Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

10.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58820

⸱

31 Ocak 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Bu makalede

Özet

Burada, nucleosome parçacıklar, statik ve hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleme teknikleri kullanılarak tek molekül düzeyinde karakterize etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yakalama yapısı ve dinamik oluşturarlar içinde olan yüzey functionalization yöntemi sağlar nano, yüksek çözünürlüklü.

Özet

Nucleosome alt birimleri uzun bir zincir olan kromatin, DNA ikileşmesi ve transkripsiyonu almaya ökaryotik hücrelerde yer olarak böyle kritik süreçleri için sağlayan dinamik bir sistemdir. Oluşturarlar dinamikleri ve transkripsiyonu makineleri tarafından DNA'yı erişim sağlar ve eleştirel kromatin işlevlerini temel moleküler mekanizmaları katkıda bulunur. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) gibi görüntüleme tek molekül çalışmaları önemli ölçüde nucleosome yapısı ve dinamik rolünün geçerli anlayışımızı katkıda bulunmuştur. Geçerli protokol oluşturarlar yapısal ve dinamik özelliklerini incelemek yüksek çözünürlüklü AFM görüntüleme teknikleri etkinleştirme adımları açıklar. Protokol H3 histon onun muadili şeması protein A (CENP-A) ile değiştirilir şeması oluşturarlar için elde edilen AFM veri tarafından gösterilmektedir. Protokol mono-oluşturarlar sürekli seyreltme yöntemiyle derleme ile başlar. Nucleosome görüntüleme için kullanılan aminopropyl silatrane (APS-Mika) ile functionalized Mika yüzey hazırlanması açıklanan oluşturarlar AFM görselleştirme için önemlidir ve yüzey hazırlamak için yordam sağlanmıştır. APS-Mika yüzeyinde biriken oluşturarlar ilk nucleosome nüfus bir görüntüsünü yakalar statik AFM kullanarak yansıma. Bu görüntülerin analizleri, böyle parametre DNA buna sarılarak oluşturarlar boyutu olarak ölçülebilir ve bu işlem ayrıca ayrıntılı. Sıvı yordamda Imaging hızlandırılmış AFM birkaç çerçeveleri yakalayabilir yüksek hızlı hızlandırılmış AFM için anlatılan nucleosome dinamiği saniyede. Son olarak, dinamik süreçler nicel karakterizasyonu etkinleştirme nucleosome dinamiklerini analiz açıklanan ve resimli.

Giriş

Ökaryotik hücrelerde DNA son derece yoğun ve kromozomlar içine organize olduğunu. 1 ilk DNA organizasyon bir kromozom içinde hangi 147 oluşturarlar derlemede düzeyidir bp DNA'ın histon octamer çekirdek sıkıca sarılmış. 2 , 3 nucleosome parçacıklar son derece kompakt kromozom birimi kurdu kadar hangi sonra düzenlenen bir kromatin dizi oluşturan uzun bir DNA molekülü üzerinde topla. 4 kromatin sökme Gen transkripsiyonu ve genom çoğaltma, kritik hücresel işlemler tarafından gerekli DNA o kromatin son derece dinamik bir sistemdir öne ücretsiz erişim sağlar. 5 , 6 , 7 DNA çeşitli kromatin düzeylerde dinamik özelliklerini anlama moleküler seviyede nerede hatalar hücre ölümü veya kanser gibi hastalıkların gelişimine yol açabilir genetik işlemleri elucidating için kritik öneme sahip. 8 bir kromatin büyük önem oluşturarlar dinamikleri özelliğidir. 9 , 10 , 11 , 12 bu parçacıklar yüksek kararlılık crystallographic tekniklerle yapısal karakterizasyon için izin verdi. 2 ne bu çalışmalar eksikliği oluşturarlar DNA mekanizması gibi dinamik ayrıntılarını histon çekirdeğinden unwrapping vardır; transkripsiyon ve çoğaltma işlemleri için gerekli olan dinamik yoludur. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 Ayrıca, özel proteinler remodeling faktörler olarak adlandırdığı nucleosomal parçacıklar17sökme kolaylaştırmak gösterilmiştir; Ancak, oluşturarlar iç dinamikleri tüm sökme işleminin katkıda bu süreçte önemli faktördür. 14 , 16 , 18 , 19

Tek molekül floresans19,20,21, optik yakalama (cımbız)13,18,22,23 ve AFM gibi tek molekül teknikleri 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 oluşturarlar dinamikleri anlamakta vesile olmuştur. Bu yöntemler arasında AFM birkaç benzersiz ve çekici özelliklerinden yararlanır. AFM bir görselleştirmek ve bireysel oluşturarlar yanı sıra uzun diziler27karakterize etmek izin verir. AFM görüntülerden ölçülen 10,14,26,28nucleosome yapısı DNA buna sarılarak histon çekirdek uzunluğu gibi önemli özellikleri olabilir; nucleosome çıkartıyorum dynamics karakterizasyonu için merkezi bir parametre. AFM olması son derece dinamik sistemleri ve DNA kendiliğinden histon çekirdek14paketini oluşturarlar çalışmalar ortaya koymuştur. Spontan DNA'sı oluşturarlar unwrapping doğrudan görüntüleme sulu çözümler 14,26,29bitince hızlandırılmış modunda çalışan AFM tarafından görüntülenmiştir.

Yüksek hızlı hızlandırılmış AFM (HS-AFM) araçları gelişiyle nucleosome çıkartıyorum işleminin milisaniyelik zaman-ölçek 14,15,24görselleştirmek mümkün kıldı. HS-AFM 16,30 ile ilgili çalışmalar şeması belirli oluşturarlar kurallı türüyle karşılaştırıldığında oluşturarlar çeşitli yeni özellikler ortaya koydu. Şeması oluşturarlar bir şeması, kromozom kromozom segregasyon31için kritik düzeyde önemli küçük bir kısmını oluşturmaktadır. Toplu kromatin içinde kurallı oluşturarlar şeması oluşturarlar histon özünü CENP-A histon histon H332,33yerine içerir. Bu histon sonucu olarak, DNA kaydırma şeması oluşturarlar içinde ~ 120 ikamesidir ~ 147 yerine bp bp için kanonik oluşturarlar; farklı türleri morfoloji şeması ve kurallı oluşturarlar için neden olabilir bir fark daha yüksek dynamics toplu ile karşılaştırıldığında bu şeması kromatin uğrar düşündüren34, diziler. HS-AFM16,30 çalışmalarda şeması oluşturarlar tarafından görüntülenen roman dynamics benzersiz fırsat doğrudan yapısal ve dinamik özelliklerini görselleştirmek için bu tek molekül tekniği ile sağlanan örnekler oluşturarlar. Bu özelliklerinin örnekleri kısaca ele olacak ve kağıdın sonunda resimli. Bu ilerleme roman protokollerde oluşturarlar AFM görüntüleme gibi değişiklikler mevcut yöntemlerden gelişimi nedeniyle yapıldı. Burada açıklanan protokol amacı bu heyecan verici gelişmeler tek molekül AFM nucleosome çalışmalarda bu teknikleri onların kromatin araştırmalarda kullanmak isteyen herkes için erişilebilir hale getirmektir. Açıklanan teknikleri oluşturarlar çalışmanın ötesinde sorunlar için geçerlidir ve diğer protein ve DNA sistemleri ilgi soruşturma için kullanılabilir. Bu tür uygulamalar birkaç örnek yayınları35,36,37,38,39,40,41bulunabilir, 42,43,44,45,46,47,48,49 ve AFM çalışmaların geleceği çeşitli biyomoleküler sistemleri verilen29,50,51,53,54değerlendirmeleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Mono-oluşturarlar Meclisi sürekli seyreltme

  1. Oluşturmak ve bir kapalı merkezli Widom 601 nucleosome sıra konumlandırma içeren bir yaklaşık 400 bp DNA substrat arındırmak. 55
    Not: di-oluşturarlar istenmeyen oluşumu sınırlamak için 'her kol kanat konumlandırma sıra' ~ 150 geçmemelidir bp.
    1. Plazmid pGEM3Z-601 tasarlanmış astar ile birlikte kullanın ve substrat DNA PCR kullanarak yükseltmek. Burada kullanılan 122 ve 154 bp kol uzunlukları ile 423 bp substrat için ileri kullanın (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') ve ters (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') astar.
    2. Termal cycler tepki karışıma içeren tüpler 95 ° C'ye ısıtılmış Ekle 33 devredir 95 ° c 30 s denatürasyon 95 ° C, 30 s TAV 49 ° C'de, 35 s uzantısı 72 ° C'de 5 dakika sonra bir ilk denatürasyon için aşağıdaki programı çalıştır 10 dk 33 döngüleri takip için 72 ° C'de son uzantısı ayarla.
    3. Piyasada bulunan PCR arıtma Kit kullanarak PCR karışımı DNA'dan arındırmak. DNA PCR Temizleme sütundan eluting 10 mM Tris arabellek (pH 7.5) elüsyon arabellek sağlanan seti yerine kullanın.
      Not: arabellekleri arıtma adımları arasında aktarmak için ekstra dikkat. Kirlenmiş eluent sorunları neden olabilir aşağı ne zaman DNA toplama ölçüm ve/veya nucleosome derleme karışımı başlangıç tuz konsantrasyonu değiştirebilirsiniz.
  2. 260 saf DNA absorbans ölçerek DNA konsantrasyonu belirlemek nm.
    1. Boş değer UV VIS yalnızca 10 mM Tris pH 7.5 elüsyon tampon kullanarak spektrofotometre üzerinde toplamak. Bir ölçüm saf DNA toplamak.
  3. Konsantrasyon ile belirlenen, 0.6 mL microfuge tüp içine saf DNA aliquot 25 pmol ve çözüm zar zor görünene kadar bir vakum santrifüje yerleştirin; Bu 30 dk 1 h için bir gereksinimdir.
    Not: DNA substrat şimdi nucleosome derleme için hazırdır. Aksi halde, iletişim kuralı burada durdu ve DNA-20 ° C kadar kullanmak depolanan.
  4. 25 pmol buz üzerinde DNA içeren microfuge tüpü yerleştirin ve nucleosome derleme bileşenleri Tablo 1' de listelenen sırada ekleyin. Tüm bileşenleri ekledikten sonra karışımı buz kaldırmak ve oda sıcaklığında (RT) 30 dk için kuluçkaya.
    Not: Stok histon arabellek tuz içeriği ne zaman NaCl hesaplama 2 M son konsantrasyonu elde etmek için gerekli olarak kabul edilir önemlidir. 15 , 56
  5. Oluşturarlar 200 mM sürekli oranı dilüsyonu kullanılarak karışıma 2 M tuz konsantrasyonu azaltarak topla. 57
    1. Bir şırınga içeren 10 mM Tris pH 7.5 sulandırma arabellek 100 µL ile doldurun ve bir enjektör pompası yerleştirin.
    2. Doğrudan şırınga microfuge tüp şapkalı önceden delinmiş bir delikten iğne, iletişim sağlanması (Şekil 1) derleme karışımı ile yapılır.
    3. Enjektör pompa 120 min için 0,75 µL/dk hızında çalıştırın.
      Not: 250 nM oluşturarlar ve 200 mM NaCl elde edilen 100 µL çözüm içerir.
    4. Karışımı 10 K MWCO diyaliz düğmesini aktarmak ve önceden soğutulmuş (4 ° C) düşük tuz arabellek 4 ° C'de 1 saat için 10 mM Tris pH 7.5, 0,25 mM EDTA ve 2.5 mM NaCl, içeren 200 mL karşı diyaliz
  6. Nucleosome derleme histon içeriğini değerlendirmek için % 15 ayıran ve yukarıda açıklanan30istifleme % 6 ile kesintili SDS-sayfa jel hazırlayın.
    1. Aliquot 10-20 µL nucleosome, microfuge tüp için stok ve 4 Laemmli örnek arabellek x 1-2 x çalışma konsantrasyonu için ekleyin. 58
    2. Bir denetim olarak bu hazırlık ayrı microfuge tüp içinde 1-2 µg histon stokunun için yineleyin. Örnekleri için 95 ° C'de ısı ~ 5 dak.
    3. Jel üzerinde birbirlerine bitişik Lanes örnekleri yükleyin. Örnek arabellek bile grup geçişi teşvik etmek için kullanılmayan yolları ekleyin.
    4. Boya açık yığın jel ile taşır kadar jel 65 V çalıştırın. Ayıran jel ulaşıldığında, 150 V artırmak ve boya açık tamamen dışarı jel göç kadar çalıştırın.
    5. Elektroforez birim ortadan kaldırmak ve yavaşça dd H2ile O. dolu bir boyama kapsayıcı jel transfer Nazik ajitasyon ile 5 min için oturup jel izin. İki kez daha fazla taze dd H2O her zaman kullanılan ile bu işlemi tekrarlayın.
      Not: Bu protokol için kullanılan Coomassie leke ( Tablo malzemelerigörmek) Coomassie lekeleri için tipik sabitleme adımları gerektirmez. Başka bir Coomassie hazırlık kullanılıyorsa, sabitleme adımları gereken şekilde ayarlayın.
    6. Son durulama suyu kaldırın ve jel karşılamak için yeterli leke ekleyin. En az 1 h için nazik ajitasyon ile oturup jel izin.
      Not: ajitasyon için boyama konteyner da sıvıyla kaplı jel tutarken jel üzerinde leke hareketi teşvik herhangi bir cihaz üzerinde yerleştirilebilir.
    7. Leke kapsayıcıdan kaldır ve jel dd H2O. Değiştir dd H2O ile durulayın ve nazik ajitasyon ile 30 dk için jel ıslatın. (Jel gibi gösterildiği Şekil 2, histon gruplarından açık ayırmalı görünmesi gerekir.)
  7. 4 ° C'de oluşturarlar kullanmak kadar saklamak.
    Not: Bu koşullarda saklandığında oluşturarlar birkaç ay için kararlı kalır. Protokol burada duraklatılmış.

2. Mika yüzey oluşturarlar statik AFM görüntüleme için functionalization

  1. Bir 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS hisse senedi çözümde deiyonize su açıklandığı şekilde hazırlayın. Bu çözümün kullanım kadar 4 ° C'de 30 mağaza 1 mL aliquots.
    Not:-Ebilmek var olmak stok aliquots 4 ° C'de fazla bir yıl için 59
  2. 15 mL dd H2o 50 mM APS stokunun 50 µL çözülerek Mika değiştirilmesi için çalışan bir APS 1:300 çözüm hazırlamak
    Not: Bu çalışma çözüm birkaç gün için oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
  3. Mika kaliteli Mika sayfalarından ( Malzemeler tablo bkz: burada kullanılan Mika için), 1 x 3 cm şeritler kesin.
    1. Ne zaman çapraz bir küvet içinde konulmak parça uygun onay. İpucu keskin cımbız, traş bıçağı veya bant, her iki taraf taze i ciddi ve parça (Şekil 3A) ~0.1 mm ince kadar Mika katmanları ayırmak için kullanın. Mika parça APS dolu küvet yerleştirin ve yaklaşık 30 dk (Şekil 3B) için kuluçkaya.
  4. Mika parçanın gg H2O ve emmek için 30 dolu bir küvet transfer s (Şekil 3 c). Her iki APS-Mika şeridi bir argon akışı altında kurumasını.
    Not: Bir dokuma olmayan Selüloz ve polyester temiz oda temizleme işlemi (önerilen temizleme malzemeleri konusunda ayrıntılı) su Mika kenarından kurutma zaman esneklik yardım etmek için kullanılabilir.
  5. Kullanım kuru Mika şerit şimdi için örnek hazırlıktır. Aksi takdirde, parça bir temiz, Kuru küvet (şekil 3D) depolar.
    Not: bir vakum 1-2 h için ek depolama ortamı nemli olduğunda önerilir. Protokol burada duraklatılmış.

3. statik AFM görüntüleme için APS-Mika Nucleosome örnekleri hazırlanması

  1. İkiyüzlü yapışkan bant birkaç manyetik adam için geçerlidir ve kenara koyun.
  2. APS-Mika substrat istediğiniz boyuta (burada kullanılan MM AFM araç için 1 x 1 cm kare) kesilmiş. Bu temiz bir kabında alin ve kapalı tutun.
  3. Üç dilutions hazırlamak monte oluşturarlar (son nucleosome konsantrasyonları 0,5, 1,0 ve 2,0 nM) 0.22 µm kullanarak filtre tampon içeren 10 mM HEPES pH 7.5 ve 4 mM MgCl2.
    Not: oluşturarlar düşük son konsantrasyon kaybı sınırlamak için dilutions teker teker ifade APS-Mika üzerinde hemen önce yapılmalıdır.
  4. 5-10 µL seyreltilmiş nucleosome örnek APS-Mika parçanın ortasına de mevduat ve iki dakikalığına kuluçkaya izin. Yavaşça örnek dd H2O tüm arabellek bileşenleri kaldırmak için 2-3 mL ile yıkayın. Dd H2O kullanılan her ~0.5 mL sonra yavaşça aşırı durulama su kaldırmak için mika sallamak.
    Not: Bir tek kullanımlık şırınga için durulama Bu adım önerilir.
  5. Yatırılan örnek temiz argon gazı hafif bir akış altında kuru.
    Not: Örnek yansıması hazır veya bir boşluk kabine içinde saklanabilir veya desiccator argon ile dolu. Hazırlanan ve açıklandığı gibi saklanan örnekleri bir yıl hazırlık kalite kaybı olmadan takip görüntüsü. Protokol burada duraklatılmış.

4. statik AFM oluşturarlar görüntüleme

  1. İpucu sahibi AFM ucuna bağlayın. Bir bahar sabit ~ 40 N/m ve 300 ve 340 kHz arasında bir rezonans frekansı sahip bir ipucu kullanın (bkz. burada kullanılan cantilevers için Malzemeler tablo ).
  2. Madde 3 te örnek yüzey ile değil dikkatli olmak AFM sahne alanı'nda hazırlanan örnek bağlayın.
  3. En yüksek seviyede toplamıdır kadar lazer konsol üzerinde konumlandırın ve sıfır yakınındaki için dikey ve yatay saptırma değerlerini ayarlayın.
  4. Rezonans frekansını bulmak ve sürücü genlik ayarlamak ve görüntü boyutu 100 x 100'e ayarlamak için AFM sonda nağme nm. Yaklaşım başlamak için meşgul düğmesini tıklatın.
  5. Numune yüzeyi açıkça görülür kadar yaklaştı sonra yavaş yavaş genlik Setpoint optimize edin. 1 x 1 µm için tarama boyutu ve 512 x 512 piksel çözünürlüğünü artırın. Resim alma başlamak için meşgul düğmesini tarafından takip yakala düğmesini tıklatın.
    Not: Şekil 4 Albümdeki bu örnekler Imaging zaman beklenebilir düz arka plan gösterir.
  6. Nucleosome örneğini analiz için AFM aletleri analiz yazılımı kullanarak yakalanan görüntüleri açın.
    1. Bir polinom hat çıkarma veya benzer özellik kullanarak Görüntüyü Düzleştir.
    2. En düşük değer için minimum ve maksimum en yüksek değeri yansıtmak için renk tablosunu ayarlayın. Daha sonraki bir adımda gerekli olacak gibi bu değerler her resim için bir kaydını tutmak.
      Not: kesit nucleosome çekirdek eşit yerine değişen yükseklik yaylalar görüneceği şekilde bu değerleri kullanılmazsa, yükseklik verileri daha sonra analiz hatalı olur.
    3. Görüntüyü orijinal boyutunda .tiff görüntü olarak dışa aktarın. Herhangi bir seçenek ile sınır veya ölçek çubuğu görüntü kaydetmek için seçimi kaldırın.
    4. Açık belgili tanımlık imge analiz yazılımı kontur uzunluğu ölçümleri kapasitesine sahiptir.
    5. X, y ve z ayarla ölçekler görüntü aynı.
    6. Bir iç uzunluğu kalibrasyon olarak ölçmek ve ücretsiz DNA'sı bir ucundan diğerine kontur uzunluğu kaydedin. Bu kalibrasyon faktörü için bir çubuk grafik oluşturmak ve bir normal (Gauss) dağılımı ile uygun ölçüleri kullanmak. En yüksek merkezi bölmek (c) x baz çifti substrat boy farkla.
      Not: Bu görüntü belirli dönüştürme faktörünü nanometre gelen DNA baz çiftleri için değerdir.
    7. Ölçmek ve tutarlılık (5A rakam) için çekirdek merkezine ücretsiz kol sonundan itibaren her nucleosome için her iki silah kontur uzunluğu kaydedin.
    8. Her nucleosome çekirdek için toplamak tam iki yarım en fazla (FWHM) değerleri dikey bir çift çekirdek genişlikte (Şekil 5B iki FWHM ölçümler ortalama ve yarım saniyeden her nucleosome kol elde edilen değerden çıkarma kesit ölçüleri için çıkış/giriş DNA gelen çekirdek ölçülen uzunluğu merkezine doğru parçası kol boyu olan değil.
    9. Her kol boyu kol uzunlukları DNA baz çifti içinde elde etmek için hesaplanan kalibrasyon faktörü (adım 4.5.6) bölün.
    10. Nucleosome kol toplamı unwrapped substrat toplam baz çifti uzunluğu üzerinden çıkararak kaydırma DNA ölçüde hesaplayın. Bu değerler bir çubuk grafik arsa ve ortalama kaydırılan baz çifti DNA'ın nucleosome nüfus için elde etmek için normal bir (Gauss) dağılımı ile peak(s) uygun.
    11. Ölçülen kesit ortalama nucleosome yükseklikten hesaplayın. Bu bir çubuk grafik arsa ve nucleosome nüfus yüksekliği elde etmek için normal bir (Gauss) dağılımı ile peak(s) uygun.

5. hızlandırılmış AFM görüntüleme Nucleosome dinamiği

  1. İpucu sahibi AFM ucuna bağlayın. Bir sonda bir bahar sabit yaklaşık 0.1 N/m ve 7-10 kHz bir rezonans frekansı ile kullanılabilir (burada kullanılan cantilevers için malzeme listesi bakın).
  2. 1 x 1 cm biteviye-in APS-Mika Çift sopa şerit kullanarak bir manyetik disk takın ve Pak AFM araç üzerinde monte.
  3. 1 nM konsantrasyonu içeren 10 mM HEPES pH 7.5 ve 4 mM MgCl2bir 0,22 µm filtre uygulanmış görüntüleme arabelleği oluşturarlar sulandırmak.
  4. 5-10 µL seyreltilmiş nucleosome, 2 dk. durulama için mika parçanın Merkezi'nde iki kez 20µL görüntüleme arabelleği ile yatırılan örnek Kasası. Sonra ikinci durulama, arabellek yüzeyi görüntüleme bir damlacık tutun.
  5. Ucu ~ 100-500 kadar ipucu ve yaklaşım yüzeye el ile bulmak için üst-görüş kamerası kullanın yüzeyden µm.
  6. Ek görüntüleme tampon ucu ve yüzey arasındaki boşluğu doldurmak için ekleyin. Örneğin, yaklaşık 50 µL görüntüleme arabellek boşluğu doldurmak yeterli olur. Bir rezonans zirve için belgili tanımlık uç bulmak.
  7. Bilgisayar kontrollü yaklaşım yüzeye başlar. Yaklaştı, düşsel bir ilgi ~ 500 nm alanı seçmek için 1-2 µm alan ile başlar. Seçili ilgi bu alan ile 512 x 512 piksel veri edinme yoğunluğunu ayarlayın.
  8. Ayar noktası gerilimi ayarlamak ve görüntü kalitesini artırmak için genlik parametrelerini sür. 10 ücretsiz genliği nm veya daha az ve ~ 2 Hz tarama hızı kaliteli görüntüler yakalamak için kullanılabilir. Hızlandırılmış AFM kullanarak yakalanan nucleosome dynamics örneği Şekil 6' da gösterilmiştir.

6. yüksek hızlı hızlandırılmış AFM görüntüleme Nucleosome dinamiği

Not: Aşağıdaki protokol Ando grubu (Kanazawa Üniversitesi, Kanazawa, Japonya) tarafından geliştirilen HS-AFM araç için sağlanır. 60

  1. APS-Mika sıvı görüntüleme için hazır olun.
    1. Cam çubuk cam çubuk - tarayıcı tutkal kullanarak AFM tarayıcı sahne alanı'na takın (bkz. Tablo malzeme). Bu kuru en az 10 dakika izin ver.
    2. ~0.1 daha büyük bir mika sayfasından delme tarafından Mika 1.5 mm çapında mm kalın dairesel parçaları olun. HS-AFM Mika cam çubuk yapıştırıcı (cam çubuk HS-AFM ve kuru, en az 10 dakika için el değmemiş bu Mika parça eklemek Malzemeler tablobkz:). Bir de cleaved katman kasette görülür kadar basınca duyarlı bant kullanarak katmanları ayırmak.
    3. Yapmak a 500 µM APS eriyik için dd H2O 99 µL içinde 50 mM APS stokunun 1 µL sulandırmak. Bu çözümün 2.5 µL taze i ciddi Mika yüzey üzerinde mevduat ve 30 dk için functionalize izin.
      Not: functionalizing sırasında yüzey kurutma önlemek için 50 mL konik santrifüj tüpü kap getirilebilir filtre kağıdı nemli bir parçası ile uygun ve tarayıcı yerleştirilir. APS hisse senedi seyreltilmiş 3 kat daha az dynamics AFM ile gözlenen bir oranı için kontrol için statik görüntüleme için sıvı görüntüleme daha için.
    4. Mika dd H2O 20 µL ile birkaç ~ 3 µL durular uygulayarak durulayın. Tamamen Mika kenarında bir dokuma olmayan silin yerleştirerek her durulama sonrasında su kaldırın. Sonra son durulama ~ 3 µL dd H2O yüzeye ve en az 5 dk nonspecifically ilişkili herhangi bir APS kaldırmak için oturmak izin.
  2. Sonda yer HS-AFM tutucu ve sahibi AFM sahne alanı'nda ucu yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. 10 mM HEPES pH 7.5 ve 4 mM MgCl2~ 100 µL dd H kullanarak tutucu2Imaging 0,22 filtre µm oluşturarlar iki ~ 100 µL durular tarafından takip O tampon hangi durulama içerir.
  3. Bitmiş durular ile odası tampon ucu batış, görüntüleme nucleosome ~ 100 µL ile doldurun. Lazer ile düğmelerini tıklatana kadar konsol pozisyonunu ayarlayýn. APS-Mika ~ 4 µL durulama başına kullanarak filtre uygulanmış nucleosome arabellek, Imaging 20 µL ile yıkayın.
  4. Filtre uygulanmış nucleosome 1 son nucleosome konsantrasyon için arabellek Imaging 250 µL içine nucleosome derleme stokunun 1 µL seyreltik nM. Yüzeyde bu seyreltme 2.5 µL mevduat ve 2 dk. durulama için yüzey ile oturmak izin ~ 4 µL arabellek iki kez görüntüleme nucleosome. Sonra son durulama, arabellek Imaging'de kaplı yüzey bırakın.
    Not: Eğer yüzey nucleosome örnek yatırma sonra durulanır değil, yüzeye hızla kalabalık haline.
  5. Yüz aşağı örneğidir inceden inceye gözden geçirmek ve örnek ipucu tutucu üzerine ayarlayın. Yaklaşım başlamak için bir ayar noktası genlik, ücretsiz salınım genlik A0yakıns ile auto-yaklaşım işlevini kullanın.
    Not: İdeal olarak, birs = 0,95 %820 çalışan bir0, ancak, eğer dikkatli de çalışacaktır.
  6. Yüzey de izlenmekte olan edene kadar ayar noktası ayarlayın.
    Not: nucleosome örnek AFM ipucu enerji transferi en aza indirmek için konsol genliği küçük, genlikleri 1 düşük tutulmalıdır nm en iyi.
  7. Görüntü alanı yaklaşık 150 x 150 200 x 200 nm nm ile veri toplama hızı ~ 300 ms çerçeve görüntüleme başına.
    Not: Bu görüntü boyutu birkaç oluşturarlar dinamikleri aynı anda yakalamak için genellikle yeterli olur. Daha az nüfuslu bir yüzey bu parametrelerinde yapılan değişiklikler için çağırabilir. Önerilen kare hızı döngü, sürgülü ve diğerleri (bkz. aşağıda temsilcisi sonuçları bölümü) arasında unwrapping gibi nucleosome dynamics yakalamak yeterli olur.

7. hızlandırılmış AFM kullanarak yakalanan Nucleosome Dynamics Analizi

  1. Görüntüleri HS AFM veri türünden (.asd) .tiff resimlere dönüştürmek.
    1. AFM sistemin analiz yazılımı arka plan üniforma kontrast olana uçak ya da satır işlevlerini kullanarak görüntüleri düzleştirin.
    2. Görüntü kontrastı (renk ölçeği) otomatik olarak ayarlayın.
      Not: Kontrast el ile sunum amaçlı ama analiz için ayarlanabilir. Bu yükseklik ayrıntı dönüştürülmüş Albümdeki kayıp olacak neden olur.
    3. Görüntüler seçili dizi .mov dosya olarak kaydedin. Ölçek çubuğunun seçimini kaldırın ve seçenekleri kaydetmeden önce sınır.
      Notlar: ölçek çubukları çerçevede olabilir görüntüleri analiz yapmak. Bu görüntünün boyutunu değiştirmek ve yanlış ölçümlerde neden olur.
    4. .Mov dosya için uygun bir yazılım kullanarak TIFF görüntüleri dönüştürmek ( Tablo malzemelerigörmek). Aynı kare hızı dönüşüm için .mov dosya oluştururken kullanılan gibi kullanın.
  2. Kol uzunluğu kontur ölçülerini, ölçüm yazılımı bu ölçümü kapasitesine sahiptir görüntüleri açın (bkz. Tablo reçetesi) yazın.
    1. Bu yakalandığı uyum için görüntü boyutlarını ayarlayın.
    2. Her nucleosome kol kol sonundan itibaren nucleosome çekirdek ortasına kontur uzunluğunu ölçmek ve ölçümler bir elektronik tabloda (Şekil 4A) kaydedin.
    3. Bir nucleosome unwraps sonra unwrapped DNA substrat karelerde uzunluğunu ölçmek. Bu hesaplamalar kaydırma nucleosome için kullanılan nm/bp oranı film belirli kalibrasyonu için kullanın
    4. Nucleosome çekirdek için iki kesit profili ve iki çıplak DNA'ın (Şekil 4B) toplamak.
    5. Bir elektronik tablo yazılımı kesit profillerini alma ve araziler profildeki tüm noktalarından en düşük z değeri çıkararak normalleştirmek.
    6. Her kesit için yarım en (FWHM) tam genişliği ve yüksekliği hesaplamak ve her çerçeve için iki profillerinden değerlerin ortalamasını.
  3. Yarısı çıkarma her nucleosome FWHM değerinin silah silah hesaplanmış toplamı ile birlikte bir dağılım çizim olarak arsa vardır.
    1. Ortalama kontur uzunluğu gelen karelerdeki DNA'ın nucleosome açalım sonra yapılan DNA ölçümleri hesaplayın.
    2. Ücretsiz DNA ortalama kontur uzunluğu DNA substrat baz çifti uzunluğu tarafından bölerek nm/bp kalibrasyon faktörü belirlemek. 5.12 bölümünde anlatıldığı gibi nucleosome kaydırma her çerçevede hesaplamak için bu değeri kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mono-oluşturarlar ilk sürekli seyreltme derleme yöntemi (resim 1) kullanarak deneyler Imaging AFM için hazırlanmıştır. Hazırlanan oluşturarlar sonra kesintili SDS-sayfa (Şekil 2) kullanarak kontrol edildi. Mika yüzey sonraki oluşturarlar yüzeyi pürüzsüz bir arka plan için yüksek çözünürlüklü düşsel (Şekil 3) korunarak yakalar APS kullanarak functionalized. Oluşturarlar APS-Mika üzerinde tevdi ve daha sonra statik AFM Imaging'i kulla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yukarıda açıklanan iletişim kuralı oldukça basit ve son derece tekrarlanabilir sonuçlar, ancak birkaç önemli konular vurguladı sağlar. Functionalized APS-Mika güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar almak için anahtar bir substrat var. APS-Mika yüksek kararlılığını bir görüntüleme substrat önceden hazırlıklı olmak sonra en az iki hafta kullanılabilir kullanmak için hazırlamak izin verir bu substrat önemli özelliklerinden biridir. 59 , 61 metal puck montaj Mika için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Yazar Katkıları: YLL ve MSD tasarlanan proje; MSD oluşturarlar toplandı. MSD ve ZS AFM deneyleri ve veri analizleri yapılır. Tüm yazarları yazdı ve el yazması düzenlenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Plazmid pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
PCR PrimerleriIDT, Coralville, IAÖzel Sipariş(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polimerazThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701200 ünite
PCR saflaştırma kitiQiagen, Hilden, Almanya 2810450 adet için katalog numarası
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001250 g
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028500 g
(CENP-A / H4) 2 için katalog numarası, rekombinant insanEpiCypher, Durham, NC16-001050 ug
H2A / H2B için katalog numarası, rekombinant insanEpiCypher, Durham, NC15-031150 ug
H3 Oktamer, rekombinant insanEpiCypher, Durham, NC16-0001için katalog numarası 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Cihaz Kiti, 10K MWCO, 0.1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA6957410 cihaz için katalog numarası
Sodyum KlorürSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500G500 mg
için katalog numarasıAmicon Ultra-0.5  mL Santrifüj Filtreler Millipore-sigma, Burlington, MOUFC5010088 cihaz için katalog numarası
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25ML25 mL
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25G25 g
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MOiçin
Amonyum Persülfat (AmmPS) için katalog numarası Bio-Rad, Hercules, CA161070010 g
%30 Akrilamid/Bis Solüsyonu için katalog numarası, 37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158500 mL için katalog numarası
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800
SDS-PAGE için 5 mL 4x Laemmli protein numune tamponuBio-Rad, Hercules, CA161074710 mL
2-MEiçin katalog numarasıSigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10ML10 mL yaş için katalog
numarasıCetvel Önceden Boyanmış Protein Merdiveni ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616500 uL
Bio-Safe & trade için katalog numarası; Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA16107861 L
Nonwoven temiz oda mendilleri için katalog numarası: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Muskovit Blok MikaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Aminopropil silatran (APS)açıklandığı gibi sentezlenir
25 g
Scotch TapeScotch-3M için katalog numarası, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probu (statik görüntüleme için)Bruker AFM Probları, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probu (standart zaman atlamalı imaing için)Bruker AFM Probları, Camarillo, CA
Aron Alpha Endüstriyel Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA4802 g tüp için katalog numarası
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100G100 g için katalog numarası
Millex-GP Filtresi, 0.22  &mikro; mSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP0501010 cihaz için katalog numarası
BL-AC10DS-A2 afm probu (HS-AFM için)Olympus, Japonya
Bileşik FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonya 
Bileşik FS-1010S135-0.5 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonya 
Çok Modlu Atomik Kuvvet MikroskobuBruker-Nano / Veeco, Santa Barbara, CA
Yüksek Hızlı Hızlandırılmış Atomik Kuvvet MikroskobuToshio Ando, Nano-Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Kanazawa Üniversitesi, Kakuma-machi, Kanazawa, Japonya
için katalog numarası için katalog numarası için katalog numarası katalog numarası 11667289001 1 kg için katalog numarası 22 HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G'de

Kaynaklar

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178(2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840(2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337(2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103(2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960(1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299(2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8(2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7(2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648(2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625(2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322(2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354(2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

N kleozom Yap sN kleozom Dinami iAFM G r nt lemeKromatin Yap sCENP A N kleozomlarZaman Atlamal AFMMika Altl k Haz rlamaProtein DNA KompleksleriTek Molek l al malar
Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.