Method Article

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

DOI:

10.3791/58940

⸱

January 29th, 2019

 ,  , 
1Institute of Anatomy and Embryology, University Medical Center Göttingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir sinaptik protein ayirt boyama kullanarak işaret protein, confocal mikroskobu ve bilgisayar tabanlı analiz göre dağılımını belirlemek için nicel bir yaklaşım açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ciddi varlığı, yokluğu veya belirli sinaptik proteinlerin seviyeleri sinaptik iletimi etkisi altına alabiliyor. Işlev bir protein elucidating ek olarak, ayrıca dağılımı belirlemek için önemlidir. Burada, biz istihdam ayirt, confocal mikroskobu ve sinaptik protein (TPRGL veya SVAP30 olarak da adlandırılır) taşıyıcı dağılımını belirlemek için analiz bilgisayar tabanlı bir protokol tanımlamak. Biz taşıyıcı dağıtım sinaptik vezikül protein synaptophysin olan için böylece sinaptik veziküller bolluk göre nicel bir şekilde hareket ettirmek dağıtımını belirleme karşılaştırın. Özellikle, bu yöntem dağıtım farklı antikorlar veya mikroskoplar kullanarak proteinlerin veya farklı çalışmalar arasında karşılaştırılması için izin vermek için potansiyel olarak uygulanabilir. Bizim Yöntem immünfloresan stainings doğasında değişkenliği mutlak floresans düzeyleri yerine bir oranı verimli kaçınmanızı sağlar. Ek olarak, farklı düzeylerde bir proteinin dağıtım analiz etmek araştırmacı tarif yöntemi sağlar: beyin bölgeleri için farklı katmanları oluşur veya duyusal gibi bir beyin alanına farklı milletlere dilimlere tüm beyin üzerinden cortices. Taşıyıcı sinaptik veziküller ile ilişkili bir omurgalılar özgü proteindir. Bu yöntemle, gösterdiğimiz taşıyıcı heterogeneously yüksek seviyelerde ventral yarayan, septal çekirdekleri ve amigdala ve hipokampus farklı katmanları gibi tek beyin bölgeleri içinde beyin bölgeleri arasında dağıtılır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinir hücreleri arasındaki iletişimi sinapslarda denilen özel kişi sitelerinde olur. Sinapsların sayısız sinaptik iletimi yönetmek farklı protein içerir. Bazı bu proteinlerin sinir sistemi boyunca heterojen bir dağılımını göstermek ve her synapse1' mevcut değildir. Bir tür bir protein için sinaptik veziküller astar sürece dahil Munc13 örnektir. Heterogeneously beyin2dağıtılır, Munc13, ve farklı izoformlarının vardır ve belirli izoformlarının olup kısa vadeli sinaptik plastisite ve sinaptik vezikül dynamics3, üzerinde etkili olabileceği 4 , 5. bu nedenle, beyin bölgeleri arasında farklı sinaptik proteinlerin varlığı tespit edebilmek için hayati önem taşıyor.

Seçim yöntemleri için miktar sinaptik proteinler - defa - kütle spektrometresi ve Western blot yerine, immünhistokimya6,7,8,9vardır. Bazı durumlarda, miktar ve spesifik proteinlerin (yani, Wilhelm ve ark. lokalizasyonu değerlendirmek için birbirlerini tamamlayıcı için çeşitli yöntemler kullanılır 10). miktar ilgi sadece immünfloresan stainings istihdam biyokimyasal herhangi bir yöntem kullanarak gerek kalmadan proteinlerin ve yerelleştirme için biz tarif işte yöntem sağlar. Başka bir avantaj burada miktar çok daha küçük bir alana yapılabilir ve bu nedenle, daha belirgin, bu daha başka yöntemlerle elde var. Ancak, bir güvenilir referans protein faiz protein dağılımı değerlendirmek gerektiğini dikkate almak zorunda.

Floresan immünhistokimya tarafından boyama yerelleştirme proteinlerin beyin bölgeleri arasında yanı sıra farklı nöronal bölmeleri içinde düzenli olarak tanımlamak için bize izin verir. Farklı bölmeleri tanımlamak için belirli işaretleri kullanılır. Genellikle, synapsin ve synaptophysin11 karşı antikor Fagot karşı antikor presynaptic terminal12etkin bölgenin etiket iken sinaptik veziküller, etiketlemek için kullanılabilir. Veziküler glutamat taşıyıcılar (vGluT) veya veziküler GABA ışınlama (vGAT), gibi veziküler taşıyıcılar13 eksitatör ve inhibitör14 presynaptic terminalleri, sırasıyla etiketlemek için kullanılır. Postsinaptik tarafında, Homer protein karşı antikor postsinaptik terminalleri ve postsinaptik yoğunluğu protein 95 (PSD95)15,16,17 veya gephyrin18 karşı antikor işaretlemek için istihdam edilebilir , 19 , 20 eksitatör veya inhibitör postsinaptik terminalleri, sırasıyla etiketleyebilirsiniz. Faiz ve işaretleri yukarıda açıklanan olanlar gibi bir protein karşı antikor kullanarak, bir tür protein lokalizasyonu belirleyebilirsiniz. Bugüne kadar birçok çalışma bu nitel şekilde21' yaptık. Ancak, güvenilir bir şekilde belirli bir sinaptik protein fark dağılımını belirlemek için biri sadece varlığını veya yokluğunu aynı zamanda onun göreli yoğunlaşmasını belirlemeniz gerekir değil. Sinapsların yoğunluğu ve boyutları heterojen sinaptik marker ve faiz protein arasındaki oran kurmak önemli hale getirir. Aksi takdirde, sinaps zengini bölgeleri hipokampüs piramit katmanları ve beyincik moleküler tabakası gibi yüksek yoğunluklu sinaptik proteinlerin, sinapslarda daha yüksek yoğunluk nedeniyle sadece ama bu proteinin güçlü bir varlığı nedeniyle değil gösterecektir Her synapse (Örneğin, Wallrafen ve Dresbach1). Öte yandan, nöronal soma (Örneğin, TGN3822) proteinler genelde güçlü bir varlık hipokampal piramit hücre katmanı veya hipokampal veya serebellar granül hücre katmanı nöronal hücre gövdeleri yüksek konsantrasyon nedeniyle gösterir Bu alanlarda. Bu nedenle, homojen olmayan bu dağıtım yapıları, bu durumda synapses, faiz kendisi protein dağıtımını yanlış bir tahmin için yol açabilir. Ayrıca, bir içsel değişkenlik immunohistokimyasal stainings örnekleri arasında yoğunluklarda boyama olduğunu. Burada açıklanan protokol bu dikkate alır ve immunohistokimyasal yöntemleri ortaya çıkan diğer uyarılar yanı sıra böyle önyargıları önler.

Bizim son çalışma, 16 farklı beyin alanları1arasında bu yöntem biz (TPRGL23 veya SVAP3024da denir) taşıyıcı fark ifade tanımlamak için kullanılan. Taşıyıcı Derneği sinaptik veziküller bulunabilir ve nörotransmitter yayın25,26,27etkiler, omurgalılar özgü sinaptik proteindir. Biz taşıyıcı ifade sinaptik veziküller, bereket için synaptophysin bir sinaptik vezikül başvuru işaretçisi olarak için boyama ile ilgili. Özellikle septum nükleuslar, ventral yarayan ve amigdala Mover yüksek düzeyde bulduk. Hippocampus içinde taşıyıcı, türdeş olmayan bir dağıtım içi hipokampal hesaplama ve giriş ve çıkış katmanları düşük düzeyleri ile ilgili katmanlarında yüksek seviyelerde bulduk.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı canlı hayvanlar üzerinde deneyler anlamına gelmez. Hayvanların beyin örneklerini almak için ötenazi ile ilgili deneyler onay numarası altında T 10/30 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) yerel hayvan koruma yetkilileri tarafından kabul edildi.

Not: Bu iletişim kuralı için 3 Yetişkin erkek C57BL/6 fareler kullanıldı.

1. numune hazırlama

  1. Sabitleştirici ve 0.1 M fosfat tampon (PB; bkz: Tablo 1) hazırlayın.
  2. Hayvan transcardial perfüzyon tarafından Gage ve ark. içinde açıklandığı gibi tamir 28. 0,9 kanla önce yıkayın % NaCl-çözüm, sonra %4 paraformaldehyde (PFA) ile 30 mL sıvı.
  3. Kafatası makasla açın ve dikkatle doku zarar görmesini önlemek için künt kenarları olan bir kaşık kullanarak beyin yalıtır.
  4. 50 mL tepki tüp sabitleştirici ile doldurun ve % 4 beyinde postfix PFA gecede 4 ° C'de.
  5. Sabitleştirici kaldırmak ve 50 mL 0.1 M PB bir shaker 30 dk için üzerinde beyin yıkama.
  6. Yıkandıktan sonra 0.1 M PB 48 h ya da cryoprotection için 4 ° C'de tüp içinde batmadan kadar % 30 sükroz 50 mL tepki tüpte beyinde kuluçkaya.
  7. Cryoprotected beyin keskin bir bıçak ile kesme, bir cryomold içinde yer ve en iyi kesim ısı ile (OCT) bileşik embed. Bubbles kaçınmak. Beyin yönlendirmek ve cryomold-80 ° C dondurucuda dondurma.
  8. Kesit için dondurulmuş doku bağlayın. Cryomicrotome sıcaklık en az 15 dakika için doku kesit daha önce equilibrate.
  9. Beyin 25 µm kalınlığında koronal dilimler halinde bölüm. OKT'yi dikkatle bir cam kanca ile beyin dokusu dokunmadan dokun. İyi bir 24 iyi plaka başına 3 bitişik dilim toplamak ve onları boyama kadar 0.1 M PB 4 ° C'de depolayın.
    Not: Protokol burada iki haftaya kadar duraklatılmış. Uzun depolama süreleri doku kalitesi ile müdahale ve böylece denemenin sonucu etkiler.

2. ayirt

  1. Engelleme tampon, antikor arabellek, arabellek 1 ve çamaşır tampon (bkz. Tablo 1) 2 yıkama dahil olmak üzere çözümleri hazırlayın.
  2. Dilimleri bir kez aşırı OCT kaldırmak için PB ile yıkayın.
    1. Bir plastik pipet ile çözüm beyin dilimler halinde emme olmadan kaldırın. 1000 µL pipet ile taze PB 250 µL ekleyin.
      Dikkat: Dilimleri gerektiğini kurumasına, yani kaldırmak ve sıvıları iyi şey ekleyin.
  3. PB plastik pipet ile kaldırın ve engelleme arabelleği iyi 1000 µL pipet ile başına 250 µL ekleyin. Shaker üzerinde (RT) Oda sıcaklığında 3 h için kuluçkaya.
  4. Kuluçka süresi sırasında birincil antikor antikor arabellekte bir tepki tüp sulandırmak. İyi 250 µL antikor arabellek kullanıp antikor uygun miktarda ekleyebilirsiniz (bkz. Tablo 2) tarafından doğrudan 2 µL pipet kullanarak çözüm pipetting. Çözüm yavaşça yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından karıştırın. Girdap kısa bir süre sonra uygun karıştırma sağlamak için.
    Not: arka plan floresans belirlemek için stainings da birincil antikor eklemeden yapılmalıdır. Bunun için dilim olmadan protokolüne göre birincil antikor antikor çözümde kuluçkaya.
  5. Kuluçka süresi sonra plastik pipet ile engelleme tampon kaldırın ve antikor çözüm iyi başına birincil antikorlar içeren 250 µL ekleyin. Gecede 4 ° C'de bir shaker üzerinde birincil antikor dilimlerle kuluçkaya.
  6. Ertesi gün, dilimleri tampon 1 3 yıkama ile yıkayın x 10 dk RT bir shaker üzerinde az için.
    1. Bir plastik pipet ile orta kaldırın ve, arabellek 1 şey yıkama 300 µL ekleyin. RT 10 dk. tekrar 3 kez için kuluçkaya.
  7. Çamaşır adımları sırasında fluorophore birleştiğinde ikincil antikor antikor arabellekte bir tepki tüp sulandırmak. İyi 250 µL antikor arabellek kullanıp antikor uygun miktarda ekleyebilirsiniz (bkz. Tablo 2) tarafından doğrudan 2 µL pipet kullanarak çözüm pipetting. Çözüm yavaşça yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından karıştırın. Girdap kısa bir süre sonra uygun karıştırma sağlamak için.
    Dikkat: antikorlar ışığa duyarlı olduğundan, bu andan itibaren tüm adımları karanlıkta gerçekleştirilmesi gerekir.
  8. Sonra çamaşır adımları, çamaşır tampon plastik pipet ile ve antikor çözüm iyi başına ikincil antikorlar içeren 250 µL Ekle Kaldır. Karanlıkta RT, 90 dk için ikincil antikor dilimlerle kuluçkaya.
  9. Dilimleri tampon 2 3 yıkama ile yıkayın x 10 dk RT. az için
  10. Çamaşır adımları sırasında 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.1 M PB 1:2000 bir konsantrasyon içinde sulandırmak.
  11. Bir plastik pipet ile çamaşır tampon 2 kaldırın ve DAPI çözüm iyi başına 250 µL ekleyin. RT shaker üzerinde 5 min için kuluçkaya.
  12. Bir plastik pipet DAPI çözümle kaldırın ve 0.1 M PB iyi 1000 µL pipet ile başına 500 µL ekleyin.
  13. Dilimleri mikroskop slaytlarda bağlayın.
    1. Stereoscope altından bir mikroskop slayt yerleştirin. İyi bir fırça ile üç ayrı damla 0.1 M PB bir slayda ekleyin. Bir dilim başına damla mikroskop slayt üzerine yerleştirin.
    2. İnce fırça dümdüz ve mikroskop slaytta dilimleri yönlendirmek için kullanın.
    3. Bütün dilimleri doğru yerleştirilmiş durumda, bir doku ile aşırı PB kaldırmak ve slayt dikkatle kuru.
      Dikkat: Beyin dilimleri tamamen kurutma önlemek.
    4. Orta bir slayda katıştırma 80 µL ekleyin. Dikkatli bir şekilde coverslip bir slayda, böylece beyin dilimleri katıştırma indirin.
    5. Slaytlar için 1-2 h duman başlıklı kuru bırakın (ışığa maruz önlemek için kapak) ve 4 ° C'de bir mikroskop slayt kutusunda saklamak
      Not: Protokol burada duraklatılmış.

3. görüntüleme

  1. Gömme orta tamamen sertleştirilmiş sonra mikroskop slayt confocal mikroskop altında yerleştirin.
    Not: benzer görüntü kalitesi Epifluorescence mikroskopi deconvolution yazılımı ile kombine verim.
  2. Lazer ayarlarını artıyor veya kaç piksel gri değerlerden en büyük dağıtım sağlamak için pozlanmış böylece her kanal için lazer şiddeti azalıyor.
  3. Tüm beyin dilimin farklı kanallar için sanal dokular elde etmek.
    1. Düşsel bilgisayar yazılımı içinde (bkz. Tablo reçetesi) fayans seçeneğini belirleyin ve el ile Döşeme bölge Kurile beyin dilim betimlemek.
    2. Destek puan kiremit bölgesi boyunca dağıtır ve Doğrulamak döşeme bölgeler/pozisyonlar... basarak farklı destek noktaları için odak ayarlamak
    3. İstediğiniz çözünürlük ve dosya boyutu ortaya çıkan görüntü göre Satın alma modu ayarlarını ve tarama başlatın.
  4. Tarama tamamlandığında, dikiş fonksiyonu sanal doku işlemek için kullanın. Olarak Görüntü vermeişleviyle bir .tif dosyasına.

4. bilgisayar tabanlı analiz

  1. Dosya tıklayarak FIJI29 bir resim tüm tek kanallarda yüklemek | Açık.
  2. Serbest seçim aracı ile DAPI kanaldaki bir yarımküre betimlemek. Düzen tıklatarak seçimi maskesi oluşturun | Seçimi | Maskesi oluşturma.
  3. Analiz tıklatarak tek kanal (taşıyıcı ve synaptophysin) için Ortalama floresans yoğunluğunu belirlemek | Ölçü.
    Not: her kanal için Ortalama floresans yoğunluk değerleri belirlemek için farklı kanallar seçtiğinizden emin olun.
  4. Ortalama floresans yoğunluğu tek kanallar için bir elektronik tabloya kopyalayın.
  5. Tek kanal bir ilgi alanı içinde ortalama floresans yoğunluk alan serbest seçim aracıyla aynı zamanda operasyona tarafından belirler. Bir fare beyin atlas başvuru olarak kullanın.
  6. 4.1 4.5 tüm hemisferlerin ve ilgi tüm alanları için yineleyin.
    Not: daha sonra bir yarımküre buna ilgi alanı değerleri karşılaştırmak için her hemisphere değerlerini ayrı ayrı belirlemek (bkz. Adım 5.2).

5. veri işleme

  1. Arka plan floresans yüksek olması durumunda ( konuyabakın), bir arka plan çıkarma gerekli olabilir. Bunun için olmadan birincil antikor referans protein karşı işlenen dilim için Ortalama floresans yoğunluğunu belirlemek (burada: synaptophysin) ve bu değer için belgili tanımlık beyin bölgeleri ve hemisferlerin elde edilen tüm değerler den çıkarın.
  2. Ne zaman ortalama floresans yoğunluklarda her Yarımküre ve ilgi her alan için tek kanalları için tespit (bkz. Tablo 3) değeri taşıyıcı için synaptophysin () için değer bölünerek synaptophysin için taşıyıcı oranını hesaplama sarı Tablo3). Bu eylem her Yarımküre ve ilgi her alan için ayrı olarak gerçekleştirin.
  3. İlgi bir alan için elde edilen oranı Yarımküre için ilgi alanı oranını belirlemek için karşılık gelen Yarımküre (turuncu Tablo3) için elde oranla bölün.
  4. Göreli yol verici bereket belirlemek için onun sapma 1 ( Tablo 3' te kırmızı) belirlenerek yüzde 5,2 elde oranı çevirmek. 1,25 oranında bu nedenle ortalamanın üzerinde % 25 göreli bir taşıyıcı bereket vereceğini ve 0.75 oranında bir göreli yol verici bereket ortalamanın altında % 25 verim.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Boyama desenleri farklı imleyici temsilcisi Şekil 1' de görülebilir. Desen protein dağıtım bağlı olarak değişir. Beş rostro kaudal düzeyi örnekleri(a)sütunlarda gösterilir-(E). Bir temsilci DAPI boyama ilk satırında gösterilir: DAPI bir hücre DNA'yı bağlıdır ve böylece çekirdeklerin lekeli. Bu punctate bir düzen içinde sonuçlanır. Yüksek hücre yoğunluklu bölgelerde düşük hücre yoğunlukları ile daha parlak bölgeleridir. Bir ör...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yöntemi burada sunulan bir protein göreli bir işaretleyici protein bolluğu ilgi dağılımıyla bilinen bir dağıtım miktarının amaçlamaktadır. Ayirt boyama boyama yoğunluklarda farklı dilimleri arasında yüksek bir değişkenlik gösterebilir. Burada açıklanan miktar yaklaşım Yarımküre protein ortalama faiz oranını belirleyerek bu sorunu kaçınmanızı sağlar. Bu nedenle, farklı boyama şiddetlerde dilimleri arasında iptal edilir ve nicel açıklamasını sağlar.

Her ayirt protokolü ile nitel veya nicel, çeşi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Irmgard Weiss mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Yazarlar destek Hermes Pofantis ve Andoniya Petkova tarafından kabul. Yazarlar ayrıca Avrupa Nörolojik Bilimler Enstitüsü LSM800 ve teknik destek, özellikle Dr. Nils Halbsgut tarafından kullanımı için teşekkür ederiz. Bu eser Göttingen Üniversitesi Tıp Merkezi nde tarafından finanse edildi. JSV nano mikroskobu ve moleküler Fizyoloji beyin (CNMPB) desteği Merkezi tarafından kabul eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL reaksiyon tüpleriEppendorf30120094
50 mL reaksiyon tüpleriGreiner Bio-One227261
multiwell 24 kuyuluFisher Scientific                                                                                                                                                                                              087721H
plastik pipet (tek kullanımlık)Sarstedt861,176
1000 mL pipetRainin 
2 ml pipetEppendorf3123000012
Vortex Genius 3 IKA3340001
Menzel mikroskop slaytlarıFisher Scientific                                                                                                                                                                                  10144633CF
StereoskopLeica
LSM800ZeissKonfokal mikroskop
dondurma mikrotomuLeica
PBS (10X)Roche                                                                                                                                                                           
PFASigma                                                                                                                                                                                      P6148-1kg
NaClBioFroxx1394KG001
sükrozneoFroxx1104KG001
Doku TekSakura 4583EKİM
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NaH2PO4Merck1,063,460,500
normal keçi serumuMerck MilliporeS26-100ML
normal eşek serumuMerckS30-100ML
Triton X-100Merck1.086.031.000
tavşan anti-MoverSinaptik SistemlerRRID: AB_10804285
kobay anti-Sinaptofizin SinaptikSistemlerRRID: AB_1210382
eşek anti-tavşan AF647Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2492288
keçi anti-fare AF488Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2337438
Mowiol4-88Calbiochem                                                                                                                                                                                                   
ZEN2 mavi yazılımıZeiss Mikroskopiyazılımı
FIJIImageJAnaliz yazılımı
Microsoft ExcelMicrosoft
1701438211666789001475904

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58(2018).
  2. Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
  3. Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
  4. Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
  5. Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
  6. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
  7. Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
  8. Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
  9. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
  10. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  11. Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
  12. Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
  13. Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
  14. Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
  15. Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
  16. Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
  17. Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
  18. Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
  19. Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
  20. Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
  21. Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
  22. Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
  23. Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
  24. Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
  25. Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
  26. Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
  30. Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
  31. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
  32. Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
  33. Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synaptic Protein DistributionImmunofluorescence ProtocolConfocal MicroscopyComputer Based AnalysisMover ProteinSynaptophysin ComparisonBrain Slice AnalysisFluorescence Intensity RatioHeterogeneous DistributionHippocampal Layers

Related Articles