Method Article

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

DOI:

10.3791/58820

⸱

January 31st, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, nucleosome parçacıklar, statik ve hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleme teknikleri kullanılarak tek molekül düzeyinde karakterize etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yakalama yapısı ve dinamik oluşturarlar içinde olan yüzey functionalization yöntemi sağlar nano, yüksek çözünürlüklü.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nucleosome alt birimleri uzun bir zincir olan kromatin, DNA ikileşmesi ve transkripsiyonu almaya ökaryotik hücrelerde yer olarak böyle kritik süreçleri için sağlayan dinamik bir sistemdir. Oluşturarlar dinamikleri ve transkripsiyonu makineleri tarafından DNA'yı erişim sağlar ve eleştirel kromatin işlevlerini temel moleküler mekanizmaları katkıda bulunur. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) gibi görüntüleme tek molekül çalışmaları önemli ölçüde nucleosome yapısı ve dinamik rolünün geçerli anlayışımızı katkıda bulunmuştur. Geçerli protokol oluşturarlar yapısal ve dinamik özelliklerini incelemek yüksek çözünürlüklü AFM görüntüleme teknikleri etkinleştirme adımları açıklar. Protokol H3 histon onun muadili şeması protein A (CENP-A) ile değiştirilir şeması oluşturarlar için elde edilen AFM veri tarafından gösterilmektedir. Protokol mono-oluşturarlar sürekli seyreltme yöntemiyle derleme ile başlar. Nucleosome görüntüleme için kullanılan aminopropyl silatrane (APS-Mika) ile functionalized Mika yüzey hazırlanması açıklanan oluşturarlar AFM görselleştirme için önemlidir ve yüzey hazırlamak için yordam sağlanmıştır. APS-Mika yüzeyinde biriken oluşturarlar ilk nucleosome nüfus bir görüntüsünü yakalar statik AFM kullanarak yansıma. Bu görüntülerin analizleri, böyle parametre DNA buna sarılarak oluşturarlar boyutu olarak ölçülebilir ve bu işlem ayrıca ayrıntılı. Sıvı yordamda Imaging hızlandırılmış AFM birkaç çerçeveleri yakalayabilir yüksek hızlı hızlandırılmış AFM için anlatılan nucleosome dinamiği saniyede. Son olarak, dinamik süreçler nicel karakterizasyonu etkinleştirme nucleosome dinamiklerini analiz açıklanan ve resimli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik hücrelerde DNA son derece yoğun ve kromozomlar içine organize olduğunu. 1 ilk DNA organizasyon bir kromozom içinde hangi 147 oluşturarlar derlemede düzeyidir bp DNA'ın histon octamer çekirdek sıkıca sarılmış. 2 , 3 nucleosome parçacıklar son derece kompakt kromozom birimi kurdu kadar hangi sonra düzenlenen bir kromatin dizi oluşturan uzun bir DNA molekülü üzerinde topla. 4 kromatin sökme Gen transkripsiyonu ve genom çoğaltma, kritik hücresel işlemler tarafından gerekli DNA o kromatin son derece dinamik bir sistemdir öne ücretsiz erişim sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mono-oluşturarlar Meclisi sürekli seyreltme

  1. Oluşturmak ve bir kapalı merkezli Widom 601 nucleosome sıra konumlandırma içeren bir yaklaşık 400 bp DNA substrat arındırmak. 55
    Not: di-oluşturarlar istenmeyen oluşumu sınırlamak için 'her kol kanat konumlandırma sıra' ~ 150 geçmemelidir bp.
    1. Plazmid pGEM3Z-601 tasarlanmış astar ile birlikte kullanın ve substrat DNA PCR kullanarak yükseltmek. Burada kullanılan 122 ve 154 bp kol uzunlukları ile 423 bp substrat için ileri kullanın (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') ve ters (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') astar.
    2. Termal cycler tepki karışıma içeren tüpler 95 ° C'ye ısıtılmış Ekl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mono-oluşturarlar ilk sürekli seyreltme derleme yöntemi (resim 1) kullanarak deneyler Imaging AFM için hazırlanmıştır. Hazırlanan oluşturarlar sonra kesintili SDS-sayfa (Şekil 2) kullanarak kontrol edildi. Mika yüzey sonraki oluşturarlar yüzeyi pürüzsüz bir arka plan için yüksek çözünürlüklü düşsel (Şekil 3) korunarak yakalar APS kullanarak functionalized. Oluşturarlar APS-Mika üzerinde tevdi ve daha sonra statik AFM Imaging'i kulla.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan iletişim kuralı oldukça basit ve son derece tekrarlanabilir sonuçlar, ancak birkaç önemli konular vurguladı sağlar. Functionalized APS-Mika güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar almak için anahtar bir substrat var. APS-Mika yüksek kararlılığını bir görüntüleme substrat önceden hazırlıklı olmak sonra en az iki hafta kullanılabilir kullanmak için hazırlamak izin verir bu substrat önemli özelliklerinden biridir. 59 , 61 metal puck montaj Mika için.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar Katkıları: YLL ve MSD tasarlanan proje; MSD oluşturarlar toplandı. MSD ve ZS AFM deneyleri ve veri analizleri yapılır. Tüm yazarları yazdı ve el yazması düzenlenebilir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Plazmid pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
PCR PrimerleriIDT, Coralville, IAÖzel Sipariş(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polimerazThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701200 ünite
PCR saflaştırma kitiQiagen, Hilden, Almanya 2810450 adet için katalog numarası
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001250 g
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028500 g
(CENP-A / H4) 2 için katalog numarası, rekombinant insanEpiCypher, Durham, NC16-001050 ug
H2A / H2B için katalog numarası, rekombinant insanEpiCypher, Durham, NC15-031150 ug
H3 Oktamer, rekombinant insanEpiCypher, Durham, NC16-0001için katalog numarası 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Cihaz Kiti, 10K MWCO, 0.1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA6957410 cihaz için katalog numarası
Sodyum KlorürSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500G500 mg
için katalog numarasıAmicon Ultra-0.5  mL Santrifüj Filtreler Millipore-sigma, Burlington, MOUFC5010088 cihaz için katalog numarası
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25ML25 mL
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25G25 g
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MOiçin
Amonyum Persülfat (AmmPS) için katalog numarası Bio-Rad, Hercules, CA161070010 g
%30 Akrilamid/Bis Solüsyonu için katalog numarası, 37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158500 mL için katalog numarası
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800
SDS-PAGE için 5 mL 4x Laemmli protein numune tamponuBio-Rad, Hercules, CA161074710 mL
2-MEiçin katalog numarasıSigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10ML10 mL yaş için katalog
numarasıCetvel Önceden Boyanmış Protein Merdiveni ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616500 uL
Bio-Safe & trade için katalog numarası; Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA16107861 L
Nonwoven temiz oda mendilleri için katalog numarası: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Muskovit Blok MikaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Aminopropil silatran (APS)açıklandığı gibi sentezlenir
25 g
Scotch TapeScotch-3M için katalog numarası, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probu (statik görüntüleme için)Bruker AFM Probları, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probu (standart zaman atlamalı imaing için)Bruker AFM Probları, Camarillo, CA
Aron Alpha Endüstriyel Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA4802 g tüp için katalog numarası
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100G100 g için katalog numarası
Millex-GP Filtresi, 0.22  &mikro; mSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP0501010 cihaz için katalog numarası
BL-AC10DS-A2 afm probu (HS-AFM için)Olympus, Japonya
Bileşik FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonya 
Bileşik FS-1010S135-0.5 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonya 
Çok Modlu Atomik Kuvvet MikroskobuBruker-Nano / Veeco, Santa Barbara, CA
Yüksek Hızlı Hızlandırılmış Atomik Kuvvet MikroskobuToshio Ando, Nano-Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Kanazawa Üniversitesi, Kakuma-machi, Kanazawa, Japonya
için katalog numarası için katalog numarası için katalog numarası katalog numarası 11667289001 1 kg için katalog numarası 22 HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G'de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nucleosome StructureNucleosome DynamicsAtomic Force MicroscopyAFM ImagingChromatin StructureCENP A NucleosomesTime Lapse AFMMica Substrate PreparationProtein DNA ComplexesSingle Molecule Studies

Related Articles