Yöntem makalesi

Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama

DOI:

10.3791/58758

⸱

19 Aralık 2018

 , 
1Reproductive Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (NIH)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz memeli iki-hibrid tahlil kullanarak 4-hidroksi-tamoxifen-bağımlı östrojen reseptör Alfa ligand bağlayıcı etki alanı dimerization etkinliğini analiz etmek için bir yöntem mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. ERα protein dizi türleri arasında son derece korunmuş. İnsan işlevinin ve fare ERαs aynı olduğunu düşündüm. Fare ve insan ERα ligand bağlayıcı etki (yakın) dimerization etkinliği memeli iki-hibrid (M2H) tahlil kullanarak fark 4-hidroksi-tamoxifen (4OHT) etkisi göstermektedir. M2H tahlil kullanan iki protein ifade plazmid (GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı [DBD] füzyon yakın ve VP16 transactivation etki alanı [VP16AD] füzyon yakın) transfection yakın homodimerization aktivite memeli hücrelerinde verimliliğini kanıtlamanın ve bir GAL4 duyarlı öğesi (GAL4RE) luciferase muhabir plazmid erimiş. GAL4DBD fusion yakın ve VP16AD füzyon yakın bir dimer hücrelerde yaptığınızda, bu protein kompleksi için GAL4RE bağlar ve sonra bir luciferase gen ekspresyonu VP16AD bağımlı transkripsiyonu faaliyetleri ile hiçbir devreye giriyor. 4OHT-aracılı luciferase harekete geçirmek fare ERα yakın füzyon protein ifade plazmid insan hücrelerinde ERα yakın füzyon protein ifade transfected plazmid ile transfected HepG2 hücreleri yüksektir. Bu sonuç 4OHT bağımlı fare ERα yakın homodimerization faaliyet etkinliği insan ERα yakın yüksek olduğunu göstermektedir. Genel olarak, M2H tahlil kullanımı agonistik ligandlar yakın etkinlik bazal düzeyini arttırmak ve bu yakın dimerization aktivite tespiti engellemektedir Çünkü nükleer reseptör yakın dimerization etkinlik, değerlendirme için ideal değildir. Bulduğumuz o 4OHT ERα yakın bazal etkinlik geliştirmez. Bu belirlemek ve M2H tahlil başarıyla kullanmak için 4OHT bağlı yakın dimerization aktivite tespit edememek için önemli bir faktördür. M2H deneyleri ERα yakın tabanlı kısmi agonist etkinliği seçici östrojen reseptör modülatörleri (Örneğin, 4OHT) ile çalışmaya çeşitli memeli hücre tiplerinde uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. Amino asit sequenceof ERα türler arasında son derece korunmuş. İnsan arasında daha yüksek Homoloji nedeniyle ve ERα fare, bu reseptörleri işlevini, aynı düşünce ve östrojenik maddeler (Örneğin, Tamoksifen) bu türlerin farklı etkinlik türün farklılıkları nedeniyle oluşur kimyasal metabolizmaları ERα yapısal farklılıklar tarafından değil. ERα son derece A F etki alanlarına belirlenmiş nükleer reseptör (NR) üst aile arasında yaygın etki alanı yapılarına korunmuş. E veya ligand bağlayıcı etki alanı (yakın)-ligand taşıması cep ve transkripsiyon aktivasyon fonksiyonu 2, içerir ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlanması plazmid memeli iki-hibrid tahlil için

  1. Aşağıdaki plazmid kullanın: pG5-Luc, pBIND-ERαEF ve Paktı-ERαEF.
    Not: Plazmid yazarlardan istek üzerine mevcuttur ve filtre kağıdı gönderilir. pG5-Luc duyarlı öğeleri luciferase ifade birimi (Şekil 1A) ile erimiş GAL4 beş tekrarlar içeren muhabir plazmid var. pBIND-ERαEF protein ifade plazmid ERα yakın GAL4DBD erimiş proteinler için var. pBIND-ERαEF bir Renilla luciferase ifade transfection verim (Şekil 1B) normalleştirme için içerir. Paktı-ERαEF protein ifade plazmid ERα yakın VP16AD erimiş proteinler (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 3 olası yanıtları düzeni kombinasyonu (i) ve kombinasyon (II) plazmid transfected hücreleri görüntüler. Deneysel sonuçları Şekil 4' te gösterilmiştir. Kombinasyon (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Paktı) faaliyet stimülasyon 10 tarafından gösteren nM E2 (Şekil 4A), ERα yakın ligand-bağımlı transactivation işlev etki alanı, AF-2 içerdiğinden. ERα yakın bağlar (Örneğin, E2) .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, ERα yakın homodimerization aktivite örnek olarak algılamak için tahlil koşullar odaklanan M2H tahlil için protokol açıkladığımız. Genel olarak, M2H tahlil ligand-bağımlı ERα yakın dimerization etkinlik değerlendirmesi için popüler değil. Bu ERα bir transkripsiyon etkinleştirme işlev sahip yakın nedeniyle. Hangi etkinlik rahatsız ediyor, bazı durumlarda, M2H tahlil sonuçları. Biz burada göstermek gibi ancak, M2H tahlil yakın (Örneğin, 4OHT, SERMs) AF-2 transactivation işlevi etkinleştirmezseniz belirli ma.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Drs. Sueyoshi ve Wang, Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) için el yazması ve Tanner Jefferson okuma kritik videoda yordamları gerçekleştirmek için teşekkür ederiz. Bu eser (adı için) Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 1ZIAES070065 NIEHS, Intramural araştırma bölümü tarafından desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pG5-LucPromegaE249ACheckMate Memeli İki Hibrit Sistemin Bileşeni
pBINDPromegaE245ACheckMate Memeli İki Hibrit Sistemin Bileşeni
pACTPromegaE246ACheckMate Memeli İki Hibrit Sistemin Bileşeni
Tek Atış TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coliInvitrogenC404010
Santrifüj RotoruSORVALL75006445
Döner KovalarSORVALL75006441
Hücre Yeniden Süspansiyon Çözeltisi (CRA)PromegaA7112
Hücre Lizis Çözeltisi (CLA)PromegaA7122
Nötralizasyon Çözeltisi (NSA)PromegaA7131
Kolon Yıkama Çözeltisi (CWB)PromegaA8102
Sihirbaz Midipreps DNA Saflaştırma ReçinesiPromegaA7701
Sihirbaz MidicolumnsPromegaA7651
MEM, glutamin yok, fenol kırmızısı yokGibco51200038
L-glutamin (200 mM)GibcoA2916801
%0.5 Tripsin-EDTA (10x)Gibco15400054
Penisilin-Streptomisin (100x)Sigma-AldrichP0781
BenchMark fetal sığır serumu (FBS)Gemini-Bio100-106Isı ile etkisiz hale getirilmiş
Kömür: dekstran sıyırma fetal sığır serumuGemini-Bio100-119Isı ile etkisiz hale getirilmiş
DMEM, yüksek glikoz, glutamin yok, fenol yokTransfeksiyon içinkırmızı Gibco31053028
Lipofectamine 2000Invitrogen11668027
Pasif Lizis 5X TamponPromegaE1941
Çift Lusiferaz Raportör Test SistemiPromegaE1980
SpectraMax L mikroplaka okuyucuMoleküler Cihazlar
SoftMax Pro YazılımıMoleküler Cihazlar

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
  2. Brzozowski, A. M., et al. Mo....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

4 Hidroksi TamoksifenLusiferaz Raporer PlazmidiGAL4 DNA Ba lanma AlanVP16 Transaktivasyon AlanHepG2 H creleriEstradiol TedavisiSelektif strojen Resept r Mod lat rleri

İlgili makaleler