Yöntem makalesi

Mezenkimal kök hücre izolasyon hamuru doku ve kanser hücreleri ile ortak kültür ilişkileri incelemek için

9.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58825

⸱

7 Ocak 2019

 ,  ,  ,  , 
1Genetics and Bioengineering, Yeditepe University, 2National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), Sickle Cell Branch, National Institutes of Health (NIH)

Bu makalede

Özet

Mezenkimal kök hücre diş hamurundan izole ve prostat kanseri hücre etkileşimi doğrudan ve dolaylı ortak kültür yöntemleri üzerinde temel değerlendirilmesi için iletişim kuralları sağlar. Koşul orta ve trans-şey membranlar dolaylı parakrin etkinliğini çözümlemeye uygundur. Differentially Tohum hücreleri birlikte lekeli doğrudan hücre-hücre etkileşim için uygun bir model olduğunu.

Özet

Kanser bir multistep süreç ve karmaşık hastalık olarak sadece tek tek hücre çoğalması ve büyüme tarafından yetkilendirilmekte ama aynı zamanda tümör çevre ve hücre-hücre etkileşimler tarafından kontrol. Kanser ve kök hücre etkileşimleri, hücre dışı ortam, fiziksel etkileşimleri ve salgılanan faktörler, değişiklikler de dahil olmak üzere yeni terapi seçenekleri bulmayı etkinleştirmek. Biz bilinen ortak kültürü teknikleri mezenkimal kök hücre (MSCs) ve kanser için bir model sistemi hücre etkileşimler oluşturmak için birleştirmek. Mevcut çalışmada, diş pulp kök hücreler (DPSCs) ve PC-3 prostat kanseri hücre etkileşimi doğrudan ve dolaylı ortak kültürü teknikleri tarafından incelenmiş. Koşul Orta (CM) DPSCs elde edilen ve 0.4 µm boyutlu gözenek trans-şey membranlar parakrin etkinlik eğitim için kullanılmıştır. Farklı hücre tiplerinin ortak kültür birlikte doğrudan hücre-hücre etkileşim çalışma gerçekleştirildi. Sonuçları CM hücre çoğalması arttı ve prostat kanseri hücre kültürlerinde apoptosis azalma saptandı. CM ve trans-şey sistem PC-3 hücre hücre göç kapasitesini arttırdı. Farklı membran boyalar ile lekeli hücreleri aynı kültür damarlarının tohumlari ve bu doğrudan ortak kültür koşul altında PC-3 hücreleri ile kendi kendine organize bir yapıda DPSCs katıldı. Genel olarak, sonuçlar ortak kültürü teknikleri bir modeli sistem olarak kanser ve MSC etkileşimleri için yararlı olabilir göstermiştir.

Giriş

Mezenkimal kök hücre (MKH), farklılaşma ve rejenerasyon ve yağ, kemik, kıkırdak, kas, ligament, tendon gibi mezenkimal dokuların katkısı yeteneklerini ile yetişkin vücut1 hemen hemen tüm dokularda yalıtılmış olmuştur , 2. kronik inflamasyon veya bir yaralanma durumunda ikamet hücreler üreterek doku homeostazı sağlamanın dışında onlar çok önemli sitokinler ve büyüme faktörleri anjiogenezi, bağışıklık sistemi ve3remodeling doku alacak üretmek. MSCs etkileşim kanser dokusu iyi anlaşılmış değil ama MSCs tümör başlatma, ilerleme ve metastaz4teşvik biriken kanıtlar gösteriyor.

MSCs homing yeteneği yaralı veya kronik iltihaplı alanına onları kök hücre tabanlı terapiler için değerli bir aday yapar. Ancak, kanser dokular, "asla yaralar şifa", ayrıca sürümü inflamatuar sitokinlerin, pro-anjiogenik molekülleri ve MSCs cancerogenous alan5' e çekmek önemli büyüme faktörleri. Sınırlı iken MSCs inhibitör etkileri kanser büyüme6üzerinde,7, kanser ilerlemesi ve etkileri teşvik metastaz kapsamlı olmuştur gösteren raporlar8bildirdi. MSCs doğrudan veya dolaylı olarak karsinojenezis bağışıklık hücreleri salgılayan destek kanser hücre çoğalması ve anjiogenik etkinliğini arttırmak ve düzenleyen göç, büyüme faktörleri/sitokinler, gizleme de dahil olmak üzere farklı şekillerde etkiler mezenkimal epitel geçiş (EMT)9,10. Tümör ortam kanser ilişkili fibroblastlar (restorantlar) ve/veya myofibroblasts, endotel hücreleri, adipositler ve bağışıklık hücreleri11de dahil olmak üzere çeşitli hücre türleri oluşur. O, restorantlar en bol hücre kanser büyüme ve metastaz8teşvik çeşitli kemokinler salgılar tümör alanında türüdür. Bu kemik iliği türevi MSCs tümör stroma12' restorantlar ayırabilirsiniz gösterilmiştir.

Diş pulp kök hücreler (DPSCs), ilk diş doku kaynaklı MSCs karakterize tarafından Gronthos vd. 13 2000 yılında yaygın olarak başkaları tarafından14,15araştırdık, hızlı pluripotency işaretleri Oct4, Sox2ve MicroRNAs16 gibi ve çeşitli hücre linages17ayırabilirsiniz. Gen ve protein ifade analizi ispat DPSCs büyüme faktörleri/sitokinler vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), angiogenin, fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2), interlökin-4 (IL-4), gibi diğer MSCs ile karşılaştırılabilir düzeyde üretmek Il-6, IL-10, ve kök hücre faktörü (SCF) yanı sıra angiogenez teşvik, bağışıklık hücreleri modüle ve kanser hücre çoğalması ve geçiş18,19,20 destek fms benzeri Tirozin kinaz-3 ligand (Flt - 3 L) . Ise MSCs etkileşimleri kanser çevre ile literatürde iyi belgelenmiş olabilirdi, DPSCs ve kanser hücrelerinin ilişkisi henüz değerlendirilmemiştir. Bu da çalışmanın, ortak kültür ve durumu orta tedavi stratejileri çok metastatik prostat kanseri hücre kültürünü, PC-3 ve olası eylem mekanizması kanser ilerlemesi ve metastaz diş MSCs evlenme DPSCs kurduk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yazılı onam hastaların onayı alındıktan sonra kurumsal etik komiteden elde edildi.

1. DPSC yalıtım ve kültür

  1. Yirmi yaş dişleri tam Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) içeren 20-15 mL tüpler arasında 17 yaşındaki genç yetişkinler elde edilen aktarım [düşük glikoz DMEM medya, % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş / amfoterisin (PSA) çözüm], içinde 8 h rezeksiyonundan sonra. Doku malzeme soğuk (4 ° C) aktarımı sırasında potansiyel hücre ölümü önlemek için tutmak.
  2. Hamuru doku steril ayıklama forseps diş Merkezi tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın, 10 cm doku kültürü yemekleri soğuk tam DMEM ortamda hamuru doku yerleştirin ve onları küçük parçalara (2-3 mm) tarafından neşteri kıyma.
    Not: Tüm deneysel prosedürler laminar akış başlıklı steril koşullarda yapılmalıdır. Enzimatik olmayan bu tekniği daha önce kullanılan21,22,23olmuştur.
  3. Yer küçük hamuru doku doku kültürü içinde 6-şey plakaları tedavi ve 200 µL her küçük hamuru doku parçaları kapsayacak şekilde tam DMEM medya ekleyin.












    4. figure-protocol-1



Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 DPSCs genel MSC özelliklerini kültür koşullar altında gösterilmektedir. DPSCs (Şekil 1B) kaplama sonra fibroblast benzeri hücre morfolojisi uygulamayın. MSC yüzey antijenleri (CD29, CD73, CD90, CD105 ve CD166) son derece hematopoetik işaretleri (CD34, CD45 ve CD14) sırasında ifade vardır negatif (Şekil 1 c). Değişiklikleri morfolojik ve moleküler düzeyde osteo-için ilgili kondro- ve adipo gen...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

MSCs, tümör çevre katkı hücre füzyon yoluyla melez hücre üretimi, kök hücre ve kanser hücreleri28arasında entosis veya sitokin ve kemokin faaliyetleri de dahil olmak üzere çeşitli etkileşimler tarafından düzenlenmiştir. Yapısal organizasyon, hücre-hücre etkileşimleri ve salgılanan faktörleri kanser hücre davranışı açısından tümör promosyon, ilerleme ve çevresindeki doku metastaz belirlenir. Yerleşik hücre popülasyonlarının etkileşimlerin arkasında mekanizmaları araştırmak için uygun e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu çalışmada Yeditepe Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Tüm veri ve bu makalede kullanılan rakamlar daha önce yayımlanmış34idi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMInvitrogen11885084Hücre kültürü için
FBSInvitrogen16000044Hücre kültürü için
PSALonza17-745EHücre kültürü için
TripsinInvitrogen25200056Hücre ayrışması için
PBSInvitrogen10010023Yıkamalar için
DeksametazonSigmaD4902Farklılaşma ortamının bileşeni
ve beta;-GliserofosfatSigmaG9422Osteojenik farklılaşma ortamının bileşeni
Askorbik asitSigmaA4544Osteo- ve kondrojenik farklılaşma ortamının bileşeni
İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS & eksi; G)İnvitrojen41400045Kondrojenik farklılaşma ortamı
TGF -&beta'nın bileşeni;SigmaSRP3171Kondrojenik farklılaşma ortamının bileşeni
İnsülinSigma I6634Adipojenik farklılaşma ortamının bileşeni
İzobutil-1-metilksantin (IBMX)SigmaI7018Adipojenik farklılaşma ortamının bileşeni
IndomethacinSigmaI7378Adipojenik farklılaşma ortamının bileşeni
MTS ReaktifiPromegaG3582Hücre canlılığı analizleri
TUNEL TestiSigma11684795910Apoptotik analizler
24 oyuklu plaka ekleriCorning3396Kuyu ötesi migrasyon deneyi için
PKH67SigmaPKH67GLKo-kültür hücre boyama için
PKH26SigmaPKH26GLKo-kültür hücre boyama için
ParaformaldehitSigmaP6148Hücre fiksasyonu için
von Kossa KitBioOptica04-170801.AHücre boyama için (farklılaşma)
Alcian blueSigmaA2899Hücre boyama için (farklılaşma)

Kaynaklar

  1. Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
  2. Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. Dental Stem Cells. , Springer. 109-124 (2016).
  3. Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
  4. Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
  5. Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
  6. Lu, Y. -r, et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
  7. Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140(2010).
  8. Hong, I. -S., Lee, H. -Y., Kang, K. -S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies? Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
  9. Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106(2013).
  10. Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
  11. Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139(2007).
  12. Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
  13. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  14. Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
  15. Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
  16. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  17. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839(2015).
  18. Ahmed, N. E. -M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
  19. Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
  20. Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
  21. Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849(2012).
  22. Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
  23. Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105(2010).
  24. Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
  25. Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
  26. Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
  27. Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719(2007).
  28. Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28(2017).
  29. Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
  30. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Biomimetics and Stem Cells. , Springer. 29-36 (2013).
  31. Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
  32. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).
  33. Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
  34. Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mezenkimal K k H crelerDental Pulpa K k H creleriProstat Kanseri H creleriKo K lt r TeknikleriKondisyonlu BesiyeriTranswell SistemiAk SitometrisiH cre MigrasyonuH cre ProliferasyonuDo rudan H cre Etkile imi

İlgili makaleler