Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma
Bu makalede
Özet
Özet
Hayatta kalmak için ve bir kez ökaryotik hücre içinde prolifere bakteriyel patojenler istihdam stratejileri çeşitli vardır. Sözde 'sitozolik' patojenler (Listeria Monositogenez, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, FRANCISELLA tularensisve Rickettsia'nin spp.) tarafından enfekte hücre sitozol erişim fiziksel ve enzimatik birincil vacuolar membran aşağılayıcı. Bir kez sitozol Bu patojenler hem çoğalırlar yanı sıra yeni hücre bulaştırmak için ana hücresinin plazma zarı nüfuz için yeterli mekanik Kuvvetleri oluşturmak. İşte, L. Monositogenez (Lm) hücresel enfeksiyon döngüsünün terminal bu adımı koloni oluşturan birim testleri ve Akış Sitometresi tarafından sayısal ve nasıl her iki patojen ve ev sahibi olarak kodlanmış faktörler etkisi örnekleri bu vermek nasıl göstermektedir işlem. Ayrıca yakın bir ilişkiyi Lm enfeksiyon dinamikler kültürlü hücre tüp bebek bulaşmış ve bu fareler türetilmiş karaciğer hücrelerinin enfekte içinde vivo gösteriyoruz. Bu işlev tabanlı deneyleri oldukça basit ve kolayca keşif dayalı yüksek üretilen iş ekranlar için modülatörler ökaryotik hücre işlevinin için ölçeklendirilebilir.
Giriş
Enfeksiyon tabanlı deneysel modeller bağımlılığını başlangıç durumu koşullar ev sahibi ve patojen, çeşitli patojen bulaşma stratejileri ve patojen ve ana bilgisayar kullanan işlemler atfederek zorluğu nedeniyle doğal olarak zor olan bağlı olarak sonuçlar. Listeria Monositogenez (Lm) bakteri konak savunma yanıt-e doğru onun genetik ve mikrobiyolojik tractability, hızlı ve ilerleyicidir hücresel enfeksiyonu stratejisini ve nispeten açık nedeniyle soruşturma için ideal bir patojen haline gelmiştir onun cep-organismic düzeyi ve enfeksiyon fenotipleri arasındaki ilişki. Lm hücresel enfeksiyon dört ayrı aşama1ile devam eder....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Fareler insanca bakım için tüm uygun hükümet kılavuzlarınıza uygun olarak tedavi edildi ve kullanmak, laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık enstitüleri ve bunların kullanımı için tüm bu çalışma Miami Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı tarafından kabul edildi ve kullanım Komitesi (protokol 16-053).
1. enfeksiyon için hücreleri hazırlanması
- Fare makrofaj gibi hücre kültürünü ham 264.7 DMEM doku kültürü medya % 10 fetal buzağı serum (bundan böyle DMEM/FCS da adlandırılır) ile takıma yaymak bir 125 mL şişe ve 37 °C/5% CO2' de tutulan bir doku kültürü kuluçka makinesi kullanarak.
- Enfeksiyon, önceki gün bir hücre ka....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Patojen ve hücresel enfeksiyon etkileyen ev sahibi olarak kodlanmış faktörlerin rolü değerlendirilmesi
Yukarıda açıklanan enfeksiyon koşulları kullanarak, giriş vahşi tipi Lm yüzde 0.15, kültürlü makrofajlar (şekil 1A) ile ortak kuluçka 1,5 saat sonra kurtarılır. Sonraki 1,5 saat, co kuluçka (3 h sonrası enfeksiyon, HPI) kurtarma uygun Lm 4-fold bir artış oldu ve 3 6 HPI için uygun Lmkurtarma bir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Onun hızlı ve ilerleyicidir hücresel enfeksiyonu nedeniyle, Lm enfeksiyon etkisi hücresel aktiviteler soruşturma için ideal bir patojen bir programdır. Ana faktörlerin bir Lm hücresel enfeksiyon11,12,13,14olumlu veya olumsuz yönde etkileyen tespit edilmiştir. İki tür ev sahipliği bizim laboratuvar Perforin-2 ve Heme düzenlenir inhibitörü ile karakterize faktörler (P2 ve Merhab.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| ACK Lysing Tamponu | Gibco | ||
| ArC Amin Reaktif Kompanzasyon Boncukları | Yaşam Teknolojileri | A10346 | |
| BHI (Beyin Kalp İnfüzyonu) et suyu | EMD Milipore | 110493 | |
| Hücre Süzgeci, 70 & m | VWR | 10199-656 | |
| Kollajenaz D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM ortamı | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tüpleri | BD Falcon | 352054 | |
| FBS - Isı Etkisiz Hale Getirildi | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks' Dengeli Tuz çözeltisi | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Büyüme Hücreleri MS | MBPE-4040 | |
| CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Sarı Ölü Hücre Lekesi kiti | Yaşam Teknolojileri | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spektral Analiz Cihazı | Sony | ||
| Şırınga 28 G 1/2 "1cc | BD | 329461 | |
| TPP Doku Kültürü 48 Kuyulu Plakalar ve nbsp; | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Doku Kültürü 6 Kuyulu Plaka | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antijen | |||
| CD11b | Biolegend | flurochrome = PE Cy5, seyreltme = 1/100, klon = M1/70 | |
| CD11c | biolegend | flurochrome = AF 647, seyreltme = 1/100, klon = N418 | |
| CD45 | biolegend | flurochrome = APC cy7, seyreltme = 1/100, klon = 30-f11 | |
| f4/80 | biolegend | flurochrome = PE, seyreltme = 1/100, klon = BM8 | |
| canlı/ölü | invitrogen | Flurokrom = AmCyN, Seyreltme = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Seyreltme = 1/200, Klon = HK1.4 MHC | |
| II | Biolegend | Flurokrom = AF 700, Seyreltme = 1/200, Klon = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Seyreltme = 1/100, Klon = PK136 |
Kaynaklar
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
