Bu iletişim kuralı immunotherapeutic yeniden yönlendirilen T-hücre (araba T-hücreli) sitotoksisite karşı 3D yapılandırılmış kanserli hücreleri (pulcuklarının) gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için tasarlanmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından
Bu makalede
Özet
Özet
İmmünoterapi Aksi takdirde tedavi edilemez kansere karşı mücadele büyüyen ilgi alanı haline gelmiştir. Tüm immunotherapeutic Yöntemler arasında en çarpıcı sonuçlar, özellikle Pediatrik B akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) ile elde edilen T hücreleri chimeric antijen reseptör (araba) yönlendirildi. Klasik doğrulama yöntemleri araba T hücrelerinin özgüllük kullanımı ve işlevselliği deneyleri hedef hücrelere süspansiyon ve xenograft modelleri karşı araba T hücrelerinin güveniyor. Ne yazık ki, tüp bebek yapılan gözlemleri kez vivo içinde elde edilen sonuçlar üzerinden decoupled ve çok çaba ve hayvanların bir adım daha ekleyerek bağışladı: 3D kültür kullanımı. Onlar hayvan modeli engrafted yükleyen tümör hücreleri 3D yapısını taklit potansiyel hedef hücrelere pulcuklarının üretim ideal bir alternatif temsil eder. Burada, evlat edinen hücre tedavisi (burada CD19 araba T hücreleri tarafından örneği) için bir doğrulama aracı olarak bir transduced kolorektal hücre satırından pulcuklarının üretmek için uygun fiyatlı, güvenilir ve kolay bir yöntem raporu. Bu yöntem küresel büyüme takip edebilirsiniz bir Gelişmiş canlı görüntüleme sistemi ile birleştiğinde, sitotoksisite ve tümör hücre apoptosis efektör hücreleri.
Giriş
Evlat edinen hücre aktarımı (ACT) yeni nesil kanser muamele temsil eder. Efektör hücreler (T - veya NK-hücreleri) enjeksiyon bir hasta dayanmaktadır. Bu hücrelerin genetik olarak onlara onların hedefe, tümör, rehberlik ve onu yok bir reseptör ile değiştirilebilir. Son zamanlarda bu yaklaşım B-hücre işaretçisi CD19 karşı yönetmen Chimeric antijen reseptör (araba) hasta T hücreleri seçtiğin bu kullanıcı kanser1öldürmeye tanıttığında mümkün olduğu gösterilmiştir. Yapay bir reseptör olan araba söz konusu olduğunda tasarım spesifik antikor parçaları bir varlık belirlenmiş tek zincir değişken parçası (scFv), azaltılmış etki alanı bağlama antijen oluş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. nesil pulcuklarının kolorektal kanser hücre satırından
- Yıkama HCT 116 (farklılaşma 19 küme (CD19) ve yeşil floresans Protein (GFP) ifade etmek için stabil transduced) hücre monolayers fosfat ile arabelleğe alınmış serum (PBS; 25 cm2 veya bir 75 cm2 şişesi için 10 mL 5 mL). Tripsin (0.5 mL 25 cm2 veya bir 75 cm2 şişesi için 1 mL) ekleyin ve 5 min için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
- Hücre dekolmanı mikroskop altında kontrol ve hücre ayrılma enzim tam Roswell Park Memorial Enstitüsü 160 Orta (RPMI 1640) ile nötralize (RPMI 1640 + %10 FCS + viomisin; 10 mL 25 cm2 veya bir 75 cm2 şişesi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1' de görüldüğü gibi bu akış sitometresi tarafından ifade CD19 arabanın T hücreleri (Şekil 1A) ve CD19 düzeyde HCT116 tümör hücre hatları (Şekil 1B) kontrol etmek önemlidir. Şekil 2 bir tipik küresel denemenin sonucu örneğidir. Otomatik görüntüleme cihazları dört farklı kanalları fotoğraf çeker: parlak alan, faz, yeşil ve kırmızı Floresans. Faz kanal pulcuklarının .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Gelecekteki kanser tedavisi doğrulamak için yenilikçi bir araç olarak pulcuklarının kullanımı son yıllarda giderek artan ilgi alanı haline gelmiştir. Pulcuklarının klasik 2D tüp bebek analiz ve içinde vivo değerlendirme arasında bir ara adım temsil eder. Yöntemi daha fazla söz7profil oluşturma gen yanı sıra mikro-çevre tümörü taklit eden açısından onların potens ile ilgili bir çok tutar. Bu yayında sunulan Protokolü Saheen adapte vd.11 ' e Incucyte S3 ve 3D tümör p.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser hibe #244388, #254817 ve #284983 altında Norveç Araştırma Konseyi tarafından desteklenen; Norveç Kanser Derneği (#6829007); Norveç Sağlık bölge Güney Doğu Grant #17/00264-6 ve #2016006.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu | Su SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | güçlü > Lot Numarası: < / güçlü> RNBG7037 |
| 75 cm ve sup2; büyüme alanı şişeleri | VWR | 430639 < | güçlü > Lot Numarası: < / güçlü> 2218002 |
| 75 cm ve sup2; büyüme alanı şişeleri | VWR | 734-2705 | Lot Numarası: < / güçlü> 3718006 |
| Tripsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Numarası: < / güçlü> SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Yaşam Teknolojisi (Gibco) | 21875-091 | Lot Numarası: < / strong> 1926384 |
| Fetal Sığır Serumu | Gibco | 10500064 | Lot Numarası: < / strong> 08Q3066K |
| Gentamisin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Numarası: < / strong> 1904924A |
| Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4 | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Numarası: < / güçlü> 1886513 |
| 96 kuyulu plaka, yuvarlak tabanlı | VWR | 734-1797 | < güçlü > Lot Numarası: < / güçlü> 33117036 |
| Dynabeads İnsan T-Aktivatör CD3 / CD28 | Thermo Fischer | 11132D-X-VIVO | |
| 15, Gentamisin L-Gln, Fenol Kırmızısı, 1 L | BioNordika ile | BE02-060Q | Lot Numarası: < / strong> 8MB036 |
| CTS Bağışıklık Hücresi Serumu Değiştirme | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Numarası: < / strong> 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Numarası: < / strong> 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Kırmızı Reaktif | Essen Bioscience | 4641 | Lot Numarası: < / strong> 17A1025-122117 |
| Reaktif Rezervuarı | VWR | 89094-672 | Lot Numarası: < / güçlü> 89094-672 |
| 15 mL tüpler | VWR | 734-1867 | < güçlü > Lot Numarası: < / güçlü> 19317044 |
| anti-insan CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Numarası: < / güçlü > 4016990 RRID: < / güçlü> AB_395813 |
| Biotin-SP (uzun aralayıcı) AffiniPure F (ab ') < sub>2< / sub> Parça Keçi Anti-Fare IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | < güçlü > Lot Numarası: < / güçlü > 129474: < güçlü >RRID: < / güçlü > AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Numarası: < / güçlü > 5191579 < br / > < güçlü>RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Kolorektal Karsinom Hattı | ATCC | CCL-247-Incucyte | |
| S3 | Essen Bioscience |
Kaynaklar
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
