Yöntem makalesi

Hücrelerin Cardiomyogenic potansiyeli geliştirmek için aynı anda elektrik ve mekanik stimülasyon

DOI:

10.3791/58934

⸱

18 Ocak 2019

 ,  , 
1Insuficiencia Cardiaca y Regeneración Cardiaca (ICREC) Research Program, Health Science Research Institute Germans Trias i Pujol, 2Amsterdam Universitair Medisch Centrum (UMC), Vrije Universiteit Amsterdam, Pulmonology and Physiology, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3Electronic and Biomedical Instrumentation Group, Departament d'Enginyeria Electrònica, Universitat Politècnica de Catalunya, 4Cardiology Service, Germans Trias i Pujol University Hospital, 5Department of Medicine, Universitat Autònoma de Barcelona, 6Centro de Investigación Biomédica en Red (CIBER) Cardiovascular, Instituto de Salud Carlos III

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada elektrik ve mekanik uyaranlara kardiyak Fizyoloji taklit kullanan bir hücre kesimin eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu elektromekanik stimülasyon işlem görmüş hücreleri cardiomyogenic potansiyelini artırır ve daha fazla hücre tedavisi, hastalık modelleme ve uyuşturucu taraması için umut verici bir stratejidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalp-damar hastalıkları gelişmiş ülkelerde ölüm önde gelen nedenidir. Sonuç olarak, etkili kardiyak hücre tedavileri için talep araştırmacılar kök hücre ve Biyomühendislik alanlarında vitro yüksek sadakat insan Miyokardiyum temel araştırma ve klinik uygulamaları geliştirmek için motive vardır. Ancak, kalp hücrelerinin olgunlaşmamış fenotip işlevsel olarak esas olarak mekanik ve elektrik sinyalleri tarafından karakterize yetişkin Miyokardiyum taklit doku alma konusunda bir kısıtlamadır. Böylece, bu iletişim kuralını amacı hazırlamak ve fizyolojik parametreler recapitulating hedef hücre nüfus ile elektromekanik stimülasyon, Olgun etmektir. Kalp doku mühendisliği daha fazla biyolojik yaklaşımlar doğru gelişen ve biyofiziksel uyaranlara üzerinde böylece, temel stratejileri ivme kazanmaktadır. Bu amaçla geliştirilen cihaz benzersiz ve özenle karakterize ve doğrulanmış bireysel ya da aynı anda elektrik ve mekanik stimülasyon sağlar. Buna ek olarak, metodoloji Bu uyarıcı ve belirli hücre nüfus için optimize edilmiş olsa da, bu kolayca diğer aygıtlar ve hücre hatları için adapte edilebilir. Sonuçları buraya elektromekanik stimülasyon sonra hücre nüfusunun artan kalp taahhüt kanıtı sunuyoruz. Elektromekanik teşvik hücreleri artan bir ifade ana kardiyak Marker, erken, yapısal ve kalsiyum düzenleyen genler de dahil olmak üzere gösterir. Bu hücre Klima daha da rejeneratif hücre tedavisi, hastalık modelleme ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için yararlı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalp fonksiyonu elektrik uyarma ve mekanik daralma kaplin temel alır. Kısaca, cardiomyocyte hücreler arası kavşak neredeyse zaman uyumlu kasılma kalbin pompa kan sistemik ve pulmoner sistemi aracılığıyla üretmek için elektrik sinyali yayma izin verir. Kalp hücreleri, bu nedenle, gen ifade ve hücresel fonksiyon düzenleyen elektrik ve mekanik Kuvvetleri tabi. Buna göre birçok grup mekanik ve elektrik stimülasyon kalp geliştirme, işlev ve olgunlaşma rolünü anlamak için kardiyak fizyolojik ortamı taklit kültür platformları geliştirilmesi için çalıştılar. Vitro elektrik ve mekanik elektrodlar tek tek kapsamlı işlevsel özellikleri geliştirmek, hücre olgunlaşma artırmak veya hücre-hücre kaplin ve kalsiyum1 işleme geliştirmek için kalp doku mühendisliği uygulanan , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. yine de, zaman uyumlu elektromekanik Klima gelişmekte olan bir uyarıcı ve protokol bir meydan okuma ve zorunlu optimizasyonu22yüzünden unexploited kalır.

Ön çalışma olarak bir arada elektriksel stimülasyon ve medya perfüzyon elektromekanik stimülasyon hitaben; Ancak, akışı zorlanma tabanlı deformasyon ventriküler dolum23,24,25/ tipik anlamına gelmez. Daha sonra daha fazla fizyolojik yaklaşımlar elektriksel uyaranlar fiziksel deformasyon ya da isovolumetric kasılma26,27,28,29,30 taklit etmek için streç ile birlikte ,31. Feng vd açıklanan Gelişmiş cardiomyocyte boyut ve contractile özelliklerini26raporlama 2005 yılında elektromekanik uyarım ilk gösteri. Wang vd mezenkimal kök hücre ile 5-azacytidine ön işleme ve aynı anda elektrik ve mekanik Klima, recellularization, hücre canlılığı, kardiyak farklılaşma ve27remodeling doku iyileştirilmesi uygulanan. Bu yayınlar beri daha fazla grup hücre monolayers elektromekanik uyarılması bildirilen veya doku (örneğin, siyah28, Vunjak-Novakovic29,31ve bizim grup30) ile mühendislik ilk şartına hücreleri içinde vivo30test. Kısaca, Morgan ve siyah gecikmeli kombine elektromekanik stimülasyon en iyi sonuçları28vermiştir çünkü elektrodlar arasındaki zamanlama çok önemli raporlama elektrik ve mekanik uyaranlara, birkaç kombinasyon test. Ardından, Godier-Furnémont ve ortak bir elektromekanik stimülasyon Protokolü mühendislik kalp kas yapıları yenidoğan sıçan kalp hücreleri için en iyi duruma getirilmiş ve elde, ilk kez bir pozitif güç frekanslı ilişki29. Daha sonra bizim grup ana kalp işaretleri vitro ifade elektromekanik preconditioned hücreleri artmış ve geniş yararlı içinde vivo etkileri, kardiyak fonksiyon gibi geliştirilmiş veya enfarktüsü gemi yoğunluğu artmış bildirdi sınır bölgesi30. En son yayın kök hücre kaynaklı cardiomyocytes kardiyak dokulardan bir olgunlaşma düzeyi yakın insan yetişkin kalp yapısı ve fonksiyonu31ulaştı elektromekanik Klima tabi gösterdi. Buna ek olarak, alternatif üç boyutlu stimülasyon platformları sağlamak elektrik, mekanik electroactive iskele oluşturan ve32topografik cues hücrelere bağlı. Ayrıca, mekanik deformasyon (hücre monolayer germe ve sıkıştırma) ayrıca normal fizyolojik şartlarda yanı sıra dışı koşullarda33taklit gerilebilir elektrotlar ile indüklenen.

Bu nedenle, mantığı fizyolojik koşullara göre tüp bebek elektromekanik uyaranlara bir hücre cardiomyogenic potansiyelini geliştirmek. Gerçekten de, bu uyarımı daha fazla klinik senaryosunda Miyokardiyum içine terapötik hücre entegrasyonlar parası veya doku olgunlaşma uyuşturucu-perdeleme uygulamaları için-artırmak.

Buna ek olarak, izole ve kardiyak insan Yağ dokusundan elde edilen progenitör hücrelerin nüfusu ile karakterize kökenli (kardiyak ATDPCs)34. Bu hücreler epicardial yağında bulunur. Bu hücreler miyokard infarktüsü tedavisinde yararlı histopatolojik ve fonksiyonel etkileri görüntülemek ve ayrıca kalp ve endotel farklılaşması potansiyel korumak. 30 , 35. bu faydaları sonra biyofizik stimülasyon artıracak ki biz onaylanmadığına karar.

Sonuç olarak, biz bir aygıt ve stimülasyon rejimi hücre nüfus ilgi için geliştirilen ve etkileri araştırıldı. Elektromekanik bu iletişim kuralı etkin hücrenin steril bir şekilde uzanan ikna etmek için yeni bir strateji ve noninvazif önceki yayınları36, elektrik alanı stimülasyon ile birlikte karşılaştırıldığında. Rapor burada teknik cihaz ve hücreleri elektrik, mekanik ve elektromekanik uyarılması için kullanılan yöntem ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Bu cihaz elektrik ve mekanik stimülasyon, bağımsız olarak veya aynı anda sağlar. Stimülasyon presterilized hücre destek, bir standart kültür plaka ve mekanik ve elektrik Kuvvetleri (Şekil 1) indükler bir platform yerleştirilen elektrotlar noninvaziv ve aseptik yeni bir yaklaşım ile gerçekleştirilir.

Platform ilâ altı kültür tabaklar ve bir sandviç yapı lazerle kesilmiş poly(methyl methacrylate) ve baskılı devre kartı parçaları oluşur tutabilir. Platform prototip bir monophasic programlanabilir bilgisayar kontrollü elektrikli uyarıcı, baskılı devre kartı elektrotlar ve yer altı 10 mm x 10 mm x 5 mm nikel kaplama Neodimyum sabit mıknatıslar sağlam bağlantı için bir arada kullanır bir tarafı kültür plakaların. Bir alüminyum çubuğu kültür plakaları öbür önüne yerleştirilir ve doğrusal bir rediktördür ile taşındı altı itici mıknatıslar (aynı modeli) da vardır. Motor bir RS-232 portu üzerinden ticari yazılım tarafından işletilen bir motor kontrolörü tarafından tahrik edilmektedir ( Tablo reçetesigörmek). Kullanıcı arabirimi ve programlanabilir Stimülatörü elektrik yoğunluğu, darbe süresi ve sıklığı, mekanik stimülasyon, onun iş hacmi, bakliyat, darbe genlik (mıknatıs gezi), sayısı sıklığını programlamak mümkün olduğunu ve yamaç.

figure-introduction-1
Resim 1 : Elektromekanik Stimülatörü. Hücre Klima için kullanılır (A) PDMS yapısı. (B) elektrodları ve mıknatıslar gibi PDMS yapı çiziminin. Elektromekanik Klima gerçekleştirmek için kullanılan baskılı devre kartı (platform) (C) detay. Bu panel Llucià-Valldeperas değiştirildi vd.30. (D) resmi elektromekanik stimülasyon platform ve Kullanıcı arabirimi (bilgisayar). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Uyarıcı ve elektromekanik Klima için yöntemi tam olarak iki uluslararası patent, WO-2013185818-A137 ve WO-2017125159-A138anlatılmıştır.

Hücreler, elektrotlar ve mıknatıslar için yapısal destek sağlamak üzere tasarlanmıştır yapıları olmuştur biyouyumlu silikon daha önce açıklanan10,21. Kısaca, kalıp ve fizyolojik düzeyleri yakın 1.3 MPa, bir Young katsayısı ile Oda sıcaklığında tedavi polydimethylsiloxane (PDMS) oluşur. İki iç enine yuvaları elektrotlar tutmak için ve iki 6 x 2 mm x 4 mm nikel kaplama Neodimyum mıknatıslar gömülü, bir hücre kültür Havuzu (10 x 10 x 2 mm) esnek bir alanda inşa içerir. Elektrotlar bir 2 x 3 mm x 12 mm politetrafloroetilin (PTFE) etrafında bükülmüş mm platin tel elektrot, yaklaşık 23 döner her (21 cm) bar çekirdek ve ters tarafı ikna için bir elektrik alanı oluşturmak için esnek çevrenin yer 0,2 ile inşa edilir elektriksel stimülasyon. Mekanik germe çekmek içinde gömülü mıknatıslar ve yanındaki kültür plaka ve hareketli alüminyum kol üzerine yerleştirilmiş dış mıknatıslar arasındaki manyetik çekim yoluyla elde edilir. Bu şekilde, cep destek steril bariyer bozmadan genişletilebilir. Bu yaklaşım bir hücre monolayer için uygundur ama üç boyutlu yapıları için de adapte.

Buna ek olarak, düzenli bir desen çizgili bir kırınım ızgara (1,250 oluklar/mm) kullanarak nerede hücreleri tohumlari, baskılı olabilir. Aydınlık alan ve floresan mikroskoplar altında PDMS yapı üzerinde kültürlü hücreleri doğrudan görselleştirme olan şeffaflık ve 0,5 mm kalınlığı nedeniyle mümkündür. Geçerli durumda dikey bir yüzey deseni, dik dik hücrelere hücre boyunca elektrik alanı degrade en aza indirir elektrik alanı hizalamak için germe kuvvetleri, PDMS kültür havuzu vardır.

Şekil 1 yapı ve stimülasyon için kullanılan aygıt ayrıntılı bir açıklamasını gösterir. PDMS oluşturmak ve özellikleri (Şekil 1A, B) uzanan hücre için optimize edilmiştir. Uyarıcı geliştirilen ve istenen elektrik ve mekanik stimülasyon PDMS yapı bağlı hücrelere etkili uygulanması için doğrulanmış. Bu işlem yazılım arabirimi (Şekil 1 c, D) iyi bağlantı ve Kullanıcı işlerliğini sağlamak içerir.

Bu özel cihaz kullanarak hücre uyarılması için yordam Protokolü bölümünde anlatılan.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada hasta örneklerinden insan kalp ATDPCs kullanır. Bunların kullanımı Yerel Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve tüm hastalar onay verdi. Çalışma protokolü Helsinki Bildirgesi içinde özetlenen ilkelere uygun olur.

1. hazırlıkları

  1. Otoklav iki cımbız, elektrik stimülasyonu için 12 platin PTFE elektrotlar ve 20 dk için 121 ° C'de biraz kağıt havlu.
  2. 12 PDMS ısmarlama yapıları (Şekil 1A) sterilize.
    1. 15 dakika oda sıcaklığında 5 mL steril, distile su ile manyetik ajitasyon sahip her yapı yıkayın.
    2. 5 min için oda sıcaklığında 1 x 5 mL % 70 etanol manyetik ajitasyon ile de ile yıkayın.
    3. Alkollü kalıntıları çıkarmak için yıkama, başına 10 dakika oda sıcaklığında 5 x 5 mL manyetik ajitasyon ile steril, distile su ile yıkayın.
    4. Akış kabine gecede içinde steril kağıt havlu üzerinde yapıları kuru.
    5. Onları kullanmak kadar steril 50 mL santrifüj tüplerde saklamak.

2. hücre (gün -1) tohum

  1. Hücre, tohum önce temizlenmiş PDMS yapıları steril tabakaları bana aktarın ve onları komple sterilizasyon sağlamak 5 min için ultraviyole ışığa maruz.
  2. Her yapı bir 35 mm hücre kültür plaka veya hemen hücre tohum için 6-şey plaka aktarın.
  3. Kalp ATDPCs bir konfluent T75 şişesi trypsinize.
    1. 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 5 mL ile T75 şişeye yıka.
    2. 1 mL % 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak 5 min için 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. Tripsin-EDTA devre dışı bırakabilirsiniz için tam orta 5 mL ekleyin.
    4. Toplamak tüm hücreleri 15 mL tüp ve yıkama şişeye 2 x 5 mL de kalan hücreleri toplamak için PBS ile.
    5. Vasıl 230 x g 22 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve onları hemasitometre odası ile saymak için tam orta 2 mL hücrelerde resuspend.
  4. Kardiyak ATDPCs (2. 5 x 105 hücre/mL) 200 µL 12 PDMS yapıları (~ %80 kaplı tohumlama yüzey sağlamak içinŞekil 1A, B), hücre havuza hücreleri tarafından ertesi gün tohum ve 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.
    Not: 2-4 h sonra hücreleri iliştirilmesi gerekir. Hücre inoculum hücre boyutu ve büyüme göre hazırlanır. Daha küçük hücreler için tohum yoğunluğu artırılmalıdır.
  5. Yavaşça prewarmed tam orta (α-MEM % 10 fetal Sığır serum, %1 L-glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) 2 mL plaka ekleyin.
  6. Yapıları kültür koşulları (genellikle 37 ° C ve % 5 CO2) adlı gecede kuluçkaya.

3. elektromekanik stimülasyon kurulum (0 gün)

  1. Yordamına başlamadan önce elektromekanik uyarılması için altı yapıları ve altı nonstimulated denetimleri olarak al. Stimülasyon başına az altı tabak ile aynı orta ses ile boş yapıları uygun elektrik alanı stimülasyon emin olmak için kullanın.
  2. % 70 etanol ile stimülasyon Üniteyi temizlemeden ve akış içinde kabine yerleştirin.
  3. Steril elektrotlar ve cımbız akışı kabine içinde getir.
  4. Medya % 90'ı kolayca elektrotlar ve yapıları işlemek için kültür plaka kaldırın. PDMS yapıları hem sabit hem de mobil mıknatıslar arasındaki manyetik çekim (PDMS deplasman mıknatıs doğru kültür plaka içinde) sağlamak için doğru konumda birincilik. Daha sonra platin tel elektrot bağlayıcılar ve belirlenen alanı PDMS seçenekli PTFE bölümünde bağlayın.
  5. Taze prewarmed tam orta 2.5 mL her yapı için ekleyin.
    Not: Kısırlık prosedürü boyunca korumak ve bir defada bir yapı üzerinde işlem yapar. Yapıları kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 kalan kadar kullanmak korumak.
  6. Tüm PDMS yapıları yerleştirilir ve elektrikle platforma bağlı, platform da kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2içine geri getir.
  7. Elektrik ve mekanik kaynağına bağlanmak.
  8. Stimülasyon programı yapılandırın. Elektrik ve mekanik stimülasyon rejimler elektrik uyarıcı ve mekanik stimülasyon denetleyen uygulama, Kullanıcı arabirimleri üzerinden belirtin. Senkronizasyon aşağıdaki gibi ayarlayın.
    1. Elektrik Stimülatörü geçin. Ana menü ekranda görünmesini bekleyin.
      1. O zaman, seçme seçenek 2: düzenlemek sıra + Enter.
      2. Sıra menü aşağıdaki gibi düzenleyin.
        1. Voltaj veya geçerli seçmek için modu sekmesini kullanın. + Tıklatarak geçerli seçin ve Entertuşuna basın.
        2. Genlik sekme için 1 (mA) +/- ile seçin ve Entertuşuna basın.
        3. Süre (T), 1000 (ms) +/- ile seçin ve Entertuşuna basın.
        4. +/- İle 2 (ms) için darbe süresi (Tw) belirleyin ve Entertuşuna basın.
        5. Tetik modu sekme için yazılım tarafından dış seçin ve Entertuşuna basın.
        6. Ana menüde seçin seçenek 4: sıra oluşturmak ve Entertuşuna basın.
          Not: seri bağlantı noktası üzerinden mekanik Stimülatörü uygulamasından bir harekete geçirme komutu alıncaya kadar bekleme modundayken elektrik uyarıcı dayanmaktadır.
    2. Denetim uygulama masası (Şekil 2C) mekanik stimülasyon bölümünde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
      1. 1000 (ms) Darbe dönemi metin denetimindeki yazmak.
      2. 500 (ms) mekanik darbe süresi ayarlamak için ON time (Tw) metin denetimindeki yazmak.
      3. Yazma 2.000 (% 10 Yapı uzama sunmak için AU) gezi metin denetimine. Bu adımları doğrusal kontrol motor sayısıdır.
        Not: burada uygulanan stimülasyon Protokolü alternatif akım 2 ms monophasic kare dalga bakliyat 50 mV/cm 1 Hz ve 7 gün boyunca uzanan % 10 oluşur. Mekanik darbe yükselişi ve sonbahar zamanlarında 100 ms kabaca kalp basıncı Nabız şeklini taklit için ayarlanır. Ayrıca, tekrarlama modu sürekli için ayarlanır ve bakliyat sayısını gösteren bir sayaç.
  9. Medya 2 x bir hafta (Pazartesi ve Perşembe öğleden sonra) değiştirin. Önce eski medya kaldırın; sonra sıcak ortam PDMS destek, asla doğrudan hücre havuzu tarafına ekleyin.
    Not: Hücrelerde bir yüksek büyüme oranı varsa, medya değişen 3 x hafta (örneğin, Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) olmalıdır. Tüm kabloları yeniden takın ve kesin gereklidir, ama kültür plakaları ve elektrot onların yerden kaldırmak için gerek yoktur.
  10. Deneme işlemi sonucunda örnekler toplamak.

4. örnek koleksiyon deneme (7 gün) sonunda

  1. RNA analizleri için
    1. Yapı yıkama 2 x 1 x PBS oda sıcaklığında 5 min için 3 mL ile.
    2. 3 mL % 0.05 tripsin-EDTA her plaka (tüm yapı karşılamak için yeterli) ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika bekleyin
    3. Sonra hücreleri ayrılır, tripsin-EDTA devre dışı bırakabilirsiniz için tam orta 2 mL ekleyin.
    4. Toplamak tüm hücrelerde 15 mL tüp ve yapı yıka 2 x 3 mL kalan hücreleri toplamak için PBS ile.
    5. 22 ° C'de 5 min için 230 x g , santrifüj
    6. Süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS 1 mL resuspend.
    7. Hücre çözümü 1,5 mL tüp ve 5 min için 230 x g , santrifüj aktarın.
    8. Süpernatant kaldırmak ve lizis reaktif daha da RNA izolasyonu için 700 µL Pelet-80 ° C'de depolayın.
    9. Üreticinin yönergelerini izleyerek ticari bir seti kullanarak RNA yalıtmak.
    10. Ters-uyarlamak teçhizat ve üreticinin protokolüne göre rasgele hexamers kullanarak izole RNA.
    11. Küçük RNA konsantrasyonları için preamplify ve sonraki gerçek zamanlı Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yapılmadan önce sonra 1:5 RNase free suyla seyreltik. Standart iletişim kuralı ile gerçek zamanlı RT-PCR için devam etmek ve ana kalp işaretleri kontrol edin.
      Not: Erken ve geç işaretleri farklı kategorilerden, kardiyak transkripsiyon faktörleri gibi tipik kalp işaretleri oluşturan (myocyte özgü artırıcı bir faktör 2A [MEF2A], GATA-bağlayıcı protein 4 [GATA-4]) ve yapısal (kardiyak troponin ı [cTnI], kardiyak Troponin T [cTnT], α-Aktinin) ve kalsiyum Yönetmeliği (Connexin43 [Cx43], sarco-/ endoplazmik retikulum Ca2 +-ATPaz [SERCA2])30. Protein yalıtım da gerekirse gerçekleştirilebilir. Eşzamanlı RNA ve protein yalıtım örnek miktarı az ise kitleri (Malzemeler tablo) ve piyasada bulunan reaktifler kullanarak aynı örnek ile gerçekleştirilebilir.
  2. İmmunostainings için
    Not: Bu doğrudan PDMS yapısı hücre havuzuna bağlı hücreleri üzerinde gerçekleştirilir. Bu nedenle, 1 cm x 1 cm parafin film hücre havuzu, plaka dışında üst kapak ne zaman, kuluçka çözümleri buharlaşma en aza indirmek için yerleştirerek, öneririz.
    1. Yapı yıkama 2 x PBS 3 mL oda sıcaklığında 5 min için ile.
    2. 2 mL % 10 formalin 15 dakika oda sıcaklığında sahip yapı bağlı hücreleri tamir.
    3. 3 hücreleri yıkama x PBS 3 mL oda sıcaklığında 5 min için ile. Uzun süreli depolama için 4 ° C'de % 0,1 Sodyum azid PBS içinde örnekleri bırakın
    4. PBS + %0.5 deterjan 3 mL hücrelerle permeabilize (3 x, her zaman oda sıcaklığında 5-10 dk.).
    5. Spesifik olmayan antikor bağlama engellemek için PBS + % 10 at serum + % 0,2 deterjan + %1 sığır serum albümin, oda sıcaklığında 1 h için 100 µL hücrelerle kuluçkaya.
    6. PBS + % 10 at serum + % 0,2 deterjan + %1 sığır serum albümin + 1 h için oda sıcaklığında birincil antikor 100 µL hücrelerle kuluçkaya. Örneğin, birincil antikorlar Cx43 karşı 1: (100) sarcomeric α-Aktinin (1: 100), GATA-4 (1:50), MEF2 (1:25) ve SERCA2 (1:50).
    7. 3 x 5 min için oda sıcaklığında PBS 3 mL ile yıkayın.
    8. PBS + 1 h için karanlıkta oda sıcaklığında ikincil antikor 100 µL hücrelerle kuluçkaya.
      Not: İkincil antikorlar ile farklı fluorophores Birleşik ve counterstaining bir ajan kullanılmıştır.
    9. Onları yıkamak PBS 3 mL 5 min için karanlıkta oda sıcaklığında ile 3 x.
    10. Nükleer (0.1 µg/mL) boyama 100 µL hücrelerle PBS içinde 15 dakika karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
    11. Onları yıkamak PBS 3 mL 5 min için karanlıkta oda sıcaklığında ile 3 x.
    12. Örnekleri PBS 3 mL % 0,1 Sodyum azid 4 ° c ile satın kadar saklayın.
      Not: Yapı kalınlığı 0,5 mm olduğu için mikroskop satın alma üzerinde ters floresan ve confocal mikroskoplar uzun çalışma mesafe hedefleri ile mümkündür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2 hücre uyarılması için takip genel şemayı temsil eder. Kısaca, hücreleri PDMS yapı tohumlari ve elektromekanik uyarılması için haftada iki kez gerçekleştirilen bir medya değişiklikle tabi. Nonstimulated hücreleri için elektromekanik Klima bir denetim olarak kullanılmıştır. Ayrıca, deneme için bir ilave kontrol eklendi ve subkutan ATDPCs kardiyak ATDPCs için bir denetim olarak kullanılmıştır. Subkutan ATDPCs kardiyak ATDPCs33geli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektromekanik stimülasyon hücreleri için düşman bir kardiyak ortamı hazırlama ve kardiyak bağlılıklarını artırılması için güvenli bir alternatif gibi görünüyor. Burada, kardiyak progenitör hücrelerin ana kalp işaretleri ifade ve oldu için açıklanan bir protokol hazır fare Miyokardiyum30sonraki onların Uygulanılmasından için yararlı olacağı bildirildi. Genel olarak, elektromekanik uyarılmış kardiyak ATDPCs genler ile ilgili erken, yapısal ve asla önceki elektriksel veya mekanik elektrodlar ile tek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stimülasyon aygıt ve iletişim kuralı daha önce patentli dışında (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1) yazarlar ifşa etmek hiçbir şey var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ICREC araştırma programı (IGTP, Badalona) ve elektronik ve Biyomedikal araçları grubu (UPC, Barcelona), özellikle Prof. J. niepyszny-Ferrer üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak, yazarlar kabul kök hücre translasyonel Tıp Dergisi ve AlphaMed daha önce yayımlanan rakamlar (Llucià-Valldeperas, et al. uyarlaması izin vermek için basın 30). bu prototip geliştirme ve tasarım iletişim kuralının "gayri resmi" de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), "gayri resmi" de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), Avrupa Komisyonu tarafından desteklenen 7. Çerçeve Programı () RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) ve Fundacion para la Innovación y la Prospectiva tr Salud tr España (FIPSE; 06-00001396-15).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > Uyarıcı< / güçlü>
nikel kaplı neodimyum mıknatıslarSüpermagnetQ-10-10-05-N
nikel kaplı neodimyum mıknatıslarSüpermagnetQ-06-04-02-HN
polidimetilsiloksan (PDMS) SYLGAR 184 Silikon Elastomer KitiDow Corning Corp184
kurallı kırınım ızgarası (1250 oluk / mm)Newport05RG150-1250-2
Motor kontrolörüFaulhaberMCLM-3006-S
LabviewUlusal Aletler
Hücre kültürü< / güçlü >
fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)Gibco70013-065
0.05 tripsin-EDTAGibco25300-120
35 mm hücre kültürü kabıBD Falcon45353001
fetal sığır serumu (FBS)Gibco10270-106
L-Glutamin 200 mM, 100xGibco25030-024
Penicilina/Streptomisin, 10.000 U/mLGibco15140-122
Minimum esansiyel orta kartal (alfa-MEM)SigmaM4526-24x500ML
Protein & RNA analizleri
proteaz inhibitörü kokteyliSigmaP8340
QIAzol Lizis ReaktifiQiagen79306
AllPrep RNA/Protein KitiQiagen50980404
Rneasy mini kitiQiagen74104
iTaq Üniversal Problar Tek Adımlı KitBio-Rad Laboratuvarları172-5140
Rastgele heksamerlerQiagen79236
TaqMan PreAmp MasterMix 2xUygulamalı Biyosistemler4391128
TaqMan Universal PCR MasterMixUygulamalı Biyosistemler4324018<
güçlü>Immunostaining
%10 formalinSigmaHT-501128-4L
at serumuSigmaH1138
Triton X-100SigmaX100-500ML
Sığır Serumu Albüminası (BSA)SigmaA7906-100G
PARAFILMSigmaP6543
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)SigmaD9542
Phalloidin Alexa 568InvitrogenA12380
sodyum azidSigmaS8032-100g
Hoechst 33342Sigma14533
Connexin-43 tavşan birincil antikoruSigmaC6219 lot # 061M4823
sarkomerik & alfa;-aktinin fare birincil antikoruSigmaA7811 lot # 080M4864
GATA-4 keçi birincil antikoruR& DAF2606 VAZ0515101
MEF2 tavşan birincil antikoruSanta Cruzsc-313 lot#E0611
SERCA2 keçi birincil antikoruSanta Cruzsc-8095 lot#D2709
Cy3 ikincil antikoruJackson ImmunoResearch711-165-152
Cy3 ikincil antikoruJackson ImmunoResearch715-165-151
Cy3 ikincil antikorJackson ImmunoResearch712-165-150
Cy2 ikincil antikorJackson ImmunoResearch715-225-150
Cy2 ikincil antikorJackson ImmunoResearch711-225-152
Cy2 ikincil antikorJackson ImmunoResearch705-225-147
%

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
  2. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
  3. Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
  4. Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
  5. Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
  7. Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
  8. Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
  9. Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
  10. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
  11. Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93(2014).
  12. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
  13. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
  14. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
  15. Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
  16. Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
  17. Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
  18. Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055(2011).
  19. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
  20. Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
  21. Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499(2018).
  22. Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
  23. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
  24. Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
  25. Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
  26. Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
  27. Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
  28. Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
  29. Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  30. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
  31. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  32. Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
  33. Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895(2018).
  34. Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
  35. Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
  36. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
  37. Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. , Barcelano, Spain. WO/2013/185818 (2013).
  38. Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. , Barceleno, Spain. WO/2017/125159 (2017).
  39. Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
  40. Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
  41. Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
  42. Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
  43. Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
  44. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  45. Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
  46. Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
  47. Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
  48. Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
  49. Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
  50. Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Elektromekanik Stim lasyonKardiyak ATDPC lerPDMS Konstr ktlerElektriksel Stim lasyonH cre EkimiGer ek Zamanl PCRGATA 4 EkspresyonuConnexin43 Da l m

İlgili makaleler