Yöntem makalesi

Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli

DOI:

10.3791/58751

⸱

4 Ocak 2019

 ,  ,  ,  , 
1Anesthesiology Department, The Second Hospital of Dalian Medical University, 2Scientific Research Center, The Second Hospital of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, fare peritoneal makrofaj fagositoz gelişmiş yeşil floresans Escherichia coliprotein ifade kullanarak değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması fagositoz tahlil gerçekleştirmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklanır. Bu yöntem ilk bölümünde bir evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP vektör yapı içerir (SUMO küçük Ubikuitin benzeri değiştirici =) ve ifade gelişmiş yeşil floresans protein Escherichia coli (BL21DE) (EGFP). E. coli EGFP ifade ile makrofajlar 37 ° C'de 1 h için coincubated; negatif kontrol grubu aynı süre için buza inkübe. O zaman, makrofajlar değerlendirmesi için hazırsınız demektir. Bu teknik avantajları, basit ve kolay adımlar içerir ve fagositoz her iki akış sitometresi ve floresan mikroskop tarafından ölçülebilir. EGFP ifade E. coli stabildir ve sonra bile makrofajlar paraformaldehyde ile giderilen bir güçlü floresans sinyal görüntüler. Bu yöntem yalnızca makrofaj hücre hatları veya birincil makrofajlar in vitro olarak değerlendirilmesi için uygun ama ayrıca periferik kan mononükleer hücrelerinde granülosit ve monosit fagositoz değerlendirilmesi için uygun değildir. Sonuçları genç (sekiz-hafta-yaşlı) fareler gelen periton makrofajlar fagositik kapasitesini makrofajlar yaşında (16-ay-yaşlı) fareler dan daha yüksek olduğunu gösteriyor. Özet olarak, bu yöntem makrofaj fagositoz ölçer ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi işlevi çalışmak için uygundur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofaj fagositoz deneyleri genellikle doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu incelemek için kullanılır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı enfeksiyon duyarlılık gösterebilir. Makrofaj hücre satırları İmmünoloji çalışmalarda yaygın olarak kullanılır. Ancak, genişletilmiş geçit gen kaybına neden olabilir ve bu hücre satırları bağışıklık fonksiyonlarında tehlikeye. Böylece, birincil periton makrofaj hücre işlevi1eğitim ideal nesneyi vardır.

Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı yaşlı gövdesine sağlam olduğu düşünülüyordu rağmen fagositik yeteneği ile karşılaştırıldığında daha genç içinde2,3vücut düşebilir. Burada, biz genç (sekiz-hafta-yaşlı) ve uygun, hızlı ve ekonomik olarak mümkün olan EGFP ifade E. coli, kullanarak (16-ay-yaşlı) yaşlı fare peritoneal makrofajlar fagositoz değerlendirmek için bir yöntem gösterecektir.

Çünkü bu bakterilerin stabildir ve sonra bile makrofajlar %4 (w/v) paraformaldehyde tarafından giderilen bir güçlü floresans sinyal görüntülemek bir EGFP ifade e.coli suşu kullanımı bu tahlil avantajlarından biridir. Ayrıca, E. coliEGFP ifade kullanarak, araştırmacılar gerek yok daha fazla zaman kazandırır fagositoz sonra boyama. Ayrıca, makrofajlar immunoresponsive E. coli yüzey antijeni, E. coli EGFP ifade mantarlar veya floresein etiketli boncuk kullanarak daha fagositoz tahlil için daha uygun yapmak için vardır.

EGFP ifade E. coliile fagositoz tahlil kolayca 2 h başarılı ve her iki akış sitometresi ve floresan mikroskopisi, araştırmacı amaca bağlı olarak tarafından ölçülür. Bu yöntem, doğrudan fagositik yeteneğini ölçer beri daha dolaylı diğer yöntemlerden daha tekrarlanabilir sonuçlarıdır.

Bu yöntem aynı zamanda bir RAW264.7 hücre kültürünü doğrulandı ve4insan periferik kan mononükleer hücreler. Aşağıdaki metin bu tahlil gerçekleştirmek için ayrıntılı adım adım yönergeler sağlar ve araştırmacılar deneyleri ihtiyaçlarını karşılamak üzere değiştirebilecek kritik adımlar vurgular.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yordamları ulusal kurumları, sağlık kuralları altında bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının için yapıldı ve iletişim kurallarını hayvan bakım ve kullanım Komitesi Dalian Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Aylık (vücut ağırlığı 30-35 g ile) on altı ve sekiz haftalık (20-25 g) SPF (özel-patojen-ücretsiz) erkek C57BL/6 fareler Dalian Tıp Üniversitesi SPF hayvan Merkezi'nden elde. Bütün fareler yiyecek ve su ad libitumiçin hayvan konut erişimli tutuldu. 20-24 ° C sıcaklık tutuldu, nem % 40-% 70, ve aydınlatma 12 saat ışık/12 h karanlık oldu. Hayvanlar çevreye en az 7 gün önce deney alışmana izin verildi.

1. evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP plazmid ve indüksiyon EGFP ifade inşaatı

  1. EGFP gen parça sentez (özel gen sentez hizmeti tarafından sentezlenen bir 717 bp bkz: sıra Tablo malzeme ve ek dosya 1 için sıra) ve parçası ile ileri astar (yükseltmek 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') ve ters astar (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), yüksek sadakat Taq DNA polimeraz kullanarak.
  2. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünleri adenin çıkıntılar tek 3' TA bir sonraki adımda klonlama için olması için son döngüsü sonra ( ek dosya 1 için PCR koşullara bakınız) 72 ° C'de 30 dk uzantısı kullanın. PCR ürünü özel jel elektroforez tarafından kontrol edin.
  3. PCR ürünü evde beslenen hayvan-SUMO vektör clone ( Tablo malzemelerigörmek) Yöntem5 T4 DNA ligaz ile klonlama TA kullanarak. Reaksiyon, oda sıcaklığında (20-25 ° C) 30 dk için kuluçkaya. Vektör 653-654 1 bp 5't-çıkıntı her iplikçikteki ile nükleotit arasında Doğrusallaştırılmış.
  4. Tüp ligasyonu ürün kimyasal olarak yetkili BL21(DE) e.coli suşu aşağıdaki gibi dönüşümü: 5 µL ekleyin (100 ng) için BL21(DE) yetkili hücre 90 için 42 ° C'de ısı şoku üzerinden 100 µL PCR ürünün s; 3 dakika buzda karışımı tutmak ve sonra lysogeny suyu (LB) orta 1 h 37 ° C'de ve 120 rpm sallıyorum 37 ° C'de ısıtılmış 400 µL ekleyin.
  5. EGFP ifade zorlanma verimli 100 µL uyarıcı laktoz (0.5 mmol/L), bir LB-sefaloridin (100 µg/mL) plaka yüzeyine bakterilerin aşılamak. 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya.
    Not: Eğer EGFP başarılı bir şekilde ifade, bazı koloniler karanlıkta parlayan yeşil ışık olarak görülebilir.
    1. İsteğe bağlı olarak, koloniler DNA sıralama tarafından eklenen EGFP parçası doğrulamak için seçin. DNA sıralama için astar vardır: ileri, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; geri, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
  6. 5 mL LB orta 100 µg/mL sefaloridin ile de içine pozitif bir koloni aşılamak. 37 ° c için 2 h, 120 RPM kuluçka sallayarak kuluçkaya, uyarıcı laktoz 0.5 mmol/L son bir konsantrasyon için eklemek ve 6 h EGFP ifade inducing titremeye devam. Ampirik olarak, ne zaman 6 h, 600 optik yoğunluk için sallayarak nm (OD600) 0,7 ulaşmak veya daha yüksek.
  7. 10 µL bakteri kültürü orta bir slayda eklemek, bir coverslip ile kapak ve EGFP ifade bir ters floresan mikroskop altında incelemek. EGFP ifade etmek bakteri Orta 2-8 ° C'de birkaç hafta süreyle saklanabilir.

2. fare peritoneal makrofaj yalıtım ve birincil kültür

  1. Thioglycolate 3.5 g 100 ml distile su ve basınçlı kap kısırlık kullanmadan önce karışıma ekleyin. Thioglycolate orta fare peritoneal enjeksiyon için başlıklı 1 mL steril enjektör içine pompa. Şırınga başına bir fare bulaşmasını önlemek için kullanın. Thioglycolate kullanımı makrofajlar sayısını artırabilirsiniz. İkamet periton makrofajlar ayrılmış olabilir olmadan thioglycolate ama alt ile makrofaj verir.
  2. Yerel hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış bir yöntemi kullanarak fare anestezi. 1 mL % 3,5 thioglycolate orta fare periton boşluğuna 23 G iğne kullanarak 1 mL şırınga ile enjekte et.
    Not: Anestezi inducing, periton enjeksiyon kolayca gerçekleştirilebilir ve iğne ile neden iç organlarına yaralanma riskini azaltır.
  3. Fare ile su ve yiyecek ad libitum 3 gün boyunca korumak. Hayvan vücut ağırlığı ve gıda alımı her gün izlemek. Vücut kilo kaybı 3 gün içinde 10 %'den büyük ise, hayvan deneyden hariç.
  4. 3 gün sonra hızla sevoflurane kapalı bir kutu içinde tarafından anestezi inducing sonra servikal çıkığı tarafından fare ötenazi. Alternatif olarak, fare ötenazi yapmak yerel hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir yöntemi kullanın.
  5. Sterilize etmek için % 75 etanol ile fare (10 cm çaplı) bir çanak içine koymak ve hızlı bir şekilde başlık için transfer. Fareyi bir tabağa yerleştirin ve farenin konumunu düzeltmek için yönetim kurulu için ön pençe pin.
  6. Bir 20 G bağlı 5 mL şırınga kullanarak iğne iğne eğimi 30 ° - 40 ° açıyla yerleştirilmesi, 5 mL soğuk (4-10 ° C) fosfat tamponlu tuz (PBS) alt karın fare periton boşluğuna, bağırsak delinme kaçınarak enjekte et. Bağırsak (veya herhangi bir diğer organ) delinmiş, bu birincil hücre kültürü için uygun olmayan hücreler etkinleştirmek gibi fare ile hücreler artık deneyler için kullanılabilir.
  7. Hafif bir masaj fare karın iki kenarı da gerçekleştirin. Sonra yavaşça ve yavaş yavaş sıvı Aspire edin. Peritoneal sıvı bir 50 mL santrifüj tüpüne dağıtmak. Bunlar 2 x veya 3 x adımları yineleyin.
  8. Askıya alınan hücreler için Soğutmalı Santrifüj (4-8 ° C) 400 x g , 10 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve hücre Pelet RPMI 1640 orta % 10 fetal Sığır serum (FBS) ile resuspend. Hücreleri saymak. Hücreleri 10 mL orta resuspended zaman ampirik olarak, hücre yoğunluğu yaklaşık 5 x 106 hücre/mL için eşittir.
  9. 6-şey plaka akış sitometresi tahlil ve floresan mikroskop için 24-şey plaka kuyuya başına 5 x 105 hücre için her kuyuya 5 x 106 hücreler ekleyebilirsiniz. %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler gecede kültür. Kültür orta çünkü en-in bunlar lenfositleri nonadherent hücre kaldırmak için 3 saat sonra yenilenmesi. Esas olarak makrofajlar yapisan hücrelerdir ve de doku kültürü tedavi edilen plastik için uygun.

3. makrofaj fagositoz tahlil floresan mikroskop kullanarak

  1. Hücreleri hücre canlılık ve hücre yoğunluğu değerlendirmek için bir alan parlak mikroskop altında gözlemlemek.
  2. Kültür orta 24-şey plaka kaldırın. Tablo 1' de açıklandığı gibi her kuyuya 100 µL taze kültür ortamının ve bakteriyel süspansiyon (yaklaşık 2 x 107 hücreleri), 10 µL ekleyin. Bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka 1 h için kuluçkaya.
  3. Yavaşça noninternalized bakterileri yıkamak için iyi başına 3 x-5 x 500 µL soğuk PBS ile yıkayın.
  4. PBS içinde % 4 formaldehit, oda sıcaklığında 30 dk için hücrelerle kuluçkaya.
  5. Sabit hücreleri 3 yıkama x PBS ile (500 µL/de).
  6. Phalloidin 633 floresans 200 µL boya konjuge çalışma çözüm ekleyin (F-aktin leke Malzemeler tablobkz:). Bir yerde saklayın karanlık, nemli (% 60-%80) 60 dakika süreyle oda sıcaklığında durulama hücreleri 3 x PBS ile (500 µL/herhangi bir aşırı phalloidin kaldırmak için de). F-aktin boyama tarafından sitoplazma özetlenen ve içselleştirilmiş bakteri ayırt etmek için yardımcı olur.
  7. Hücre çekirdeği leke ve oda sıcaklığında karanlık, nemli bir yerde 5 min için kuluçkaya için DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) çalışma çözüm (1 µg/mL) 200 µL ekleyin. 1 x PBS ile yıkayın (500 µL/de) ve aynı birimin distile su ile 1 x. Sonra hücreleri bir ters floresan mikroskop altında gözlem için hazır olacak.

4. makrofaj fagositoz tahlil akış sitometresi kullanarak

  1. Deneysel hatalarını en aza indirmek ve sonuçları doğru biçimde yorumlayabilmek yapmak, gruplarını ayarlamak ve tüpler deneme için Tablo 2' de listelenen denetlemek için.
    1. Kontrol grubu için hangi buz ( Tablo 2Grup 4) üzerinde yer alacak, orta 6-şey plaka çıkarın ve temizleyin PBS ile 1 x. Daha sonra 1 mL soğuk 70 mM EDTA hücreleri ayırmak ve akış sitometresi tüp aktarmak için kuyunun içine ekleyin. Bakteriyel süspansiyon 50 µL tüpün içine ekleyin ve buz 1 h için yerleştirin.
    2. Diğer grupları için kültür orta kaldırın. 1 mL taze orta her kuyunun içine ekleyin. Bakteriyel süspansiyon 50 µL içine kuyu grubu ayarına göre Tablo 2' de açıklandığı gibi ekleyin. O zaman, 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka 1 h için 6-şey plaka yer.
  2. Floresan noninternalized E. coligidermek için 200 µL % 0.8 kristal violet (CV) su çözüm kuyunun içine ekleyin ve kısa bir süre, böylece bir yanlış pozitif sonuç yüzeyine EGFP ifade E. coli bağlama tarafından kaçınarak sway makrofajlar ama değil içselleştirilmiş. 3 hücreleri yıkama x herhangi bir kalıntı CV kaldırmak için PBS ile.
  3. Daha sonra 1 mL soğuk 70 mM EDTA hücreleri ayırmak ve akış sitometresi tüp aktarmak için kuyunun içine ekleyin.
  4. 400 x g 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  5. PBS hücreleri resuspend 100 µL ekleyin. F4/80-PE-Birleşik antikor (fare makrofajlar ifade bir yüzey antijeni) 5 µL grubu ayarına göre tüpler veya kullanım Igg2a-PE izotip, ekleyin. Kısaca girdap ve 5-10dk karanlıkta buz üzerinde örnekleri kuluçkaya.
  6. PBS 1 mL her tüpün içine ekleyin ve 5 dakika süreyle 400 x g , santrifüj süpernatant atın. Hücre topakları PBS Akış Sitometresi Analizi için 200-300 µL ile resuspend. Her tüpün çalıştırın ve en az 10,000 olayları F4/80+ hücre için veri elde etmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Evde beslenen hayvan-SUMO vektör yerli protein ifade E. coliizin vermek için küçük bir Ubikuitin benzeri değiştirici kullanır. SUMO füzyon kolayca algılanabilmesini sağlayan EGFP çözünürlük önemli ölçüde artırılabilir. EGFP ifade başarıyla laktoz tarafından indüklenen, yeşil kolonileri karanlıkta (Şekil 1A) görülebilir. E. coliEGFP ifade temsil, yeşil noktalar 40 x objektif lens (Şekil 1B) kullanarak bir floresa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı adımda oldukça basit ve anlaşılır. Bir kritik adım E. coliEGFP ifade teşvik etmektir. Genellikle, bir gen Ökaryotlar, EGFP gibi gelen prokaryot E.coli olarak ifade etmek için planlanan tarihte protein'ın doğal yapısı ve faaliyet değişiklikleri protein etkin olmayan toplamları (dahil organları), oluşturacak bir risk olduğunu. Evde beslenen hayvan-SUMO vektör kullanarak ve evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP plazmid oluşturmak yoluyla, EGFP-SUMO füzyon protein başarıyla ifade ve ışık sinyali...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser desteklenen Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (no. 31800046) ve Liaoning Eyaleti doğal Bilim Vakfı (no. 20170540262). Bu eser, ikinci hastane Dalian Tıp Üniversitesi Bilimsel Araştırma Merkezi laboratuarlarında başarılı oldu. Yazarlar Xiao-Lin Sang akış sitometresi ile yardımını ve Bo Qu ve Dong-Chuan Yang video üretiminde onların yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BD FACSCanto II Akış sitometresiBD Biosciences-Biotin
anti-fare CD16/32 AntikorBiolegendCat101303
Şampiyon pET SUMO Protein Ekspresyon sistemiInvitrogenK300-01
Özel Gen Sentezi HizmetiTakara Biotech.-
DAPI(4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)ThermoFisherD1306
F4/80-PE anti-fare antikoru FACSBiolegendCat123110
Leica DMI3000 B & nbsp; Ters MikroskopLeica Microsystems-PE
Sıçan IgG2a, κ-izotip kontrolüBiolegendCat400507
Phalloidin 633 floresan boya konjuge çalışma çözeltisiAAT BioquestCat23125
Tiyoglikolat ortamıSigma-AldrichT9032

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).
  2. Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
  3. Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
  4. Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
  5. Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
  6. Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
  7. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
  8. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  9. Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
  10. Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
  11. Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

EGFP Eksprese Eden Escherichia ColiAk Sitometrisi AnaliziFloresan MikroskobuPeritoneal Makrofaj zolasyonuTiyoglikollat nd ksiyonuEGFP Bakteri Ko ink basyonuKristal Viyole S nd rmesiF4 80 Antikor BoyamasDo u tan Gelen Ba kl k Fonksiyonu

İlgili makaleler