Bu makalede, iki uzamsal ölçekler köprüleme 3D tarama teknolojisi kullanarak deneysel bir protokol tanıttı: MRG tarafından > 100 μm olarak görüntülenmiş tüm beyin anatomisinin makroskopik uzamsal ölçeği ve nöronal dağılımları kullanarak mikroskobik uzamsal ölçek immunohistokimya boyama ve multielektrot dizi sistemi ve diğer Yöntemler (~ 10 μm).
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
3D tarama teknolojisi köprüleme mikrodevreler ve Macroscale beyin görüntüleri 3D roman gömme çakışan protokol
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan beyni, çok ölçekli sistemi olan, hem makroskopik elektrik sinyalleri, küresel kalın beyaz madde elyaf demetleri boyunca akan, ve mikroskopik nöronal sivri, akons ve dendrites boyunca yayılıyor. Her iki ölçek insan bilişsel ve davranışsal fonksiyonların farklı yönlerini tamamlar. Makroskopik düzeyde MRG, en küçük uzamsal çözünürlüğün, Voksel boyutunun 0,1 – 1 mm3olduğu mevcut standart görüntüleme teknolojisi olmuştur. Ayrıca, mikroskobik düzeyde, önceki fizyolojik çalışmalar bu tür voxels içinde eşit olmayan nöronal mimariler farkındayız. Bu çalışmada, 3D tarama teknolojisindeki teknolojik gelişmeler ile biyolojik bilimsel araştırmalarla arabirim yaparak mikroskobik verileri makroskopik bir haritaya doğru bir şekilde katıştırmak için güçlü bir yol gelişir. 3D tarama teknolojisi çoğunlukla mühendislik ve endüstriyel tasarım için şimdiye kadar kullanılmış olduğundan, ilk kez canlı beyin hücrelerinde doğal spiking korurken tüm beyin içine microconnectomes katıştırmak için repurposed. Bu amaca ulaşmak için, ilk olarak, nemli ve yansıtıcı yüzeyler nedeniyle görüntü için doğal olarak zorlu yaşam biyo-organizmaların doğru 3D görüntüleri elde etmek için bir tarama protokolü inşa ettik. İkinci olarak, biz daha iyi koşullar koruyarak ve beyin dokusunda aktif nöronların daha doğal nöronal sivri kayıt önemli bir faktördür yaşam beyin dokusu, bozulması önlemek için hız tutmak için eğitildi. İki kortikal yüzey görüntüleri, bağımsız olarak iki farklı görüntüleme modülleri, yani MRI ve 3D tarayıcı yüzey görüntüleri, şaşırtıcı bir mesafe hatası gösteren sadece 50 μm histogram modu değeri olarak ayıklanır. Bu doğruluk, hücre içi mesafelerin mikroskobik çözünürlüğüne Ölçekle karşılaştırılabilir; Ayrıca, farklı bireysel fareler arasında kararlı. Bu yeni protokol, çakışan (3D-NEO) protokol katıştırma 3D roman, bu entegratif protokol tarafından türetilen makroskopik ve mikroskobik seviyeleri köprüler ve kapsamlı bağlantı mimarileri (i.e., çalışma için yeni bilimsel bulgular hızlandırır microconnectome).
Giriş
Çeşitli fiziksel ve biyolojik kuruluşlarda bulunan çok ölçekli mimarileri genellikle1,2' de bulunur. Beyin aynı zamanda çok eşit olmayan ve çok ölçekli ağ organizasyon3,4. Çeşitli bilişsel fonksiyonlar, bu tür ağ kuruluşlarında kodlanmış, submillisecond temporal çözünürlüklerde nöronal nüfus elektrik başak desenleri temporal değişiklikler tutarak. Tarihsel olarak, nöronlar arasında karmaşık ağlar yapısal ayrıntılı olarak Santiago Ramón y Cajal tarafından 150 yıl önce5' ten itibaren boyama teknikleri kullanılarak gözlenmiştir. Ak....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan tüm deneysel prosedürler Kyoto Üniversitesi hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hayvanlar (gün 1)
- Kadın C57BL/6J fareler hazırlayın (n = 6, yaşlı 3 − 5 hafta).
Not: Bu protokol tüm kemirgen türler için geçerlidir.
2. MRI ayarları (gün 1)
- Bir ısıtıcı mat kontrol cihazı kullanarak 37 °C ' ye ayarlanmış bir kalorifer paspas üzerine yerleştirilen bir akrilik anestezi kutusuna fareyi koyun.
- Bir Isoflurane buharlaştırıcı, hava debimetre ve hava kompresörü oluşan bir anestezi sistemi kullanarak 1,4 L/min bir akış hızında ku....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Biz kortikal yüzeyler arasındaki mesafeler değerlendirdi, MRI hacmi sıyırma tarafından üretilen, ve yüzeyler çıkarılan beynin 3D taramaları elde. Mesafelerin histogram mod değerleri sadece 55 μm (Şekil 3A). Ayrıca, histogram uzaklığı sıfır eşittir noktadan biriktirirken, birikmiş değeri% 90 toplam örnek sayıların ~ 300 μm (Şekil 3B) ulaşır. İki yüzey arasındaki mesafelerin son histogram 50 μm civarında tipik bir zirve gösterdi. B.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İki beyin yüzeyinden daha doğru bir şekilde örtüşerek makroskopik ve mikroskobik uzamsal ölçekleri köprüleyerek 3D-NEO protokolü olarak adlandırılan yeni bir protokol geliştirdik. Aslen, iki beyin yüzeyi görüntülerinin doğru şekilde örtüşmesini ve canlı organizmalardan sağlıklı nöronal faaliyetleri kaydetmesi mümkün kılan bu protokolü oluştururken iki zorluk vardı. İlk olarak, etkili bir şekilde beyin organizması (adım 6,2 protokol) yaralanmadan kafatası ayıkladıktan sonra çıkarılan beyin çevreleyen kesme solüsyonu silme.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Teşekkürler
M.S., Tıp Bilimleri Fakültesi ve Tıp fakültesinde tıbbi bilgi Mühendisliği dersinde bulunan tüm personelden destek için minnettar ve yardımcı oldukları için Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto ve Doris Zakian 'a teşekkür etmek istiyor Yorum. Bu çalışmada, zorlu araştırmacı araştırmalar için Grant-ın-Aid ve MEXT (eğitim, kültür, spor, bilim ve Teknoloji Bakanlığı) ' dan M.S. mükemmel genç araştırmacılar (LEADER) programının önde gelen girişimi tarafından destekleniyordu. Bu çalışmanın MRG denemeleri küçük hayvan MRG, tıbbi araştırma Destek Merkezi, Tıp Enstitüsü, Kyoto Üniversitesi, Japonya için bölüm 'de gerçekleştirildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hava kompresörü | Kimura Medical | KA-100 | MRG için hayvan hazırlığı |
| Hepsi bir arada floresan mikroskobu | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anestezi kutusu | Biyo Araştırma Merkezi | RIC-01 | MRG için hayvan hazırlığı |
| Anestezi sistemi | ACOMA Tıp Endüstrisi | NS-5000A | MRG için hayvan hazırlığı |
| Anti-GAD67, klon 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | İmmün boyama için |
| Kalsiyum Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Kolin Klorür | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Kavisli künt forseps | |||
| Bertaraf neşter | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) Ca ve Mg olmadan, sıvı (10x) | nacalai tesque | İmmün boyama için | |
| D (+) - Glikoz | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Jelatin | nacalai tesque | 16605-42 | yeniden sekctioning |
| Keçi anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | İmmün boyama için |
| Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | İmmün boyama için |
| Isıtıcı mat | Biyo Araştırma Merkezi | HM-10 | MRI için hayvan hazırlama |
| Isıtıcı mat kontrolörü | Biyo Araştırma Merkezi | BWT-100A | MRI için hayvan hazırlama |
| Isıtıcı sistemi | SA Instruments MR | uyumlu Küçük Hayvan Isıtma Sistemi | MRI için hayvan hazırlama |
| İzofluran | AbbVie | MRG için hayvan hazırlama | |
| İzofluran buharlaştırıcı | ACOMA Tıp Endüstrisi | MKIIIai | MRI için hayvan hazırlama |
| Doğrusal Dilimleyici | DOSAKA | Neo Doğrusal Dilimleyici MT | |
| L (+) - Askorbik Asit Sodyum Tuzu | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnezyum Chrolide Hekzahidrat | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Tek Kuyulu MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| İzleme sistemi | SA Instruments | Model 1025 | MRG için hayvan hazırlama |
| İzleme yazılımı | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | MRG için hayvan hazırlığı |
| MRG uyumlu beşik | Bruker BioSpin | T12812 | MRI MRI için hayvan hazırlama |
| MRI bobini | MRG | Bruker BioSpin | T9988 |
| MRG operasyon yazılımı | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Tavşan mAb | Hücre Sinyali | 24307 | İmmün boyama için |
| Normal Keçi Serumu | Wako | 143-06561 | İmmün boyama için |
| Potasyum Klorür | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polietilen Glikol Mono-p-izooktilfenil Eter | nacalai tesque | 12967-45 | İmmün boyama için |
| Basınca duyarlı solunum sensörü | SA Instruments | RS-301 | MRG için hayvan hazırlama |
| Klinik öncesi MRI tarayıcı | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | MRG için |
| Pirüvik Asit Sodyum Tuzu | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| TARAMA bir KUTUDA | Open Technologies srl | ||
| Makas | |||
| Elek şişe | TIGERCROWN | 81 | 3D tarama için |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | İmmün boyama için |
| Sodyum Klorür | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodyum Dihidrojenfosfat | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodyum Hidrojen Karbonat | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodyum Hidrojensülfit | nacalai tesque | 31220-15 | İmmün boyama için |
| Termistör sıcaklık probu | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | MRG için hayvan hazırlığı |
| Diş çubuğu | Bruker BioSpin | T10146 | MRG için hayvan hazırlığı |
| Kanatlı intravenöz iğne | TERUMO | SV-23CLK | Perfüzyon için |
| 1 mol/l-Tris-HCl Tampon Çözeltisi | nacalai tesque | 35436-01 | İmmün boyama için |
| 1 mol/l-Hidroklorik Asit | nacalai tesque | 37314-15 | Çözeltinin pH ayarlaması için |
| %16-Paraformaldehit Sulu Çözelti | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15710 | İmmün boyama için |
Kaynaklar
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease.<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
