Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli

Makrofaj fagositoz deneyleri genellikle doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu incelemek için kullanılır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı enfeksiyon duyarlılık gösterebilir. Makrofaj hücre satırları İmmünoloji çalışmalarda yaygın olarak kullanılır. Ancak, genişletilmiş geçit gen kaybına neden olabilir ve bu hücre satırları bağışıklık fonksiyonlarında tehlikeye. Böylece, birincil periton makrofaj hücre işlevi¹eğitim ideal nesneyi vardır.

Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı yaşlı gövdesine sağlam olduğu düşünülüyordu rağmen fagositik yeteneği ile karşılaştırıldığında daha genç içinde^2,3vücut düşebilir. Burada, biz genç (sekiz-hafta-yaşlı) ve uygun, hızlı ve ekonomik olarak mümkün olan EGFP ifade E. coli, kullanarak (16-ay-yaşlı) yaşlı fare peritoneal makrofajlar fagositoz değerlendirmek için bir yöntem gösterecektir.

Çünkü bu bakterilerin stabildir ve sonra bile makrofajlar %4 (w/v) paraformaldehyde tarafından giderilen bir güçlü floresans sinyal görüntülemek bir EGFP ifade e.coli suşu kullanımı bu tahlil avantajlarından biridir. Ayrıca, E. coliEGFP ifade kullanarak, araştırmacılar gerek yok daha fazla zaman kazandırır fagositoz sonra boyama. Ayrıca, makrofajlar immunoresponsive E. coli yüzey antijeni, E. coli EGFP ifade mantarlar veya floresein etiketli boncuk kullanarak daha fagositoz tahlil için daha uygun yapmak için vardır.

EGFP ifade E. coliile fagositoz tahlil kolayca 2 h başarılı ve her iki akış sitometresi ve floresan mikroskopisi, araştırmacı amaca bağlı olarak tarafından ölçülür. Bu yöntem, doğrudan fagositik yeteneğini ölçer beri daha dolaylı diğer yöntemlerden daha tekrarlanabilir sonuçlarıdır.

Bu yöntem aynı zamanda bir RAW264.7 hücre kültürünü doğrulandı ve⁴insan periferik kan mononükleer hücreler. Aşağıdaki metin bu tahlil gerçekleştirmek için ayrıntılı adım adım yönergeler sağlar ve araştırmacılar deneyleri ihtiyaçlarını karşılamak üzere değiştirebilecek kritik adımlar vurgular.

Tüm yordamları ulusal kurumları, sağlık kuralları altında bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının için yapıldı ve iletişim kurallarını hayvan bakım ve kullanım Komitesi Dalian Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Aylık (vücut ağırlığı 30-35 g ile) on altı ve sekiz haftalık (20-25 g) SPF (özel-patojen-ücretsiz) erkek C57BL/6 fareler Dalian Tıp Üniversitesi SPF hayvan Merkezi'nden elde. Bütün fareler yiyecek ve su ad libitumiçin hayvan konut erişimli tutuldu. 20-24 ° C sıcaklık tutuldu, nem % 40-% 70, ve aydınlatma 12 saat ışık/12 h karanlık oldu. Hayvanlar çevreye en az 7 gün önce deney alışmana izin verildi.

1. evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP plazmid ve indüksiyon EGFP ifade inşaatı

1. EGFP gen parça sentez (özel gen sentez hizmeti tarafından sentezlenen bir 717 bp bkz: sıra Tablo malzeme ve ek dosya 1 için sıra) ve parçası ile ileri astar (yükseltmek 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') ve ters astar (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), yüksek sadakat Taq DNA polimeraz kullanarak.
2. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünleri adenin çıkıntılar tek 3' TA bir sonraki adımda klonlama için olması için son döngüsü sonra ( ek dosya 1 için PCR koşullara bakınız) 72 ° C'de 30 dk uzantısı kullanın. PCR ürünü özel jel elektroforez tarafından kontrol edin.
3. PCR ürünü evde beslenen hayvan-SUMO vektör clone ( Tablo malzemelerigörmek) Yöntem⁵ T4 DNA ligaz ile klonlama TA kullanarak. Reaksiyon, oda sıcaklığında (20-25 ° C) 30 dk için kuluçkaya. Vektör 653-654 1 bp 5't-çıkıntı her iplikçikteki ile nükleotit arasında Doğrusallaştırılmış.
4. Tüp ligasyonu ürün kimyasal olarak yetkili BL21(DE) e.coli suşu aşağıdaki gibi dönüşümü: 5 µL ekleyin (100 ng) için BL21(DE) yetkili hücre 90 için 42 ° C'de ısı şoku üzerinden 100 µL PCR ürünün s; 3 dakika buzda karışımı tutmak ve sonra lysogeny suyu (LB) orta 1 h 37 ° C'de ve 120 rpm sallıyorum 37 ° C'de ısıtılmış 400 µL ekleyin.
5. EGFP ifade zorlanma verimli 100 µL uyarıcı laktoz (0.5 mmol/L), bir LB-sefaloridin (100 µg/mL) plaka yüzeyine bakterilerin aşılamak. 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya.
   Not: Eğer EGFP başarılı bir şekilde ifade, bazı koloniler karanlıkta parlayan yeşil ışık olarak görülebilir.
   1. İsteğe bağlı olarak, koloniler DNA sıralama tarafından eklenen EGFP parçası doğrulamak için seçin. DNA sıralama için astar vardır: ileri, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; geri, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
6. 5 mL LB orta 100 µg/mL sefaloridin ile de içine pozitif bir koloni aşılamak. 37 ° c için 2 h, 120 RPM kuluçka sallayarak kuluçkaya, uyarıcı laktoz 0.5 mmol/L son bir konsantrasyon için eklemek ve 6 h EGFP ifade inducing titremeye devam. Ampirik olarak, ne zaman 6 h, 600 optik yoğunluk için sallayarak nm (OD600) 0,7 ulaşmak veya daha yüksek.
7. 10 µL bakteri kültürü orta bir slayda eklemek, bir coverslip ile kapak ve EGFP ifade bir ters floresan mikroskop altında incelemek. EGFP ifade etmek bakteri Orta 2-8 ° C'de birkaç hafta süreyle saklanabilir.

2. fare peritoneal makrofaj yalıtım ve birincil kültür

1. Thioglycolate 3.5 g 100 ml distile su ve basınçlı kap kısırlık kullanmadan önce karışıma ekleyin. Thioglycolate orta fare peritoneal enjeksiyon için başlıklı 1 mL steril enjektör içine pompa. Şırınga başına bir fare bulaşmasını önlemek için kullanın. Thioglycolate kullanımı makrofajlar sayısını artırabilirsiniz. İkamet periton makrofajlar ayrılmış olabilir olmadan thioglycolate ama alt ile makrofaj verir.
2. Yerel hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış bir yöntemi kullanarak fare anestezi. 1 mL % 3,5 thioglycolate orta fare periton boşluğuna 23 G iğne kullanarak 1 mL şırınga ile enjekte et.
   Not: Anestezi inducing, periton enjeksiyon kolayca gerçekleştirilebilir ve iğne ile neden iç organlarına yaralanma riskini azaltır.
3. Fare ile su ve yiyecek ad libitum 3 gün boyunca korumak. Hayvan vücut ağırlığı ve gıda alımı her gün izlemek. Vücut kilo kaybı 3 gün içinde 10 %'den büyük ise, hayvan deneyden hariç.
4. 3 gün sonra hızla sevoflurane kapalı bir kutu içinde tarafından anestezi inducing sonra servikal çıkığı tarafından fare ötenazi. Alternatif olarak, fare ötenazi yapmak yerel hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir yöntemi kullanın.
5. Sterilize etmek için % 75 etanol ile fare (10 cm çaplı) bir çanak içine koymak ve hızlı bir şekilde başlık için transfer. Fareyi bir tabağa yerleştirin ve farenin konumunu düzeltmek için yönetim kurulu için ön pençe pin.
6. Bir 20 G bağlı 5 mL şırınga kullanarak iğne iğne eğimi 30 ° - 40 ° açıyla yerleştirilmesi, 5 mL soğuk (4-10 ° C) fosfat tamponlu tuz (PBS) alt karın fare periton boşluğuna, bağırsak delinme kaçınarak enjekte et. Bağırsak (veya herhangi bir diğer organ) delinmiş, bu birincil hücre kültürü için uygun olmayan hücreler etkinleştirmek gibi fare ile hücreler artık deneyler için kullanılabilir.
7. Hafif bir masaj fare karın iki kenarı da gerçekleştirin. Sonra yavaşça ve yavaş yavaş sıvı Aspire edin. Peritoneal sıvı bir 50 mL santrifüj tüpüne dağıtmak. Bunlar 2 x veya 3 x adımları yineleyin.
8. Askıya alınan hücreler için Soğutmalı Santrifüj (4-8 ° C) 400 x g , 10 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve hücre Pelet RPMI 1640 orta % 10 fetal Sığır serum (FBS) ile resuspend. Hücreleri saymak. Hücreleri 10 mL orta resuspended zaman ampirik olarak, hücre yoğunluğu yaklaşık 5 x 10⁶ hücre/mL için eşittir.
9. 6-şey plaka akış sitometresi tahlil ve floresan mikroskop için 24-şey plaka kuyuya başına 5 x 10⁵ hücre için her kuyuya 5 x 10⁶ hücreler ekleyebilirsiniz. %5 CO₂ kuluçka 37 ° C'de hücreler gecede kültür. Kültür orta çünkü en-in bunlar lenfositleri nonadherent hücre kaldırmak için 3 saat sonra yenilenmesi. Esas olarak makrofajlar yapisan hücrelerdir ve de doku kültürü tedavi edilen plastik için uygun.

3. makrofaj fagositoz tahlil floresan mikroskop kullanarak

1. Hücreleri hücre canlılık ve hücre yoğunluğu değerlendirmek için bir alan parlak mikroskop altında gözlemlemek.
2. Kültür orta 24-şey plaka kaldırın. Tablo 1' de açıklandığı gibi her kuyuya 100 µL taze kültür ortamının ve bakteriyel süspansiyon (yaklaşık 2 x 10⁷ hücreleri), 10 µL ekleyin. Bir 37 ° C'de % 5 CO₂ kuluçka 1 h için kuluçkaya.
3. Yavaşça noninternalized bakterileri yıkamak için iyi başına 3 x-5 x 500 µL soğuk PBS ile yıkayın.
4. PBS içinde % 4 formaldehit, oda sıcaklığında 30 dk için hücrelerle kuluçkaya.
5. Sabit hücreleri 3 yıkama x PBS ile (500 µL/de).
6. Phalloidin 633 floresans 200 µL boya konjuge çalışma çözüm ekleyin (F-aktin leke Malzemeler tablobkz:). Bir yerde saklayın karanlık, nemli (% 60-%80) 60 dakika süreyle oda sıcaklığında durulama hücreleri 3 x PBS ile (500 µL/herhangi bir aşırı phalloidin kaldırmak için de). F-aktin boyama tarafından sitoplazma özetlenen ve içselleştirilmiş bakteri ayırt etmek için yardımcı olur.
7. Hücre çekirdeği leke ve oda sıcaklığında karanlık, nemli bir yerde 5 min için kuluçkaya için DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) çalışma çözüm (1 µg/mL) 200 µL ekleyin. 1 x PBS ile yıkayın (500 µL/de) ve aynı birimin distile su ile 1 x. Sonra hücreleri bir ters floresan mikroskop altında gözlem için hazır olacak.

4. makrofaj fagositoz tahlil akış sitometresi kullanarak

1. Deneysel hatalarını en aza indirmek ve sonuçları doğru biçimde yorumlayabilmek yapmak, gruplarını ayarlamak ve tüpler deneme için Tablo 2' de listelenen denetlemek için.
   1. Kontrol grubu için hangi buz ( Tablo 2Grup 4) üzerinde yer alacak, orta 6-şey plaka çıkarın ve temizleyin PBS ile 1 x. Daha sonra 1 mL soğuk 70 mM EDTA hücreleri ayırmak ve akış sitometresi tüp aktarmak için kuyunun içine ekleyin. Bakteriyel süspansiyon 50 µL tüpün içine ekleyin ve buz 1 h için yerleştirin.
   2. Diğer grupları için kültür orta kaldırın. 1 mL taze orta her kuyunun içine ekleyin. Bakteriyel süspansiyon 50 µL içine kuyu grubu ayarına göre Tablo 2' de açıklandığı gibi ekleyin. O zaman, 37 ° C'de % 5 CO₂ kuluçka 1 h için 6-şey plaka yer.
2. Floresan noninternalized E. coligidermek için 200 µL % 0.8 kristal violet (CV) su çözüm kuyunun içine ekleyin ve kısa bir süre, böylece bir yanlış pozitif sonuç yüzeyine EGFP ifade E. coli bağlama tarafından kaçınarak sway makrofajlar ama değil içselleştirilmiş. 3 hücreleri yıkama x herhangi bir kalıntı CV kaldırmak için PBS ile.
3. Daha sonra 1 mL soğuk 70 mM EDTA hücreleri ayırmak ve akış sitometresi tüp aktarmak için kuyunun içine ekleyin.
4. 400 x g 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
5. PBS hücreleri resuspend 100 µL ekleyin. F4/80-PE-Birleşik antikor (fare makrofajlar ifade bir yüzey antijeni) 5 µL grubu ayarına göre tüpler veya kullanım Igg2a-PE izotip, ekleyin. Kısaca girdap ve 5-10dk karanlıkta buz üzerinde örnekleri kuluçkaya.
6. PBS 1 mL her tüpün içine ekleyin ve 5 dakika süreyle 400 x g , santrifüj süpernatant atın. Hücre topakları PBS Akış Sitometresi Analizi için 200-300 µL ile resuspend. Her tüpün çalıştırın ve en az 10,000 olayları F4/80⁺ hücre için veri elde etmek.

Evde beslenen hayvan-SUMO vektör yerli protein ifade E. coliizin vermek için küçük bir Ubikuitin benzeri değiştirici kullanır. SUMO füzyon kolayca algılanabilmesini sağlayan EGFP çözünürlük önemli ölçüde artırılabilir. EGFP ifade başarıyla laktoz tarafından indüklenen, yeşil kolonileri karanlıkta (Şekil 1A) görülebilir. E. coliEGFP ifade temsil, yeşil noktalar 40 x objektif lens (Şekil 1B) kullanarak bir floresan mikroskop altında görülebilir.

Mikroskopi analiz floresans görüntüleri (Şekil 1 c) genç ve yaşlı gruplardan periton makrofajlar gösterir. Şekil 1 c F-aktin, EGFP ifade E. coliyeşil floresan, DAPI nükleer boyama mavi floresans ve tüm üç floresans kanal birleştirilen görüntüyü kırmızı floresans gösterir. Yaşlı fareler kabul edildi, 16 aylık farelerin 60 - 65--yaş insan eşdeğer. Bu görüntüleri makrofajlar genç fareler gelen yaşlı fareler gelen bu güçlü bir fagositoz yetenek sunulan öneririz.

Akış Sitometresi (Şekil 2) ölçmek ve makrofaj fagositoz genç ve yaşlı grubundan karşılaştırmak için kullanıldı. Şekil 2A Genç, Yaşlı ve kontrol grubu temsilcisi akış sitometresi analizini gösterir. F4/80-PE antikor belirlemek ve makrofajlar kapısı kullanıldı ve EGFP pozitif sinyaller bu E. colifagosite makrofaj gösterir. F4/80+ ve EGFP+ hücreler oranını belirtmek makrofajlar fagositik yeteneği. Genç Grup (Şekil 2B) sonucu olduğunu b.7 ± %5.1 (ortalama ± SEM), hangi 5,2 ± %2.9 yaşlı grubunun (ortalama ± SEM) önemli ölçüde daha yüksek. Bu sonuçlar floresan mikroskopi sonuçları trend ile tutarlıdır.

Resim 1 : EGFP ifade E. coli ve makrofajlar tarafından onun fagositoz. (A)EGFP ifade e.coli kolonileri. Evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP plazmid BL21(DE) hücrelere dönüştü; bakteri bir LB-sefaloridin (100 µg/mL) plaka üzerinde aşılanmış. 0.5 mmol/L laktoz LB plaka yüzeyi ile bir kaplama EGFP ifade verimli uyarıcı kullanıldı. Eğer EGFP başarılı bir şekilde ifade, sarımsı yeşil kolonileri UV karanlıkta ışık kullanarak gözlenir. (B) floresan mikroskopi E. coliEGFP ifade etmek. Yeşil sinyal E. coliEGFP ifade temsil eder. Ölçek çubuğu = 50 µm. (C) çok kanallı floresans resimleri, E. coliphagocytosing makrofajlar. Hücreleri bir yıkama ile PBS, fiksasyon ile % 4 paraformaldehyde, arkasından ve F-aktin için boyama EGFP ifade E. coli (yeşil) için 1 h ile inkübe phalloidin 633 eşlenik çalışma çözüm (kırmızı) ve DAPI (mavi) kullanarak. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Akış sitometresi sonuçları. Genç, Yaşlı ve kontrol grubu(a)temsilcisi Akış Sitometresi Analizi. Periton makrofajlar F4/80-PE ile E. coliEGFP ifade ile coincubation sonra lekeli. F4/80+ ve EGFP+ hücreleri olumsuz nadir ve denetimi (Grup 4: buz üstünde genç grup) gruplar. Genç ve yaşlı akış sitometrik araziler sırasıyla 5 ve 6, grupları temsil eder. (B) genç ve yaşlı gruplarının Akış Sitometresi Analizi sonuçları. Mann-Whitney test bu iki grup arasındaki fark incelemek için kullanıldı. F4/80+ ve Genç Grup EGFP+ hücrelerinin oranını önemli ölçüde bu yaş grubunda daha yüksek (*P < 0,05). Hata çubukları standart hata ortalamaya (SEM) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Grup ayarı floresans mikroskobu. İki grup, yaşlı grubu (16 aylık C57BL/6, n = 3) ve Genç Grup (8 haftalık C57BL/6, n = 3), periton makrofajlar hazırlamak için kullanıldı. Her fare peritoneal makrofajlar wells ayırmak için eklenmiştir. 100 µL hacmi yaklaşık 2 x 105 hücreleri olduklarını da sözlerine ekledi için her şey; sonra yaklaşık 2 x 107 E. coli EGFP ifade hücreleri 10 µL bir birimdeki her iyi ve 37 ° C'de 1 h için coincubated için eklenmiştir

Tablo 2: Grup ayarı için akış sitometresi. Genç ve yaşlı fareler gelen birincil periton makrofajlar altı grupları olarak belirlenmiştir. Grup 1 izotip kontrol kuruldu; Grup 2 ve 3 PE veya EGFP kanal için tek pozitif kontrol olarak anılan sıraya göre belirlenmiştir. İçselleştirilmiş floresans fagositoz için belirli olduğundan emin olmak için Grup 4 buza inkübe. Fagositoz buza düşük sıcaklık nedeniyle durduruldu. Tüm gruplar için 1 h kuluçka zamandı.

Yazarlar ifşa gerek yok.