün 6 polarizasyon

  1. Orta Aspire edin. Eski yerine koymak o makrofaj orta + % 10 ile SAB çeşitli uyaranlara ile. Örneğin, 10 ng/mL interferon Gama (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysaccharide (LPS M1 polarizasyon, elde etmek için) ya da 20 ng/mL interlökin 4 (IL4) + 20 ng/mL interlökin 13 (IL13) M2 polarizasyon için ekleyin.
    Not: 24 ve 48 s diğer testlere devam etmeden önce arasındaki uyarımı gerçekleştirilebilir.
  2. Ayırmayı bir çözüm ya da bir hücre kazıyıcı kullanarak hücre hasat.

6. hücre kültürü düşük oksijen koşullar altında

  1. Adım 4 den başlayarak, monosit ve makrofajlar hipoksik durum analizi yapmak için bir oksijen kontrollü ortamda korumak. Bir hipoksi çalışma istasyonu deneme sırasında istenen oksijen kısmi basınç altında hücreleri korumak için kullanın.
    Not: düşük oksijen basınç altında çalışırken, bu tüm medya ve çamaşır arabellekleri istasyonunun altındaki hazırlamak ve yeterince sıvı doğru kısmi basınç elde etmek için beklemek önemlidir. Örneğin, PBS 10 mL 60 mm Petri kabına O2 kısmi basıncı atmosferik baskılardan (Biz bir fiber optik oksijen sensör kullanarak ölçülen var gibi) başlangıç için 25 mmHg ulaşmak için yaklaşık 2 saat gerektirir. Birçok hipoksik istasyonları veya İnkübatörler, oksijen basıncı atmosferik basınç yüzdesi olarak ayarlanır. Kesin ölçüler gerekliyse, doğrudan oksijen basıncı mmHg ayarlamak için yetki veren bir istasyonu kullanmak daha iyidir.

7. lizis ve jel sindirim (protokolü 1)

Not: Bu ve aşağıdaki bölümlerde, peptidler elde etmek ve LC-MS/MS çözümlemesi için kullanılan iki protokol anlatılmıştır. Protokol 1 hücre lizis ve jel ayırma ve sindirim ve çözüm hücre lizis ardından çözüm sindirim ve isoelectric bir odaklama yöntemini kullanarak Ayırma Protokolü 2 açıklar.

  1. Hücre lizis Laemmli arabellek [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), %7.5 SDS, % 37 gliserol, %33,3 (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol mavi % 0,2 w/v] gerçekleştirin. 4-%12 BIS-Tris akrilamid jeller her örnek için 300.000 hücrelerin protein eşdeğer yükleyin.
  2. Şekil 3' te olarak 6 jel bantları bölünecek Her protein örnek izin vermek için elektroforetik geçiş süresini kontrol eder.
  3. Jel tespit bir çözüm (% 30 etanol + 20 dk için % 7,5 asetik asit) ile düzeltmek, sonra boyama çözüm (R-250 Coomassie 45 dk için mavi) ekleyin. Destaining çözüm (% 30 etanol + % 7.5 bant görününceye kadar asetik) ekleyin temiz bir neşter ile protein bantları bilincin önce.
  4. Giriş önce çıkarılan her grup 500 µL tüplerde zar. Temiz cam yüzey (%5 SDS Çözüm deiyonize su yüzeyleri temizlemek için kullanılabilir) keratins ile kirlenmesini önlemek için garanti kapsamındadır.
  5. Jel dilimler 3 kez 25 mM Amonyum Bikarbonat 25 mM Amonyum Bikarbonat ve Asetonitril (% 50 v/v) bir yıkama ardından 37 ° C'de 20 dk için 200 µL yıkayın. % 100 Asetonitril 10 min için jel adet 200 µL ile kurutmak.
  6. 10 mM 35 dk. RT., karanlıkta için 25 mM Amonyum Bikarbonat (200 µL) 55 mM iodoacetamide ardından DTT (dithiothreitol) 25 mM Amonyum Bikarbonat 56 ° c (200 µL), 45 dk içinde her jel parçasıyla kuluçkaya
  7. Alkillenme durdurmak için 10 mM DTT 25 mM Amonyum Bikarbonat 10 dakika dik yıkama her jel parçası 200 µL ile 200 µL jel parçaları 25 mM Amonyum Bikarbonat kuluçkaya sonra 200 µL % 100 Asetonitril 10 dk ile kurutmak.
  8. Gecede 37 ° C'de üretici yönergelerine göre tripsin/Lys-C karışımı ile protein sindirimi.
  9. Jel parçalardan % 50 Asetonitril 15 dk sonra 50 μL %5 formik asit 15 dakika için 50 μL ve son olarak, 50 μL % 100 Asetonitril 15 dk. havuzu ekleyerek elde edilen peptidler ayıklamak ve her kesir peptidler adsorpsiyon sınırlamak için düşük-emme tüpler kuru ve örnek kaybı. -80 ° C'de örnekleri daha fazla analiz kadar saklayın.

8. protein çıkarma ve çözüm sindirim (2 iletişim kuralı)

  1. Hücre lizis (2 x 106 hücreler) aşağıdaki lizis arabellek 150 µL ile gerçekleştirin:
    1. 7 M üre, 2 M Tioüre, 40 mM Tris ve % 4 çocuklar, proteaz inhibitörleri (tam mini, proteaz inhibitörü kokteyl EDTA içermeyen) ile desteklenmiştir.
  2. RT 30 min bir thermoshaker ile için çözümler lunaparkçı. 13,800 x g 20 dk RT için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant tutun.
  3. 2D bir temizlik kiti ile kirleticiler kaldırın:
    1. Kit precipitant çözüm, eş precipitant çözüm, yıkama arabellek ve yıkama katkı sağlar.
    2. Precipitant çözümün 300 µL ekleyin ve iyice karıştırın. 15 dk. eklemek 300 µL Co precipitant çözüm için buz üzerinde kuluçkaya. Borular 12,000 x g 5 min için de (en az) santrifüj kapasitesi. Küçük bir Pelet görünür olmalıdır. Hızla resuspension veya pelet dağılım önlemek için sonraki adıma geçin. Süpernatant Pelet bozmadan kaldırın.
    3. Tüplerini tekrar cap-menteşe ve Pelet dışa tüpün dibinde kalan herhangi bir sıvı getirmek için karşı karşıya santrifüj kapasitesi. Kısa darbe yeterli olur. Görünür hiçbir sıvı tüplerde kalan olmalıdır.
    4. Pelet bozmadan, 40 µL Co precipitant çözüm ekleyin. Tüp buz 5 dakika santrifüj 5 dakika süreyle oturup sonra kaldırmak ve yıkama atmak izin. 25 µL de-iyonize su ekleyin. Girdap her 5-10 s için tüp. Pelet dağıtmak ama suda çözülür değil.
    5. 1 mL (en az 1 h-20 ° c için önceden soğutulmuş) yıkama arabelleği ve yıkama katkı 5 µL ekleyin. Pelet tümüyle dağıldı kadar girdap. Tüpler-20 ° c en az 30 dk. girdap 20-30 s her 10 min için kuluçkaya
      Not: Tüpler-20 ° C ilâ 1 hafta en az protein yıkımı veya değişiklik ile saklanır.
    6. 5 dk. dikkatle kaldırmak ve süpernatant için tüpler (en az) de 12.000 × g santrifüj kapasitesi. Beyaz bir Pelet görünür olmalıdır. (Pelet çok kuru, resuspend zor olacak ise) Pelet en fazla 5 min için airdry için izin verir.
  4. Protein Pelet 8 M üre ve 0.1 M Amonyum Bikarbonat 300 µL içinde resuspend. 1 dk. için güçlü girdap kolorimetrik bir tahlil kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek.

9.-çözüm sindirim (2 iletişim kuralı)

  1. 700 mM DTT sulu çözüm 5.1 µL ekleyerek disülfür köprü azaltmak (son konsantrasyonu 12.5 mM) 8.4 resuspended proteinler adım ve bir thermoshaker ile 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Sistein kalıntıları 700 mM iodoacetamide sulu çözüm 20,3 µL ekleyerek alkylate (son konsantrasyonu 40 mM) ve 25 ° c 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık ile bir thermoshaker için kuluçka.
  2. 0.1 M Amonyum Bikarbonat 990 µL örnek için ekleyin. Tripsin/Lys-C Mix (enzim: substrat oranı 1: 100 w/w) karşılık gelen bir birim eklemek. Gecede bir thermoshaker ile 37 ° C'de kuluçkaya.

10. temizlik kartuş (2 iletişim kuralı)

  1. Bir kartuşu 1 sütun-hacmi (1 mL) metanol ile ıslak. Kartuş ile 1 sütun-hacmi (1 mL) % 80 Asetonitril/HPLC-grade su temiz ve akışı aracılığıyla atın. Kartuş 4 sütun-cilt (4 mL) %0.1 formik asit/HPLC-grade su ile equilibrate ve akışı aracılığıyla atın.
  2. Örnekleri 90 µL % 10 formik asit veya pH 2-3 (pH pH göstergesi ile kontrol edin) su ile acidify. Acidified örnekleri yüklemek ve akışı aracılığıyla toplamak. (Değil muhafaza peptidler içeren) aracılığıyla akış-yeniden yükleyin. Kartuş 6 sütun-hacmi (6 mL) %0.1 formik asit/HPLC-grade su ile yıkayın.
  3. 1 sütun-birimleri (1 mL) kartuşla üzerinden peptidler %0,1 formik acid/50% Asetonitril/HPLC-grade su elute. 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Vakum yoğunlaştırıcı (150 x g, vakum 160 mBar) kullanarak örnek konsantre.

11. ayırma (protokol 2) Isoelectric odaklanarak

Not: Peptidler 10 3 pH aralığı kapsayan bir 13 cm şerit üzerinde bir jel fractionator kullanarak kendi isoelectric noktalarına göre ayrılır. Biz (aşağıda özetlenmiştir) Tedarikçi tarafından sağlanan aşağıdaki iletişim kuralı kullanılır:

  1. Aşağıdaki çözümleri hazırlamak: çözüm (600 µL) gliserol çözüm, 60 µL OFFGEL arabelleği, 4.34 mL Ultrasaf Su ve çözüm B (çözüm a 1.776 mL) ve 444 µL Ultrasaf Su.
  2. IPG şeritler, çerçeve ve elektrotlar üreticinin talimatlarına göre bir araya getirin.
  3. Örnek çözüm d. 40 eklemek µL çözüm B her kuyuya 1,8 mL ile resuspend. Örneğin 150 µL her kuyunun içine yükleyin.
  4. Peptidler için varsayılan yöntemi seçin: OG12PE00 (peptidler 3100 OFFGEL düşük Res Kit, pH 3-10, 12-şey çerçeveler ile kullanılmak için varsayılan yöntemi OFFGEL. Bu yöntem tamamlanan (~ 20 h) olmuştur kadar bekleyin. Düzgün etiketli tüpler kesirleri toplamak.

12. temizlik Harvard aparatı sütun ters C18 Post-IEF (2 iletişim kuralı)

  1. Kademeli %1 bir seferde birkaç μL ekleyin TFA her kesir için de-iyonize su örnek acidify. PH yaklaşık 3 veya daha düşük pH kağıt kullanarak onay.
  2. Aşağıdaki çözümleri hazırlamak: çözüm 1 (5 mL Asetonitril de, 10 µL formik asit, 4,99 mL Ultrasaf Su) ve çözüm 2 (Asetonitril 0.5 mL, formik asit, 9,49 mL Ultrasaf Su 10 µL).
  3. Çözüm 1 150 µL spin sütunla önceden ıslak. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla. Çözüm 2 150 μL spin sütunla yıkayın. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla.
  4. Kesir sütunu boyunca geçmek. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla. Çözüm 2 150 μL ile yıkayın. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla.
  5. Kesir çözüm 1 50 μL ile elute. Santrifüj için 90 s 750 x g., bir kez daha bu adımları yineleyin.
  6. Kuru-kesir vakum yoğunlaştırıcı (150 x g, vakum 160 mBar) kullanarak ve-80 ° C'de

13. analiz proteomik veri ve Biyoinformatik18

  1. Bir nano-LC MS tarafından elde edilen verileri analiz/MS kütle spektrometre miktar yazılım MaxQuant (sürüm 1.5.2.8) gibi ve Andromeda arama motoru kullanarak.
  2. Yanlış bulma oranı (FDR) %1 proteinler ve peptidler ve 7 amino asitler en az uzunluğunu ayarlayın. C-terminal ayarla enzim özgüllük Arg ve Lys için. 2 cevapsız nefrette prolin tahvil izin. Sistein carbamidomethylation bir sabit değişiklik ve N-terminal protein asetilasyon ve metionin oksidasyon olarak değişken değişiklikler seçin.
  3. Daha fazla veri istatistiksel analiz yazılımı ile analiz. FunRich yazılımı (www.funrich.org/) kullanarak bir işlevsel zenginleştirme çözümlemesi gerçekleştirin. DAVID yazılım (https://david.ncifcrf.gov/) kullanarak bir gen Ontoloji zenginleştirme çözümlemesi gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) tarafından fark Santrifüjü elde başlayarak, protokol CD14 nüfusu izni alması+ monosit akış sitometresi (Şekil 1) fazla % 98 oranında biçilen bir saflığı ile. Bu monosit ikincil olarak çeşitli kutuplaşmalar doğru (Şekil 2) farklı. Ne zaman bir ayırma jel üzerinde seçilir, SDS-sayfa jeller üzerinde geçiş istenen bant sayısı elde etmek için adapte ve bantları çıkardım (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomik ifade bütün bir hücre veya hücre altı bölmeleri farklı proteinlerin eğitim için güçlü bir araç olduğundan, hücre lizis Protokolü duruma getirilmesi ve proteinlerin sindirim çalışmalar bir dizi tarafından ele alınmıştır. Jel sindirim (polyacrylamide jel matris proteinlerin sindirim)17, çözüm18 ve filtre destekli örnek hazırlama19sindirim dahil yöntemleri üç ana sınıf vardır. Bu son yöntem, evrensel olarak, açıklanan ilk başta düşük tekrarlan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AM genç grup lideri programıyla (CD'ye atıp/Avenir INSERM-CNRS), la Ligue Nationale contre le kanser ve la Fondation ARC pour la recherche sur le kanser tarafından finanse edilmektedir. Kütle spektrometresi biyoloji platformu (UTECHS MSBIO, Pasteur Enstitüsü, Paris) için gelen Mariette Matondo teşekkür ediyoruz. Lauren Anderson el yazması onun okuma için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hipoksi Çalışma İstasyonuOxford OptronixHypoxylab
C6 Akış sitometresiBDAccuri C6
ÜreAgilent Technologies5188-6435
Formik asit (FA)ARISTAR450122M
R-250 Coomassie mavisiBiorad1,610,436
Lipopolisakkarit, E.Coli (LPS)Calbiochem437627
2D temizleme kitiGE Healthcare80-6484-51
RPMI 1640 orta, glutamax takviyesiGibco61870044
HEPES 1 MGibco15630-080
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA) Çözeltisi 100XGibco11140-035
Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 1XGibco14190-094
Harvard Aparat sütunu Ters C18 mikro döndürme sütunuHarvard Aparatı74-4601
EDTA 0.5 M, pH 8.0InvitrogenAM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12%Life Technologies SASNP0321 BOX
insanMiltenyi Biotec130-050-201
MACS ayırma sütunu LSMiltenyi Biotec130-042-401
Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF)Miltenyi Biotec130-096-485
İnterlökin 4 (IL4)Miltenyi Biotec130-093-917
İnterlökin 13 (IL13)Miltenyi Biotec130-112-410
İnterferon gama (INFγ)Miltenyi Biotec130-096-482
CD14-FITC (klon TÜ K4)Miltenyi Biotec130-080-701
MACSmix Tüp DöndürücüMiltenyi Biotec130-090-753
Trifloroasetik Asit (TFA)Pierce28904
Tripsin/Lys-C KarışımıPROMEGAV5073
Komple Mini, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü kokteyliRoche11836170001
Yoğunluk Gradyan Çözeltisi ( Histopaque 1077)Sigma Aldrich10771-100ML
AccumaxSigma AldrichA7089-100ML
İnsan Serumu insan erkek AB plazmasından (SAB)Sigma AldrichH4522-100ML
Sığır Serumu Albümin (BSA) çözeltisi% 30Sigma AldrichA9576-50ML
Trisma bazlıSigma AldrichT1503
GliserolSigma Aldrich49767
ve beta; -MerkaptoetanolSigma AldrichM3148
Bromofenol mavisiSigma Aldrich114405
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)% 20Sigma Aldrich5030
Amonyum bikarbonatSigma Aldrich9830
AsetonitrilSigma Aldrich34888
DithiothreitolSigma Aldrich43819
İyodoasetamidSigma Aldrich57670
TiyoüreSigma AldrichT8656
CHAPSSigma AldrichC9426
Mikro BCA Test KitiThermoFisher23235
5 mL steril plastik pipetVWR612-1685
Thermomixer C EppendorfVWR460-0223
Sep-Pak tC18 ters faz kartuşları, 100 mgSularWAT036820
CD14 Mikroboncuk

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
  2. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  3. Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
  4. Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
  5. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  6. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  7. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
  8. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  9. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  10. Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
  11. Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
  12. Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
  13. Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926(2013).
  14. Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
  15. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  16. Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  18. Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
  19. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  20. Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
  21. Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
  22. Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
  23. Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
  24. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  25. Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
  26. Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Etiketsiz Nicelle tirmeJel i FraksiyonlamaLys C Tripsin Sindirimizelti i Sindirimzoelektrik OdaklamaHipoksik Ko ulCD14 Monosit zolasyonuAk Sitometrisi

İlgili makaleler