Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

Chin-Wen Wei; Tyng-An Zhou; Ivan L. Dzhagalov; Chia-Lin Hsu

doi:10.3791/58844

Method Article

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

DOI:

10.3791/58844

⸱

January 9th, 2019

Chin-Wen Wei¹ , Tyng-An Zhou¹ , Ivan L. Dzhagalov¹ , Chia-Lin Hsu¹

¹Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T hücreleri farklı metabolik programlarının farklılaşma ve yayılması sırasında fonksiyonel kendi ihtiyaçlarına uygun kullanmaktadır. Mitokondri çok önemli hücresel bileşenleri hücre enerji sağlamak için sorumlu vardır; Ancak, aşırı mitokondri Ayrıca reaktif oksijen türleri (ROS) hücre ölümüne neden olabilir üretmek. Bu nedenle, mitokondri sayısı sürekli hücreleri ihtiyaçlarınıza uygun şekilde ayarlanması gerekir. Bu dinamik yönetmelik kısmen artı/hasarlı organelleri ve oluştururlar kaldırmak organellerin işlevi elde edilir. Bu nedenle, hücresel mitokondrial ve lizozomal içeriği hücre metabolik ayarlama değerlendirmek için anahtar göstergeler vardır. Probları organelleri için gelişmesiyle birlikte, iyi karakterize lysosome veya mitokondri özel boyalar hücresel organellerin ve mitokondri etiketlemek için çeşitli biçimlerde kullanılabilir hale gelmiştir. Çok renkli akış sitometresi profil hücre fenotipleri için ortak bir araç ve diğer deneyleri ile entegre olmak için yeteneği vardır. Burada, bir akış sitometresi organellerin ve mitokondri farklı T hücre Nüfus miktarını ölçmek için boyama yüzey imleçli organel özel boyalar birleştirmek nasıl ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Harekete geçirmek ve T hücrelerin çoğalması başarılı bağışıklık yanıtı montaj için önemli adımlardır. Son gelişmeler hücresel metabolizma sıkıca geliştirme ve T hücrelerinin işlevleri ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Örneğin, saf T hücreleri büyük ölçüde Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ikincil lenfoid organlar arasında devridaim sırasında enerji talebi karşılamak için güveniyor. Harekete geçirmek, saf T hücreleri ciddi metabolik, aerobik glikoliz ATP üretimi artırmak için ve hücre farklılaşma ve yayılması sırasında muazzam metabolik talepleri yerine getirmek için indüksiyon dahil olmak üzere yeniden programlama tabi. Metabolik ihtiyaçları ile takip etmek başarıs....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan fare doku hasat yordam kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Ulusal Yang Ming Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. lenfosit süspansiyon lenfoid organlar üzerinden hazırlanması

CO₂ inhalasyon servikal çıkığı tarafından ölüm emin olmak için takip bir şeffaf akrilik odasında gibi onaylı bir yöntem tarafından fare ötenazi.
Not: CO₂ dakikada bir % 20 deplasman odası ve Hayır 5 psi (inç kare başına pound) daha yüksek akış hızı tutmak. Bilincini kaybedecek bir fare için 2-3 dakika sürer. Hayvan (5-7 dk genel) nefes durduktan sonra CO₂ akışını en az 1 dakika korumak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyük T hücre alt kümeleri dalak ve timus tanımlaması

Kısaca, tek hücre süspansiyonlar dalak ve timus kırmızı kan hücreleri lysed, 2.4G2 süpernatant ile inkübe, organel özel boya ve ile antikor (Tablo 1) Floresan Birleşik boyama yüzey marker izledi. Timositleri gelişimsel ilerleme antikorlar Co reseptörleri kullanarak tanımlanabilir CD4 ve CD8. En olgun timositleri CD4 veya CD8 ifade edemediği v.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı organel özel boyalar ve yüzey marker mitokondri veya organellerin farklı T hücre Nüfus miktarını ölçmek için boyama birleştirir. Bu yöntem elektron mikroskobu ve immunoblot analiz gibi geleneksel yöntemleri için hücre sayısı ve homojenliği gereksinimleri sınırlamayı aşmak için geliştirilmiştir. Nadir hücre popülasyonlarının analiz ve aynı anda birden çok hücre tipleri aynı zamanda incelenmesi özellikle yararlıdır.

İşlem süresi ve kuluçka sıcaklığını bu protokolü en kritik fa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çakışma çıkarlarının bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı geliştirilmesi hibe Tayvan Bakanlığı Bilim ve teknoloji (en) NSC103-2320-B-010-002-MY2 ve MOST104-2628-B-010-002-MY4 CL Hsu tarafından desteklenmiştir. CW Wei mükemmel Tez Ödülü, Enstitüsü Mikrobiyoloji ve İmmünoloji, Ulusal Yang Ming Üniversitesi bir alıcı var.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe forseps (düz ve tırtıklı)	Dimeda
11 cm İris makası (düz, keskin/keskin başlı)	Dimeda
15 mL santrifüj tüpü	Thermo Fisher Scientific	339650
5 mL şırınga	TERUMO
6 cm Petri kabı	&alfa;-artı
70 &mikro; m naylon hücre süzgeci	SPL Lifesciences	93070
Amonyum klorür (NH₄Cl)	Sigma	A9434
Anti-fare CD25	Biolegend	102007	Klon: PC61
Anti-fare CD4	Biolegend	100453	Klon: GK1.5
Anti-fare CD44	Biolegend	103029	Klon: IM7
Anti-fare CD62L	Biolegend	104407	Klon: MEL-14
Anti-fare CD8	Biolegend	100713	Klonu:53-6.7
Anti-fare TCR ve beta;	Biolegend	109233	Klonu: H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Biyo temel	6381-92-6
FALCON 5ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüp (FACS tüpü)	BD Biosciences	352052
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biyolojik Bilimler
Hidroksietil piperazineetansülfonik asit (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamin (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Yeşil DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Esansiyel olmayan amino asitler (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Yeşil FM	Thermo Fisher Bilimsel	M7514
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)	Gibco	15140122
Potasyum bikarbonat (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Propidyum iyodür çözeltisi	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 orta (toz)	Gibco	31800089
Sodyum bikarbonat (NaHCO3)	Sigma	S5761
Sodyum piruvat (100 mM)	Gibco	11360070

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: i....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles