Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

10K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58930

⸱

22 Şubat 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

Bu makalede

Özet

Burada etkinliği ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı aşı vivo içinde değerlendirilmesi için zarif bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı eğitim viral, bakteriyel aşı modelleri veya paraziter patojenler için adapte edilebilir.

Özet

20inci yüzyılın tıbbi bir mucize aşılar vardır. Onlar büyük ölçüde morbidite ve mortalite azaltılmıştır tarafından bulaşıcı hastalıkların neden olduğu ve dünyadaki yaşam beklentisi çarpıcı bir artış katkıda bulunmuştur. Yine de, aşı etkinliği belirleme bir meydan okuma, kalır. Kanıt ortaya çıkan Bordetella boğmaca (B. boğmaca) için geçerli acellular aşı (aPV) suboptimal dokunulmazlık indükler öneriyor. Bu nedenle, büyük bir meydan okuma bir bütün-hücre aşı (wPV) olumsuz yan etkileri olmadan koruyucu bağışıklık indükler bir nesil aşı tasarlıyor. Burada biz bir koruyucu Th1/Th17 fenotip bağışıklık yanıtlarını belirtilen açıda Eğer ve daha iyi bir boşluk B. boğmaca Challenge fare solunum yolu bir umut verici, yeni adjuvan etkinliğini test etmek için kullanılan bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu makalede fare bağışıklama, bakteri aşılama, doku hasat ve bağışıklık yanıtı Çözümleme Protokolü. Bizim modeli içinde bu yöntemi kullanarak başarıyla önemli mekanizmalar tarafından umut verici, yeni nesil acellular boğmaca aşısı elicited aydınlatılmamıştır. Bu yöntem herhangi bir bulaşıcı hastalık modeli için aşı etkinliği belirlemek için uygulanır.

Giriş

20. yüzyılın en büyük halk sağlığı başarılarının aşılar temsil eder, henüz biz hala tam olarak hangi koruyucu bağışıklık başarılı aşılar teşvik mekanizmaları anlamıyorum. Moleküler imzalar tanımlaması (e.g., hücre harekete geçirmek işaretleri, hücresel türlerinden genişleme ve gen ekspresyonu şekillerinin) aşı bilgi tahmin ve etkili bir oluşturmak için bir bolluk sağlar sonra indüklenen bağışıklık yanıtı. Ana bilgisayar-patojen yanıt karmaşıklığı yeterince vitro hücre kültür sistemleri1kullanarak yinelenemez. Vivo aşı modelleri kullanılazlar ev sahibi içinde birden çok bağışıklık hücre türleri değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bu aşı antijen işleme ve sunum, fark sitokin salgısının ve bağışıklık hücreleri genişlemesi karakterize bir avantaj sağlar. Burada açıklanan protokolü yoluyla sistemik ve yerel bağışıklık yanıtı değerlendirilmesi ve miktar ilgi dokularda patojen yükünün aşı etkinliği belirlemek için detaylı bir yöntem sağlar. Burada sağlanan örnek patojen Bordetella boğmaca (B. boğmaca) için deneysel bir aşı etkinliği sınar.

B. boğmaca solunum hastalıkları boğmaca (boğmaca)2,3etyolojik Ajan Ayagin Gram-negatif bir bakteridir. Enfekte bireylerin (semptomatik veya asemptomatik) ile yakın temas iletim, kolonizasyon ve hastalığa yol açar. Rağmen önemli küresel aşı kapsama4, boğmaca dünyanın dört bir yanından birçok ülkenin resurging bir hastalık olarak kabul edilir ve bir önemli nedeni önlenebilir çocukluk yılında ölenler5,6,7, 8. 2015 yılında, B. boğmaca ve boğmaca Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar (NIAID) içinde bulaşıcı hastalık/hastalık listesi, confers daha iyi bir aşı geliştirilmesi ihtiyacını vurgulayan ortaya çıkan dahil edildi uzun ömürlü koruyucu bağışıklık.

Şu anda, etkin soruşturma boğmaca diriliş denetlemek için roman adjuvan ve antijenleri bütün hücre tarafından elde edildi bağışıklık yanıtı taklit etmek için optimal bir birleşimi ile yeni nesil acellular boğmaca aşısı (aPV) geliştirme alanıdır boğmaca aşısı (wPV)9. Son zamanlarda roman adjuvan Bordetella kolonizasyon faktör A eklenmesiyle bir geçerli FDA onaylı aPV (BcfA), değişiklik daha verimli B. boğmaca bakteri yükü azaltılması içinde sonuçlandı rapor açıklanan protokolünü kullanarak, fare akciğerler10,11. Bu artırılmış koruma bir şap kaynaklı Th1/Th2 bağışıklık yanıtı daha koruyucu Th1/Th17 bağışıklık profil10eğriltme tarafından eşlik etti. Bu detaylı ve kapsamlı, ev sahibi ve bağışıklık yanıtı patojenler, çeşitli eşzamanlı değerlendirmeleri maksimal bilgilerini elde etmek için Dedektif sağlayan protokoldür.

Burada açıklanan protokolü en uygun konak immün yanıt-e doğru sağlamak için şekil 1' de gösterilen temsilcisi aşı programı izler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Ohio Devlet Üniversitesi IACUC tarafından IACUC kılavuzlarınıza uygun olarak onaylanmış bir protokol sonrası canlı hayvan ile tüm deneyler yapılmıştır. C57BL/6 fare tüm aşı ve enfeksiyonları kullanılmıştır. Hem erkek hem de dişi fareler her grup NIH yönergelere göre kullanılır. Hayvanlar grubu başına sayısı güç hesaplamalar sonucu deneysel grupları arasında tahmin edilen farklılıkları temel alan olarak tespit edilmiştir. Örneğin, grup başına 8 fareler α % 80 güç verecektir = 0,05 (2-2-örnek tiçin taraflı) - test sonucunu 1.33 standart sapmalar (SDs) ilgi farklılıkları algılamak için.

1. bağışıklama farelerin

  1. Bir ana aşısı karışım gibi serum fizyolojik steril arabellekte hazırlamak veya DPS.
    Not: Bu tüm grup bağışıklama için gereken daha fazla toplam hacim karışımında % 10 içermelidir. Aşı kompozisyon konsantrasyonları aşağıda 1.1.1 ve 1.1.2 adımlarını ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Buzda vivaryum maddelere taşıma.
    1. B. boğmaca çalışmaları için aşağıdaki aşı gruplar içerir: aPV ve aPV + BcfA. Buna ek olarak, şap, aşı antijenleri yalnız (FHA ve Prn) ve saf fareler (aşı olmayan) kontrol grubu kullanın.
      Not: aPV 1/5inci tetanoz toksoidi, azaltılmış difteri toksoidi, boğmaca toksoidi (PT), ipliksi hemagglutinin (FHA) ve pertactin oluşan bir FDA onaylı aPV insan doz olduğunu (Prn) adsorbe alüminyum tuzları için. Geçerli boğmaca aPV bir insan doz 0.5 mL, bu nedenle, 1/5inci bir doz 0.1 mL. Birimler aPV + BcfA için çoğu aPV (1/5inci insan doz) + BcfA 0,046 mL 0.1 mL (30 µg) fare başına. Güvenli bir şekilde bir kas için teslim edilebilir maksimum ses 0.1 mL dir. Çünkü aPV + BcfA aşı birimdir 0.1 mL büyük, aşı kabaca eşit, güvenli bir şekilde yönetilmesi için bölünmüş her iki omuz teslim edilmelidir.
    2. Bir doz için deneysel bir aşı hazırlamak için alüminyum hidroksit jel steril PBS içinde 50 µg ile FHA 1 µg ve Prn 0,5 µg birleştirir. Bir laboratuvar silindir 15 dakika oda sıcaklığında (RT) üzerinde karıştırmak deneysel aPV izin. Daha sonra tüp 18.000 x g 4 ° C'de 5 min için de spin Süpernatant kaldırmak ve içeriği 1 mL steril PBS resuspend.
  2. Vivaryum anestezi makineyi (Şekil 2) ayarlayın.
    Not: yeterli düzeyde oksijen ve isoflurane kullanmadan önce ilgili tankların içinde olduğundan emin olun. İsoflurane çöpçü teneke kutu tartmak ve tarafından 50 gr ağırlığı arttıkça değiştirin.
  3. İyice biyolojik güvenlik kabini (BSC) temiz ve temiz indüksiyon odası BSC içine yerleştirin. Anestezi ve tutucu çizgiler anestezi makinesinden indüksiyon odasına bağlar. Oksijen sağlamak için regülatör akan oksijen tankı ile açın ve 1.5-2 L/dak için ayarlayabilirsiniz.
  4. Fareler istenilen yaş (6-12 hafta) indüksiyon odasına koyun. Hafifçe fareyi anestezi için % 2.5-3 isoflurane açın. Hayvanlar onlar odasında hareket değildir ve onların nefes yavaşladı kadar izlemek.
  5. İndüksiyon düzeyini parmak pinching-dönüşlü herhangi bir hareket için gözlemleyerek, sınayın. Değeri hiçbiri olduğunda farelere enjekte etmek hazır.
    Not: Bu deneyde, hayvanların bütün kafes anestezi hemen. Hayvanlar enjeksiyon için tek tek anestezi veya hayvanların anestezi olmadan enjekte etmek için birini seçebilirsiniz. Bu yöntemlerden uygun.
  6. Bu arada, 1 mL 0.1 mL her aşı ile insülin şırınga (28G 1/2) hazırlamak. Hayvanlar tam indüklenen vardır, bir hayvan odasından kaldırın ve fare ventrally bir havlu veya tezgah altlığınızın üzerinde yatıyordu.
  7. Aşı İntramüsküler yönetmek. 45° açıyla şırınga ve eğimi yukarı bakacak şekilde, şırınga ~ 5 mm fare deltoid yerleştirin ve aşı enjekte.
    Not: Arka çeyrek/kanat deltoid yerine bir enjeksiyon yeri olarak kullanılabilir.
  8. Enjeksiyon sonra iğneyi ~ 5-10 s için kas takılı tutun. Bir kez ses teslim edilir, eğimin uzak bir mühür oluşturmak ve aşı kaçağı önlemek için karşı karşıya şırınga 180 ° de döndürür. Sonra yavaş yavaş iğneyi enjeksiyon yeri dışarı çekin.
  9. Fare kafese geri. Belirlenen gruba tüm hayvanlarla yordamı yineleyin.
  10. İsoflurane açmak ve oksijen ile indüksiyon odası farelerin sonraki kafes anesthetizing önce sifonu.
  11. Kadar kafeste tüm uyarı ve hareketli hayvanlar izlemek. Kafes konut konumuna geri döndürmek.
  12. Monitör hayvanlar her 12 h aşılama sonrası, yukarı 48 h, morbidite kaba/dağınık ceket gibi klinik belirtileri için yürüyüş yavaş veya nefes zahmetli. Belirtiler devam ederse, kurumsal veteriner ile görüşmek ve gerekirse çalışma fareyi kaldırın.
  13. Dört hafta sonra ilk aşılama, anesthetizing ve fare daha önce verildi aynı aşı formülasyonu ile içine doğru deltoid kas içi enjeksiyon yönetme tarafından fareler artırmak.
  14. Yeniden, herhangi bir klinik belirtiler için hayvan izlemek. Hayvanlar için ek bir 2 hafta ev ve enfeksiyon ile devam edin.

2. B. boğmaca suşları ve hazırlık enfeksiyon Inoculum büyüme

  1. -80 ° c % 15 gliserol, Stainer-Scholte (SS) medya12planktonik büyüme donmuş içinde [cryopreserved], donmuş hisse senetleri B. boğmaca dışarı çizgi Bordet-Gengou (BG) agar13 plakaları üzerinde % 10 defibrinated koyun ile desteklenmiştir. Kan ve 100 µg/mL streptomisin (%10 BG + Sm) seçim için. 37 ° C'de plaka için 4 gün kuluçkaya.
  2. ~ 8-10 bireysel kolonileri strain(s) plaka almak ve 22.8 mM L-sistein, 3.6 mM demir çelik sülfat, 3,3 mM Niasin, 48,8 mM glutatyon, 227 mM askorbik asit, 1 mg/mL heptakis ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş SS medya 3 mL aşılamak. 16-24 h için 60 RPM bir rulo davul olarak 37 ° C'de kültür büyümek.
  3. Ertesi gün, seyreltik birincil kültür 1:600, 1:300, 1:120, 1:60, 1:30 ve 1: 15'te 3 mL ilave SS medya. 16-24 h için rulo davul 60 rpm'de 37 ° C'de kültür kuluçkaya.
  4. 600 optik yoğunluk ölçümleri gerçekleştirmek nm (OD600) bakteri kültürleri için. Spektrofotometre cuvettes kullanarak, steril PBS için 0.9 mL 0.1 mL sıvı kültürlerin ekleyerek kültürler 1:10 oranında seyreltin.
  5. OD600≈ 0,8-1.2 ile bir kültür seçin. 1 OD (şekil 3) almak için gerekli hacim hesaplamak. Spin aşağı hacmi 6000 x g 25 ° C'de 5 min için de 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde Süpernatant Aspire edin ve bakteri hücre Pelet 1 mL steril PBS 1 OD/mL yoğunluğu elde etmek için resuspend [1-3 x 109 koloni oluşturan birimler (CFU) /mL].
  6. ~ 5 x 10 bir inoculum hazırlamak için5 ' e 1.5 x 106 CFUs/fare 40-50 µL'girdap ve seri olarak (Kimden adım 2.5) bakteriyel çözüm 100-fold seyreltik 1 ml steril PBS ~ 1-3 x 107 CFUs/mL (şekil 4A) elde etmek için. İnoculum buz vivaryum için taşıma.

3. fare burunici enfeksiyon modeli

  1. Vivaryum, oksijen ve anestezi koşulları 1.3 ve 1.4 adımlarda açıklandığı gibi ayarlayın. 1.5. adımda açıklandığı gibi fareler anestezi için odasına koyun. Anestezi etkili olur kadar hayvanları izlemek.
  2. Fareler anestezi ne zaman bir hayvan teker teker indüksiyon odasından kaldırın. Fare ile kürek kemikleri ve boyun arkasında dorsal Toraks scruff almak. Burun erişmek için fare dik getirin.
  3. 200 µL pipet ucu kullanarak, yavaş yavaş bakteriyel inoculum 40-50 µL siklikla fare (her tamsayılardır 20-25 µL) uygulanır. Tüm inoculum hayvan tarafından inhale kadar fareyi tutun. Eğer bazı inoculum kabarcıklar ve baloncuklar toplamak ve siklikla yeniden aşılamak. Steril PBS eşit miktarda negatif kontrol fareler bir gruba teslim.
  4. 1.10-1.12, adımdan inoculated hayvanlar için onların kafes dönmek ve uyarı ve hareketli kadar hayvanları izlemek. Kafes rafa geri orijinal konut alanı için dönmek. İndüksiyon odası hayvanlar diğer dizisi anesthetizing önce kalan isoflurane kaldırmak için oksijen ile yıkayın. Hayvanlar için 48 saat sonrası enfeksiyon izlemek.
  5. Laboratuvarda fareler için teslim gerçek CFUs doğrulamak için steril PBS içinde inoculum seri dilutions plaka. Dilutions %10 BG + Sm levha (şekil 4A) üzerinde 0.1 mL plaka. Tabakları da 37 ° C kuluçka makinesine koyun ve 4 gün boyunca büyür. Say ve fare (şekil 4B) teslim inoculum üzerinden CFUs hesaplamak.

4. hasat hayvan doku enfeksiyondan sonra

  1. Fare diseksiyon ve doku hasat için hazır olun.
    1. Bir otoklav dokularda işlemek için gerekli tüm araçları (kaba ve ince makas, eğri makas, iyi forseps, pelet dibekler ve üçgen serpme) sterilize. Sterilizasyon torbalar içinde Araçlar kapatın. Cam dounce homogenizers folyo sarın ve otoklav bandı kısırlık belirtmek için Ekle.
    2. Agar plakaları 1 veya 2 gün kala plakaları kullanmadan katılaşmış önce emin olmak için doku hasat hazırlayın. B. boğmaca, için nazal septum, trakea ve akciğer her fare ile istenen dilutions ampirik olarak belirlenen her deneme için için için %10 BG + Sm. etiket levha kullanın.
    3. Dolgu ve etiket CFU seyreltme tüpler. 0.9 mL steril 1.5 mL microcentrifuge tüpler için steril PBS organları işlenir ve dilutions başına organ üzerinde sayısına göre ekleyin.
    4. Doldurun ve tüpler doku koleksiyonu için etiket:
      1. Nazal septum ve nefes borusu: 0.3 mL steril % 1 kazein PBS ile steril 1.5 mL microcentrifuge tüp doldurun (Ca2 + ve Mg2 +-ücretsiz). 4 ° C'de mağaza
      2. Akciğerler: 2 mL steril % 1 kazein PBS içinde bir steril 15 mL konik tüp ve mağaza 4 ° C'de ekleyin Akciğerler histoloji için hasat için 2 mL % 10 tarafsız tampon formalin (NBF) ekleyin ve RT. saklayın
      3. Dalak: RPMI + % 5 3 mL ekleyin FBS 15 mL konik tüp için. 4 ° C'de mağaza
      4. Kan: iki adet steril 1.5 mL microcentrifuge tüpler, bir tam kan ve serum için bir etiket.
    5. Taze % 70 etanol ve şişeler diseksiyon için sprey şişeler doldurmak için hazırlanmalıdır.
  2. Tüm malzemeler bir arabası üzerinde vivaryum için hasat günü taşıma. BSC temiz ve anestezi makine adım 1.3 ve 1.4 gibi ayarlayın.
  3. İndüksiyon odasında disseke ve %5 isoflurane akan oksijen ile açmak için fare yerleştirin ve hayvanlar bilinçsiz kadar bekleyin. Fareler bir bir kerede kaldırmak ve cervically ölüm emin olmak için bir ikincil yöntem olarak hayvan yerinden çıkar. Servikal çıkması ötenazi bir solunum yokluğu ve/veya para çekme refleks (ayak çimdik testi) yokluğunda tarafından teyit edilmesi.
  4. Fare, ventral yüzü, diseksiyon tahtaya bakacak şekilde yerleştirin ve kolları ve bacakları açık pin. Fare % 70 etanol ile vücudu sprey.
  5. Forseps kullanarak, leğen Center'da karın altında deri kucaklayışını. Keskin makas kullanırken, çene kadar dikey bir kesim yapmak. Sonra iki katmanı birbirinden iterek Periton duvardan uzak cilt incelemek, küçük hareketleri ile makas kullanarak kapalı. Cilt steril organ hasat için Engelsiz bir alan oluşturmak için karkas kenarlarına yerleştirin.
  6. Göğüs kafesi, veya karaciğer çevresinde aşağıda olduğu gibi karın zarını kavramak ve göğüs kafesi doğru hareket açık kesti. Alt sindirim sistemi ortaya çıkarmak ve iki nokta üst üste dalak açığa sola taşır. Eğri forseps kullanarak, dalak kavramak ve uzak bağ dokusu makasla incelemek. Dalak RPMI + %5 FBS ve yer buz tüp 3 mL içeren 15 mL konik tüp içinde bir yer.
  7. Forseps göğüs kafesi xiphoid işleminde stabilize ve diyafram kesmek için kullanın. Akciğerler deflate ve omurga doğru düşmek. Göğüs kafesi meme plaka kaldırmak için kenarlarında kesmiş.
  8. İzole ve üstün LOB akciğer atar ve toplar damarlardaki kesme sağ akciğer14, kaldırın. LOB doku düzeltmek için %10 NBF ve yer RT at tüp için en az 24 saat içeren 15 mL konik bir tüpte yerleştirin. Sağ akciğer ve sol akciğer kalan lobları yalıtmak. 2 mL % 1 kazein PBS içinde içeren bir 15 mL konik tüp loblar yerleştirin ve buz üzerinde yerleştirin.
  9. Akciğer damarları ve arterler ciğerlerini parçalayıp, göğüs boşluğunda kan olarak fare ile doldurmak izin kesim sonrası exsanguinates. 1 mL pipetman ucu ile kullanarak, kan toplamak ve önceden etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüp için transfer. Tüp Buza koyun.
  10. Ardından, boynundan, Trakea kapsayan yumuşak doku (parotid, dil ve submaxillary bezleri ve lenf bezleri) kaldırın. Açın ve nefes borusunu çevreleyen koruyucu membran çıkarın. İnce, ince forseps ve makas kullanarak, Trakea yemek borusu ve herhangi bir diğer bağ dokusu collarbones üstünden alt çene için ayırın.
  11. Forseps kullanarak, nefes borusu için tutun ve köprücük kemiği üstündeki nefes borusunu kesmiş. Trakea elastikiyet maksimize etmek ve trakea alt çene yukarıda (~ 1 cm) mümkün olduğu kadar izole şu gırtlak kesme aşağı çekin. PBS % 1 kazein 0.3 mL ile önceden etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüp organ yerleştirin ve buz üzerinde yerleştirin.
  12. Fare unpin ve ventrally, araştırmacı burnuna açık erişim için karşı karşıya fare ile yatıyordu. Fare başkanı % 70 etanol ile sprey ve ellerini kullanarak, kafatasının arkasına fare kavramak.
  13. Makas kullanarak, burun altından başlayan ve yukarı doğru hareket burun eti yumuşak Kes gitsin. Buna ek olarak, kürk, deri ve burun çevresinde bıyık kaldırın. Sonra forseps ve eğri makas ile makas uçları dışa doğru işaret etti ve geniz V benzeri oluşumu oluşturma gözler doğru kesmek eğrileri ile siklikla yerleştirin.
  14. İyi forseps kullanarak, nazal septum ve yumuşak doku oluşturulan oluşumu içinde toplamak. PBS % 1 kazein 0.3 mL ile önceden etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüp doku yerleştirin ve buz üzerinde yerleştirin.
  15. Karkas biohazard çantaya atın. Sonraki hayvan anatomi önce Araçlar deiyonize suyla durulayın ve % 70 etanol ile dolu bir ölçek yerleştirin. Araçları kaldırmak, aşırı etanol sarsmak ve sonraki diseksiyon ile devam edin
  16. Aşağıdaki adımları 4.3-4.14 her fare incelemek.
  17. Dokular aşağıda açıklandığı gibi işlemek.

5. dalak işlenmesi

  1. Dalağı ayırmak için bir 70 µm hücre süzgeç bir 60 mm doku kültürü çanak yerleştirin. Dalak ve beraberindeki medya 3 mL şırınga pistonu kullanarak filtre içine dökün. Tamamen ayrışmış ve hücre süzgeç aracılığıyla filtre kadar dikkatli bir şekilde organ püre.
  2. RPMI + %5 3 mL filtresiyle durulama FBS doku kültürü çanak içine. Hücre süspansiyon toplamak ve onun orijinal 15 mL tüp yerleştirin. 450 x g 4 ° C'de hücreler cips için 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi.
  3. Aspire edin veya süpernatant dikkatle boşaltmak ve Pelet amonyum klorür potasyum (ACK) arabellek (150 mM amonyum klorür, 10 mM potasyum bikarbonat, sodyum EDTA 0,1 mM) 2 mL resuspending tarafından kırmızı kan hücreleri parçalayıcı. RT (25 ° C), 3 dk için kuluçkaya.
  4. Tüpleri doldurun RPMI + 4° C'de 5 min için 450 x g de %5 FBS ve santrifüj tüpleri ile ilâ 8 mL Aspire edin veya süpernatant dikkatle boşaltmak. Hücre topakları 5 mL RPMI + %5 FBS ve sayısı hemasitometre ve mikroskop kullanarak splenocytes resuspend.
  5. 2.5 x iyi başına 106 hücreleri uyarmak için gereken hücre hacmi hesaplamak. 48-şey tabak içinde T-hücre medya (RPMI 1640 + %10 FBS, 10 µg/mL gentamisin ve 50 µM β-mercaptoethanol) iyi başına 0.5 mL hücrelerde tohum.
  6. Yukarıdaki hesaplama dayalı, hücre süspansiyon gerekli hacmi taze bir tüp ve Pelet-hücreleri 450 x g 4 ° C'de 5 min için de içine koyun
  7. Pelet T hücreli medya gerekli hacmi resuspend. B. boğmaca enfeksiyonu modeli için aşı antijenler antijen spesifik sitokin cevaben test: pertactin (Prn) ve ipliksi hemagglutinin adezyon (FHA). Bu nedenle, 3 tedaviler gereklidir: 1) hiçbir stimülasyon (NS, negatif kontrol olarak), 2) Prn ve 3) FHA. Tahlil için gerekli (2.5) 0.5 mL başına 106 hücre x 7.5 x 106 hücreler T hücreli medya 1,5 ml var.
  8. 48-şey plaka içine hücre süspansiyon aliquot 0.5 mL.
  9. Hücreleri uyarmak için antijenleri 2 kez T hücreli medya istenen konsantrasyon, karıştırın. Prn ve FHA son konsantrasyonları = 1 µg/mL ve 0,5 µg/mL, anılan sıraya göre. Bu nedenle, 2 µg/mL Prn veya 0.5 ml 1 µg/mL FHA karıştırın. O zaman, aliquot 0.5 mL antijen tedavi için son bir birimdeki her iyi 1 ml 1 x sulandrarak stimülasyon orta her şey, Özel Sigara İçilir.
  10. 37 ° c % 5 CO2tabak kuluçkaya. 7. gün Tarih supernatants ve supernatants aliquot 0.5 mL önceden etiketli microcentrifuge tüpler içine toplamak. Örnekleri antijen spesifik sitokinler ELISA (şekil 6) tarafından test etmek için hazır kadar-20 ° C'de depolayın.

6. akciğer işlenmesi

  1. Akciğerlerde (2 mL % 1 kazein PBS içinde) bir steril, 15 mL dounce homogenizer aktarın. Kullanım havaneli doku lunaparkçı. Doku yok büyük parçacıkların kalıncaya kadar ayırmak. Homojenize süspansiyon geri orijinal 15 mL tüp içinde yerleştirin.
  2. 0.3 mL CFUs kaplama için aliquot kaldırmak ve homogenate vasıl 450 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Toplamak ve aliquot 0.5 mL aliquots önceden etiketli microcentrifuge içine süpernatant tüpleri. Örnekleri sitokinler ELISA tarafından analiz kadar-20 ° C'de depolayın.
  3. Seçilen dilutions seri olarak seyreltme tüpler (0.9 mL steril PBS) homojenize akciğer süspansiyon 0.1 mL sulandrarak hazırlayın. Plaka önceden etiketli % 10 BG üzerine ampirik olarak seçilen dilutions 0.1 mL + Sm tabak ve steril üçgen dağıtıcısı kullanarak yaymak.
  4. Oda havası içinde 37 ° C'de plakaları için 4 gün kuluçkaya.
  5. Saymak ve CFUs/akciğer (şekil 6) hesaplar. Kısaca, seyreltme faktörü plaka, sonra da organ işlendiği toplam birim tarafından kurtarılan CFU sayıları çarpma. CFU hesaplamalar sonra her hayvan için günlük10 değerler haline dönüştürdü ve grafiği çizilecek.
    1. 30-300 kolonileri tabak kolayca ve doğru bir şekilde dikkate alınır. Hata15gibi düşük koloni sayıları tanıtmak beri az 6 kolonileri tabak hesaplamalar için kullanılmamalıdır. Bir alt limit algılama elde etmek için hangi bir organ homojenize Toplam hacim noktaya bir plaka üzerine su katılmamış homogenate kullanılan birim bölünür (örn., su katılmamış homogenate 0.1 mL tarafından bölünmüş 2 mL Toplam hacim eşittir alt sınırı 20 CFUs algılanabilir).

7. nazal Septum ve trakea işleme

  1. Doku homojenize %1 0.3 mL PBS/kazein Pelet ile havaneli Akülü motor homogenizers. 0.5-1 için doku homojenize kadar doku büyük ölçüde ayrışmış min. Bakteri süspansiyon dökmek.
  2. Seçilen 10 hazırlamak x 0.9 mL steril PBS içeren dilutions tüpler homojenize süspansiyon 0.1 ml seri seyreltme tarafından dilutions. Nokta her seyreltme 0.1 mL % 10 BG önceden etiketli + Sm tabaklar ve % 70 etanol yıkama ve alev tarafından sterilize bir üçgen dağıtıcısı kullanarak süspansiyon yayıldı.
  3. Oda havası içinde 37 ° C'de plakaları için 4 gün kuluçkaya.
  4. Say ve adım 6.5 (şekil 6) olduğu gibi CFUs/organ hesaplamak. Bir alt limit algılama elde etmek için hangi bir organ homojenize Toplam hacim kullanılan birim tarafından ayrılmıştır bir plaka üzerinde nokta su katılmamış homogenate üzerinden (e.g., 0.3 mL Toplam hacim bölünmüş tarafından 0.1 mL su katılmamış eşittir 3 CFUs detecta alt sınırı ble).

8. kan işlenmesi

  1. İzole tam kan 18.000 x g 4 ° C'de kırmızı kan hücreleri cips için 30 dk için de içeren tüpler santrifüj kapasitesi.
  2. Dikkatle serum süpernatant ve damlalıklı önceden etiketli serum microcentrifuge tüp içine çıkar. Tüpler hazır daha fazla aşağı akım analiz kadar-20 ° C'de depolayın (i.e., toplam ve belirli IG ELISA).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Açıklanan modeli ana bilgisayar-patojen etkileşimleri sırasında aşı verimlilik ve bağışıklık yanıtı değerlendirmek için bir yöntem gösterir. Şekil 1 bağışıklık ve fareler bulaştırmak ve doku analizi için hasat kullanılan temsilcisi aşı programı gösteriyor. Şekil 2 fareler, ikna etmek için istihdam anestezi sistem kurulumu aşı ve bakteriyel inoculums sunmak müfettişler etkinleştirme gösterir. Şekil 3 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Aşı indüklenen dokunulmazlık B. boğmaca enfeksiyonu için eğitim için burada açıklanan kapsamlı protokol ana bilgisayar yanıt için a değişiklik-in diğer patojenleri değerlendirilmesi de izin verir. Protokol aşı teslim, aşı etkinliği aşağıdakileri belirlemek için yöntemleri anlatır patojen meydan okuma ve paralel diseksiyon bağışıklık fonksiyonu. Diğer patojenleri çalışma için protokol uyum içinde birkaç parametre değiştirilmesi gerekir. Bunlar, bunlarla hayvan anestezi, aşı kompozisyon, doz ve rota yönetim modu i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Ohio State Üniversitesi'nden 1R01AI125560-01 ve devreye alma fon tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2L indüksiyon odasıVeteriner Ekipmanları941444
FlurisoVet OneV1 501017herhangi bir marka uygundur
Bordet Gengou Agar BaseBD bioscience248200
KazeinSigmaC-7078
Kaamino asitlerVWRJ851-500GSüzgeç Scholte (SS) medya bileşenleri
L-Glutamik asitAraştırma Ürünleri IntG36020-500
L-ProlinAraştırma Ürünleri IntP50200-500
Sodyum KlorürFisherBP358-10
Potasyum Fosfat monobazikFisherBP362-1
Potasyum KlorürFisherP217-500
Magnezyum Klorür hekzahidratFisherM2670-500G
Kalsiyum KlorürFisherC75-500
Tris bazFisherBP153-1
L-sistein HClFisherBP376-100SS medya takviyeleri
Demir Sülfat heptahidratSigmaF-7002
NiasinAraştırma Ürünleri IntN20080-100
GlutatyonAraştırma Ürünleri IntG22010-25
Askorbik asitAraştırma Ürünleri IntA50040-500
RPMI 1640ThermoFisher Scientific11875093
FBSSigmaF2442-500mL  herhangi bir ABD kaynağı, ısıyla inaktive edilmemiş
gentamisinThermoFisher Scientific15710064
B-merkaptoetanolFisher BP176-100
15 mL dounce doku öğütücüWheaton357544benzer herhangi bir marka uygundur
Akülü El HomojenizatörüKontes / Sigma Z359971-1EAherhangi bir benzer marka uygundur
Aletler - makas, eğri makas, forseps, ince forseps, üçgen yayıcılarherhangi bir marka uygundur
3mL şırıngalarBD bioscience309657
15mL konik tüplerFisher 
1.5 mL mikrofüj tüpleriDenvilleC2170
70um hücre süzgeçleriFisher 
60mm plakalarThermoFisher Scientific130181
48 kuyulu doku kültürü plakalarıThermoFisher Scientific08-772-1C
1mL insülin şırıngası 28G1/2Fisher Scientific/Excel Int.14-841-31
Fare IFN-gamma ELISA Hazır-SET-Git! KitInvitrogen / eBioscience50-173-21
Fare IL-17 ELISA Hazır-SET-Başla! KitInvitrogen / eBioscience50-173-77
Fare IL-5 ELISA Hazır-SET-Başla! KitInvitrogen / eBioscience50-172-09
33965122363548

Kaynaklar

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
  2. Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
  3. Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
  4. Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
  5. Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
  6. Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
  7. McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
  8. Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
  9. Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
  10. Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
  11. Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
  12. Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
  13. Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
  14. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
  15. Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
  16. Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
  17. Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
  18. Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
  19. Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
  20. Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
  21. Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
  22. Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
  23. Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178(2010).
  24. Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
  25. Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
  26. Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
  27. Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
  28. Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469(1988).
  29. Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
  30. Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
  31. Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264(2013).
  32. Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
  33. Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
  34. Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
  35. Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359(2012).
  36. Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
  37. Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
  38. Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
  39. Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
  40. Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
  41. Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
  42. Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
  43. Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
  44. Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Konak-Patojen YanıtıFare İmmünizasyonuBakteriyel İnokülasyonDoku ToplamaCFU SayımıAkış SitometrisiELISpot AnaliziBordetella PertussisTh1 Th17 Polarizasyonu
Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.