Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

5.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58753

⸱

22 Ocak 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne

Bu makalede

Özet

HIV verimli yeniden etkinleştirme işlev değerlendirmesi ve gizli proviruses boşluk için yüksek aktarım protokolü açıklanan ve müdahaleler HIV transkripsiyon üzerinde etkisini test ve yapıştırma uygulanır. Soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara geri ve yapıştırma gecikme etkisi temsilcisi sonuçları sağlanır.

Özet

HIV istikrarlı ve gizli virüs formu, bağışıklık sistemi için görünmez kalır ve geçerli antiretroviral tedavi (sepeti) tarafından hedeflenen değil, limanlar bir rezervuar hücrelerin varlığı nedeniyle çaresiz kalır. Transkripsiyon ve yapıştırma CD4 + T hücreleri dinlenme içinde HIV-1 gecikme güçlendirmek için gösterilmiştir. Gecikme süresi gecikme süresi ters ajanlar (LRAs) "şok ve öldürmek" yaklaşımı kullanılarak iptali kapsamlı bir girişim bu rezervuar temizlemek için eğitim gördü ama şu ana kadar herhangi bir başarı yeterli küçük gelişim eksikliği nedeniyle klinik çalışmalarda gösterilmemiştir verimli bir şekilde bu rezervuar huzursuz molekülleri. Burada sunulan Protokolü güvenilir ve verimli bir şekilde gecikme süresi ters ajanlar (LRAs) HIV transkripsiyon değerlendirilmesi ve yapıştırma için bir yöntem sağlar. Bu yaklaşım aynı anda transkripsiyon ve yapıştırma bir LRA etkisi ölçebilen bir soldan sağa dayalı çift renk muhabir kullanımı akış sitometresi tarafından temel alır. Burada açıklanan protokol yapışık hücreleri gibi süspansiyon hücrelerde için yeterlidir. Çok sayıda uyuşturucu yüksek üretilen iş sisteminde test etmek için kullanışlıdır. Teknik olarak uygulamak basit ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Buna ek olarak, akış sitometresi kullanımı hücre canlılığı değerlendirmesini sağlar ve böylece ilaç toksisitesi vasıl ayni zaman.

Giriş

Etkili uzun vadeli antiretroviral tedavi rağmen HIV bellekte CD4 + T hücreleri1tümleşik bir provirus olarak gizli bir durumda kalır. HIV-1 5 kromatin yapısı ' uzun terminal tekrar (LTR) organizatörü ve histon metilasyonu ve DNA methyltransferases (DNMT) ve histon uyku (HDAC) tarafından deasetilasyonu gibi epigenetik değişiklikleri önde gelen önemli mekanizmalar vardır Transkripsiyon baskı ve böylece sonrası entegrasyon gecikme süresi2,3. Gecikme süresi ters kayıt ajanlar (LRAs), büyük bir çeşitlilik virüs üretim tüp bebek ikna etmek onların etkinliği araştırıldı ve üzerinden vivo gizlice enfekte dinlenme CD4 + T hücreleri4,5,6,7 ,8. LRAs arasında test, HDACi (HDAC inhibitörleri) ve bahis bromodomain inhibitörleri (BETis) kromatin decondensation ve serbest bırakmak-in olumlu transkripsiyon uzama faktörü b (P-TEFb) sırasıyla neden, sonraki lider rahatlatmak transkripsiyon baskı, 5' soldan sağa ve HIV ifade9,10,11,12,13aktivasyonu. Ancak, bu LRAs tarafından elde reaktivasyonu büyüklüğü ex vivo14,15hücre ilişkilendirilmiş unspliced HIV mRNA (RNA) bize, viral transkripsiyonu, gösterge mütevazı bir artış gözlenmiştir sınırlı oldu. Önemlisi, bu LRAs de gizlice enfekte hücreleri sıklığı bir azalma neden başarısız oldu.

HIV ifade daha verimsiz alışılageldik16 yanı sıra çarpın spliced HIV RNA (MS RNA)17nükleer dışa aktarma hataları tarafından kısıtlanabilir. Böylece, daha güçlü ve farklı yönlerini virüs üretim sonrası entegrasyon etkileyebilir LRAs tanımlayıcı yeni sınıflar ihtiyaç vardır. Buna ek olarak, verimli bir şekilde gecikme süresi tersine çevirmek için en uygun bileşikler tanımlama yardım roman deneyleri geliştirilmesi gereklidir.

Burada, hangi yüksek üretilen iş yaklaşımı HIV LTR tahrik transkripsiyon ve yapıştırma müdahalelerin etkisi işlevsel değerlendirme için kullanan bir iletişim kuralı sunulur. Kısaca, yeni bir soldan sağa dayalı çift renk muhabir sistem pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Şekil 1) akış sitometresi tarafından HIV reaktivasyonu değerlendirmek için kullanılır. Spliced mRNA (2 kb) ifade Discosoma sp. kırmızı (DsRed) Floresan protein ifade için yol açacak iken bu floresan muhabiri, gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ifade için ifade unspliced HIV mRNA (4 kb) yol açar. Kısaca, biz bir floresan Env-EGFP füzyon protein, gp140unc kullanılır. EGFP, EGFP kodlama dizisi çerçeve ile un cleaved ve kesilmiş bir zarf (Env) şeklinde yerleştirildiği. Değişiklikleri Env ayrılma gp120 ve gp41-EGFP önlenmesi bölünme site ablate ve gp160 protein doğru katlanır kolaylaştırır bir çözünür Env analog oluşturma transmembran etki alanı önce kesecek şekilde tanıtıldı ve EGFP ifadesidir. İfade bir hücre içinde nerede 4 kb env sitoplazmik nükleer ihracat aracılık çekirdeği Rev yerelleştirir mRNA devir duyarlı öğesi (RRE) ile etkileşim ile. Env kesilmesi gp120 ve gp41 ve A7 3' splice sitesi arasında yatıyor RRE ödün vermeyen. Bu sistemde HIV-1'ın porno versiyonunu donör 4 (SD4) splice ve alıcısı 7 (SA7) splice sonuçları 2 kb üretiminde bir işlevsel olmayan Rev proteinin amino asit 38 kesildi kodlama mRNA erimiş DsRed floresan protein, RevΔ38-DsRed. Kısaca, DsRed, örtüşme uzantısı18tarafından Rev 2nd exon amino asit 38, içine eklenmiştir. Unspliced mRNA nükleer ihracat kolaylaştırmak için Rev (pCMV-RevNL4.3) kodlama bir memeli ifade vektör floresan muhabir yapı (Şekil 2) ile birlikte transfected. Burada açıklanan bu benzersiz muhabir yapı yüksek üretilen iş değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma, ezelî belgili tanımlık lüzum için viral vektörü yararlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: Klonlama için dönüştürme ve sıralama işlemleri başka bir yerde ele18,19. İletişim kuralları burada memeli ifade vektörel çizimler (Şekil 3) transfection başlar.

1. transfection HEK293T hücre çift renk Reporter ile inşa

  1. Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) ile % 10 (v/v) fetal Sığır serum (FBS), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 μg/mL) % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de takıma hücrelerde HEK293T yetiştirmek Çözdürme sonra 2 - 3 kez transfection içinde onları kullanmadan önce geçiş HEK293T hücre deneyleri. Bu hücreler zaman çözülme yordamdan geri verecek.
    Uyarı: Hücre kültürleri Mikoplazma kirlenme ciddi bir sorun olmaya devam etmektedir. İyi laboratuar uygulaması ve hücre kültürleri rutin test Mikoplazma bulaşma riskini azaltmak ve difüzyon20önlemek için gereklidir.
  2. 1:2 bir gün önce Tohum hücreleri bölme ve taze DMEM orta aktarabilirsiniz. 24 h 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için hücreleri yetiştirmek
  3. Transfection, önceki gün Orta balonun aspirasyon tarafından kaldırmak ve serum izlerini kaldırmak için Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) çözüm kalsiyum (Ca2 +) ve magnezyum (Mg2 +) ücretsiz hücrelerle yıkayın.
  4. 5 mL tripsin-EDTA çözeltisi (% 0.05-10 mM PBS) kültür damar dağıtmak ve 37 ° c % 5 CO2 kuluçka 2-5 dakika yerleştirin.
  5. Hücreler ayrılır, 5 mL (v/v) FBS % 10 ile desteklenmiş DMEM daha fazla hücreleri zarar verebilir tripsin faaliyetle etkisizleştirmek için de ekleyin.
  6. Yavaşça yukarı ve aşağı kümeleri kırmak için hücre süspansiyon pipetting tarafından resuspend.
  7. Hücreleri 1:10 trypan mavi leke (% 0,4) oranında seyreltin.
  8. Trypan istimal mikroskop (10 x amaç) ve bir haemocytometer mavi yapmayız canlı hücreleri saymak.
  9. Hücre sayısı ortalamasını alarak ve 10.000 tarafından çarpmadan mililitre başına hücrelerin sayısını hesaplamak ve mavi trypan elde edilen seyreltme faktörü (1:10) tarafından leke.
  10. 2 x 104 DMEM orta % 10 ile desteklenmiş 100 μL hücrelerde plaka FBS 96-şey düz-alt plaka 24 h için antibiyotik olmadan.
  11. Her şey için 400 seyreltik pLTR.gp140/EGFP ng. RevD38/DsRed, 20 pCMV-RevNL4.3 ve 100 ng ng pCMV-Tat101AD8-bayrak DNA serum ücretsiz orta 50 μL '. Hafifçe karıştırın. Tat olmadan deneyler için bir eşleşen boş Tat vektör pcDNA3.1 (-) kullanın.
    Not: Endotoksin içermeyen DNA kullanımı önerilir. Bunun için DNA'sı endotoksin-Alerjik bir MIDI veya maxiprep nükleik asit arıtma kit kullanarak hazırlayın. DNA saflık 1.7 ve 1,9 arasında olmalıdır 260/280 OD oranı ölçerek belirlemek.
  12. Lipid reaktif kullanmadan önce hafifçe karıştırın, sonra serum ücretsiz orta 50 μL 0.65 μL oranında seyreltin. Karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  13. Seyreltilmiş DNA ile seyreltilmiş lipid reaktif birleştirin.
  14. Karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Çözüm bulutlu görünebilir.
    Not: 1,15 adıma geçin. 30 dk içinde.
  15. Lipid reaktif-DNA komplekslerinde drop-wise hücreleri üzerine kuyu başına 100 μL dağıtmak.
  16. Karışımı yavaşça ileri geri plaka Rock yaparak.
  17. Bir % 5 CO2 oksijen kuluçka 37 ° C'de 5 h plaka kuluçkaya
    1. Her reaksiyon karışımı bir tek şey (96-de) transfection için yeterlidir. Miktar ve birim uyuşturucu ve test edileceğini kombinasyonu sayısına göre bileşenlerinin ve hesaplar pipetting çeşitleri için ayarlayın. Tüm koşulları genellikle triplicates test edilmektedir.
    2. Ek wells 100 ile transfect EGFP ve DsRed-Express DNA plazmid CMV dayalı tazminat amaçlar için ng.

2. Transfected HEK293T tedavisinde ajanları geri gecikme süresi ile hücreleri

Not: Her tahlil önce hücre proliferasyonu tahlil ile ilacın yüksek ve düşük dozda maruz kaldıktan sonra hücrelerin canlılık ölçerek her LRA fizyolojik durumunu belirlemek.

  1. Her LRA büyüme orta ile uygun çalışma konsantrasyonu seyreltik (örneğin, JQ1(+)) için 1 mikron.
    Uyarı: 10 mM bir konsantrasyon için uygun solvent lyophilized ilaçlarla sulandırmak. Tüm hisse senedi LRAs-80 ° C'de bir kişilik aliquot (5 μL her) tekrar tekrar donma-çözülme döngüsü önlemek için saklayın.
  2. Dikkatle transfection orta bir çok kanallı ile Aspire edin ve uygun LRA (Tablo 1) içeren 100 μL orta ile değiştirin. Orta çok yavaşça yanında kültür plaka yüzeyinden kolayca ayırmak için bilinen transfected HEK293T hücreleri ayırma önlemek için kuyu duvarı ekleyin.
  3. Bir % 5 CO2 oksijen kuluçka 37 ° C'de 48 h plaka kuluçkaya

3. Akış Sitometresi Analizi için tamir edilebilir canlılığı boya ile Transfected hücre boyama

Uyarı: Ölü hücreleri ve enkaz kaldırma, yanlış pozitif ortadan kaldırmak ve en yüksek kalitede sonuçlar elde etmek için önemlidir.

  1. Hücreleri iyi ücret ve yavaşça (~ 5 kere) ile bir çok kanallı, medya renginde solma kaçınırken alçalarak pipetting tarafından 100 μL fosfat tamponlu tuz (PBS) kullanarak ortamın içine bağlantısını kesin. Gerekirse, tripsin-EDTA çözüm (% 0.05-10 mM PBS) kuyu başına 35 µL kullanarak ve serum içeren orta ile nötralize daha önce 37 ° C'de 5 dk kuluçka plaka hücrelerden bağlantısını kesin.
  2. Hücreleri bir 96-şey V-alt plaka aktarın.
  3. 500 x g 4 ° c de 5 min için hücreleri spin sonra dikkatli bir şekilde orta/PBS hücreleri dokunmadan Aspire edin.
  4. Hücrelerin protein/serum ücretsiz PBS 200 μL ile en az 1 kez yıkayın.
  5. 500 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi sonra plaka devirme ve yıkama arabellek hücreleri dokunmadan kaldırarak süpernatant atmak.
  6. Tamir edilebilir canlılığı boya çalışan bir çözüm canlılığı boya 1: 1000 olarak protein/serum ücretsiz PBS sulandrarak hazırlayın. Seyreltilmiş leke şey başına 50 µL hazırlayın.
    Not: Canlılığı boya renkleri mavi, kırmızı ve mor lazerler ile kullanım için uygun bir dizi mevcuttur. Lyophilized boya (a bileşeni) 50 μL susuz DMSO (bileşen B) ile bir şişe resuspending tarafından tamir edilebilir canlılığı boya stok çözeltisi hazırlayın. Tek Kişilik Kullanım aliquot (1 μL her),-20 ° C'de mağazasında korumalı gelen ışık.
  7. 50 μL seyreltilmiş canlılığı boya, her şey için ve yukarı ve aşağı ile çok kanallı pipetting tarafından hücreleri karıştırın.
  8. Leke ışıktan korunan 4 ° C'de 10-15 dk için.
  9. 1 - 2 kez 150 μL yıkama arabelleği (PBS % 1 sığır serum albümin ve 2 mM EDTA ile) yıkayın.
  10. 4 ° C'de 5 min için 500 x g , santrifüj Süpernatant atmak.
  11. Hücreleri 100 μL için 10-15 dk içinde belgili tanımlık karanlık 4 ° C'de yıkama arabellekte taze olarak hazırlanan % 1 formaldehit ile düzeltmek.
    Uyarı: Formaldehit çok toksiktir. % 1 formaldehit çözümde bir duman hood eldiven ve koruyucu gözlük koruma için giyen süre teneffüs önlemek için hazırlayın.
  12. 1 - 2 kez 100 μL yıkama arabelleği içeren hücreleri yıkayın.
  13. 4 ° C'de 5 min için 500 x g , santrifüj Süpernatant atmak.
  14. Hücre Pelet yıkama arabellek 70 μL içinde resuspend.
    Not: Protokol burada duraklatılmış. Sabit hücre analizi için karanlıkta 4 ° C'de akış sitometresi ertesi gün saklanan olabilir.

4. EGFP ve DsRed ölçümleri akış sitometresi ve veri analizi

Not: HIV Transkripsiyon (% EGFP) ve yapıştırma (% DsRed) bir akış sitometresi analiz. Örnek çalışma bir 70 mikron hücre-süzgeç veya meme kadar tıkanma önlemek için 100 mikron naylon mesh ile önce filtre.

  1. Başlamak yukarıya belgili tanımlık Sitometresi ve bilgisayar en az 10 dk lazerler ısınmak sağlamak için kullanmadan önce.
  2. Örnekleri çalışan ve veri toplama başlıyor önce kılıf tank % 0,9 serum fizyolojik çözüm ile doldurun ve sodyum hipoklorit tablet atık deposuna eklenir emin olun.
  3. Akışı hücre hava kabarcık açısından kontrol edin.
  4. Dedektörleri ve filtreler denemenin uygun olduğundan emin olun.
    Not: EGFP için mavi lazer kullanın (488 nm) ve 530/30 bant, DsRed Express sarı lazer kullanarak en iyi şekilde tespit ederken (561 nm) ve 610/20 bant. Mavi lazer (488 nm) ve 610/20 bant DsRed ifade tespit etmek için de kullanılabilir.
  5. Sitometresi performans ve duyarlılık dedektörleri arasında kalibrasyon boncuk çalıştırarak olup olmadığını denetleyin.
  6. İleri ayarlamak (FSC-A) ve yan (SSC-A) dağılım gerilimleri ile günahı örnek böylece ana nüfus ekran ve açıkça discernable.
    Not: FSC (ileri dağınık ışık) olan bir ölçüm ışığın kırınım (yan-ışık dağınık) SSC süre (hücre yüzey alanı veya boyutu), hücre hacmi bağlıdır düz bir açıda ışık kırınım orantılıdır bir dik açı ölçüsü olduğunu hücre parçalı yapı ve iç karmaşıklığı.
  7. El ile veya otomatik tazminat nüfusunun EGFP + DsRed dedektörü ve tersi içine en az yayılma sağlanması tek lekeli örnekleri kullanarak gerçekleştirin.
    Uyarı: Tazminat nedeniyle, her tek renkli floresan protein hem de tek başına tamir edilebilir canlılığı boya ile lekeli hücreleri ifade hücreleri bir örneğini kullanın. EGFP ve DsRed floresan proteinler tazminatlar farklı spektral özellikleri nedeniyle FITC ve PE tazminat boncuk kullanın. Tazminat kontrolleri pozitif ve negatif nüfus gidermek için parlak olmalıdır.
  8. Araziler oluşturun ve kapıları floresans eksi bir (FMO) denetimleri kullanarak ayarlayın.
  9. Elde ve en az 10,000 uygun hücre olayları örnek başına kayıt. Lazer kesme noktası geçen birini önlemek için orta veya düşük hızda örnekleri çalıştırmak. Nabız gibi geometri Perdeleme kullanın SSC-A birini ortadan kaldırmak için SSC-H karşı. İstikrar kontrol zaman SSC-A karşı komplo tarafından çalışmanın nasıl bile akışı çalışma sırasında görmektir.
  10. Çalışma sonunda, akış sitometresi akışkanlar konsantre temizlik maddeleri ile temizlik sonra 5 dk her su.
  11. Kapatma sistemi, atık atmak ve kılıf tank Alım sonra yeniden doldurun.
  12. Bir akış sitometresi veri analizi yazılım kullanarak veri analiz. Hücre artıkları ve ön ve yan dağılım göre yığın (birini) hariç, o zaman canlılık boya leke kullanarak ölü hücreleri ortadan kaldırmak (negatif nüfus = canlı hücre). Spliced ürün DsRed yüzde yanı sıra EGFP ve DsRed (Şekil 4), ifade hücreleri tanımlamak /(DsRed + EGFP) (Şekil 5).
  13. Ira etkisi HIV transkripsiyon ve tedavi edilmezse hücreleri ve birey veya LRAs (Şekil 5) bir arada maruz hücreleri karşılaştırarak Uçbirleştirme belirlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ifade HIV-1'in (EGFP) unspliced ve (DsRed) ürünleri tedavi bromodomain inhibitörü JQ1 ile aşağıdaki spliced temsilcisi sonuçları Şekil 5 ' te gösterilmiştir. JQ1(+) ve Tat önemli ölçüde arttı EGFP ifade hücre yüzdesi (2,18 ve 4.13 FC DMSO üzerinde sırasıyla; n = 3) unspliced transkript göstergesidir. Ayrıca, JQ1(+) önemli ölçüde spliced ürün (DMSO üzerinde 7.37 FC) Tat olarak benzer bir seviyeye oranının yanı sıra DsRed (DMSO üzerinde 46.6 FC) ifade hücre yüz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Virüs reaktivasyonu ex vivo ölçme zorluk göz önüne alındığında, çok çeşitli modelleri HIV gecikme gizlice dahil olmak üzere çalışma için zaman içinde geliştirilen vitro olarak T hücre-hatları (J Latı, ACH2, U1), temel model istirahat (latent enfeksiyon bulaşmış O'Doherty, Lewin, Greene ve Spina modelleri) ya da pre-harekete geçirmek CD4 + T hücreleri (sanane, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modelleri) tek yuvarlak veya çoğaltma yetkili gazeteci virüsler ile22. Fizyolojik şartlarda CD4 + T hücre...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser proje desteği APP1129320 ve programı hibe APP1052979 Avustralya NHMRC tarafından desteklenmiştir. Biz Dr Adam Wheatley, Doktor Marina Alexander, Dr Jenny L. Anderson ve Michelle Y. Lee temel yapıları ve tavsiye Bu eser başarıyla tamamlanması için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz de DMI akış olanağı personel onların tavsiye ve bu çalışmada kullanılan akış sitometresi korumak cömert yardım için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

NL4.3
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre kültürü
HEK293T hücreleri (İnsan Embriyonik Böbrek hücreleri)ATCCCRL-3216SV40 replikasyon bölgesini taşıyan vektörleri çoğaltır.
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)Gibco10569-010+ 4.5 g / L D-Glikoz + 110 mg / L Sodyum Pirüvat
Fetal Sığır serumuGibco10099-141Menşei Avustralya
Penisilin-StreptomisinSigmaP4458
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS), kalsiyum yok, magnezyum yokGibco14190-136
Tripan mavisi Leke, %0,4Gibco15250
Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızısıGibco25300054
Lipofektamin 2000Invitrogen11668-019Lipid transfeksiyon reaktifi
Opti-MEM I (1x) indirgenmiş serum ortamıGibco31985-070Serum içermeyen orta
NucleoBond Xtra MaxiMarcherey-Nagel740414.50
pEGFP-N1 plazmidClontech (TaKaRa)6085-1Memeli hücrelerinde EGFP ekspresyonu, CMVIE promotörü.
pDsRed-Express-N1Clontech (TaKaRa)632429Memeli hücrelerinde DsRed-Express ekspresyonu, CMVIE promotörü.
pLTR.gp140/EGFP (İngilizce).
pCMV-Tat101AD8-FlagAddgene115777
Dimetil sülfoksit (DMSO)Millipore67-68-5
JQ1(+)Cayman Chemical11187DMSO'da 10 mM'de stok; çalışma konsantrasyonu 1 & mu; M
JQ1 (-)Cayman Chemical11232DMSO'da 10 mM'de stok; çalışma konsantrasyonu 1 & mu; M
Phorbol Myristat Asetat (PMA)Sigma-Aldrich16561-29-8Hisse Senedi 100 &mu'da; DMSO'da g/mL; çalışma konsantrasyonu 10 nM
Fitohaemaglutinin (PHA)RemelHA15 / R308527011 &mu'da stok; g/μ PBS'de L; Çalışma konsantrasyonu 10 & mu; g/mL
Vorinostat (VOR)Cayman Chemical10009929DMSO'da 10 mM'de stok; Çalışma konsantrasyonu 0.5 & mu; M
Panobinostat (PAN)TRCP180500DMSO'da 10 mM'de stok; çalışma konsantrasyonu 30 nM
CellTiter 96 AQueous Tek Çözelti Hücre Proliferasyon TestiPromega63581
Venor GeM ClassicMinerva Biolabs11-1100Mikoplazma Tespit Kiti, PCR tabanlı
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Flow sitometri reaktifleri
LSR FortessaBD BiosciencesFlow sitometre (4 lazer-mavi, kırmızı, mor ve sarı)
LSR IIBD BiosciencesFlow sitometre (3 lazer-mavi, kırmızı ve mor)
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Yakın IR Ölü Hücre Leke KitiYaşam TeknolojileriL34976Canlılık boyası: 633 veya 635 nm uyarma için, 400 tahlil. Bileşen A ve B'nin her ikisi de kitte bulunur.
Sığır SerumuAlbümin SigmaA2153
EDTA 0.5M pH8Gibco15575-038
Formaldehit Çözeltisi 37/10 (% 37)Chem-SupplyFA010
BD FACS Diva CS& T Araştırma BoncuklarıBD Biosciences655050Kalibrasyon boncukları
Sphero Gökkuşağı Kalibrasyon Parçacıkları (8 tepe)BD Biosciences5591233.0 - 3.4 mm
Kılıf çözeltisiChem-SupplySA04610 L suda 90 g NaCl
HAZ-TabsGuest MedicalH8801Dezenfeksiyon için klor salım tabletleri
Decon 90Decon Laboratories LimitedN/AAkış sitometresinin konsantre temizlik maddeleri. Çalışma çözümü Decon 90 %5.
Sodyum Hipoklorit (% 12-13 Çözelti)LabcoSODHYPO-5LAkış sitometresinin konsantre temizlik maddeleri. Çalışma çözeltisi ağartıcı% 1.
7xMPBioIM76670Akış sitometresinin konsantre temizlik maddeleri. Çalışma çözümü: 7x% 1.
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Materials
Doku kültürü şişeleri (75 cm2, eğimli boyun, kapak havalandırmalı)Corning430641U
Doku kültürü plakaları (96 kuyulu düz dipli kapaklı)Costar3599
Doku kültürü plakaları (96 kuyulu V-dip kapaksız)Costar3896
Santrifüj tüpleri (10 mL)SARSTEDT62.9924.284100x16 mm
Santrifüj tüpleri (50 mL)CellStar22726130x115 mm
Mikrosantrifüj tüpleri (1.5 mL)Corning AxygenMCT-150-C
Serolojik Pipet (25 mL), sterilCorningCLS4489-200EA
Serolojik Pipet (10 mL), sterilCorningCLS4488-200EA
Serolojik Pipet (5 mL), sterilCorningCLS4487-200EA
Reaktif rezervuarları (50 mL), sterilCorningCLS4470-200EA
5 mL Yuvarlak Tabanlı polistiren test tüpü, hücre süzgeç kapaklıCorning35223512 x 75 mm stil, 70 mm
Naylon MeshSEFAR03-100/32100 mm
Titertube Mikro test tüpleri, dökmeBIO-RAD2239391mikrofacs tüpleri
5 mL Yuvarlak Tabanlı polistiren test tüpü, kapaksızCorning35200812x75 mm stil 12x75
mm Test Tüpleri için Çıtçıtlı KapaklarCorning352032
Sayma odası, Neubauer geliştirilmiş çift net hükümdar, parlak çizgi (Hemositometre, LO-Laboroptik)ProSciTechSVZ4NIOU1 mm'lik 3x3 büyük kareler2; Derinlik 0.100 mm; hacim 0.1 mL; alan minimum 0,0025 mm2
lameller (Menzel-Glä ser)Grale ScientificHCS202620 x 26 mm
MikroskopNikon TMS310528
Santrifüj 5810R soğutmalıEppendorf5811000487rotorlu A-4-81, 15/50 mL konik tüpler için adaptörler dahil,
FLUOstar Omega mikroplaka okuyucuBMG Labtech, N/AHücre proliferasyon testi için plaka okuyucu. Filtre 490 nm.
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Softwares
FACS DivaBD BiosciencesFlow sitometre veri toplama ve analiz programı, sürüm 8.0.1
FlowJoFlowJoFlowJo 10.4.2Flow sitometre veri analiz programı, FlowJo Engine v3.05481
OmegaBMG LabtechFLUOstar çok kullanıcılı okuyucu kontrolü, sürüm 5.11
Omega - Veri AnaliziBMG LabtechMARSFLUOstar veri analizi, sürüm 3.20R2
Microsoft ExcelMicrosoftExcel:mac 2011sürüm 14.0.0
PrizmaGraphPadPrizma 7sürüm 7.0c
pCMV-RevAddgene 115775 115776 , ,

Kaynaklar

  1. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  2. Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
  3. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67(2013).
  4. Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
  5. Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
  6. Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
  7. Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
  8. Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
  9. Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
  10. Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
  11. Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
  12. Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
  13. Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071(2014).
  14. Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
  15. Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
  16. Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
  17. Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
  18. Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
  19. Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
  20. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
  21. Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36(2018).
  22. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  23. Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17(2014).
  24. Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
  25. Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955(2015).
  26. Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
  27. Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
  28. Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
  29. Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60(2011).
  30. Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
  31. Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
  32. Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
  33. Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
  34. Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
  35. Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  36. Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
  37. Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

HIV EklemeAk Sitometrisiift Renkli Raport rLTR ile Y netilen Raport rY ksek Kapasiteli TaramaH cre Canl l Analizila Toksisite De erlendirmesiHIV Latans
Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.