Yöntem makalesi

Yüksek kaliteli lazer RNA izolasyonu için paslanmaz bir protokol yakalama insan öldükten sonra beyincik Microdissected Purkinje hücreleri

DOI:

10.3791/58953

⸱

17 Ocak 2019

 ,  , 
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 2Division of Movement Disorders, Department of Neurology, Yale University, 3Department of Chronic Disease Epidemiology, Yale School of Public Health, Yale University, 4Center for Neuroepidemiology and Clinical Neurological Research, Yale School of Medicine, Yale University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı bir leke içermeyen yaklaşım görselleştirmek ve insan öldükten sonra beyincik lazer yakalama mikrodiseksiyon üzerinden taze donmuş dokudan Purkinje hücreleri izole etmek için kullanır. Bu iletişim kuralının amacını RNA-sıralama için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA üretmektir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) ve cytologically/veya phenotypically ilgili hücreleri veya hànzú doku bölgelerden topluluğu için sağlayan avantajlı bir araçtır. Yakalanan ürün-ebilmek var olmak kullanılmış içinde çeşitli protein, moleküler Yöntemler DNA veya RNA izolasyon. Ancak, ölüm sonrası insan beyin dokusundan RNA'ın koruma özellikle meydan okuyor. LCM için standart görselleştirme teknikleri histolojik gerektirmez veya RNA immunohistokimyasal boyama işlemleri daha da fazla bozulmasına yol açar. Bu nedenle, biz paslanmaz bir protokol RNA bütünlük öldükten sonra insan beyin dokusu içinde korunması amacı ile LCM içinde görüntüleme için tasarlanmıştır. Beyincik Purkinje hücre boyutu ve karakteristik konumu nedeniyle paslanmaz görselleştirme için iyi bir adaydır. Serebellar korteksin hücre yoğunluğu, yapım onları yüksek büyütme mikroskobu altında tanımlamak için iyi bir güzel örneği farklı farklı katmanları vardır. Purkinje hücreleri küçük nöronlar yoğun hücresel ağdır, granül hücre katmanı ve hücre gövdelerinde seyrek moleküler katmanı arasında yer alan büyük nöronlar vardır. Bu mimarisi nedeniyle, paslanmaz görselleştirme kullanımı mümkün olduğunu. Bu fenotip taklit diğer organ veya hücre sistemleri de uygun olacaktır. Paslanmaz Protokolü taze donmuş doku etanol ile düzeltmek ve lipidler yüksek büyütme ışık mikroskobu altında geliştirilmiş morfolojik görselleştirme için ksilen ile kaldırmak için tasarlanmıştır. Bu iletişim kuralı için diğer fiksasyon yöntemleri hesaba katmaz ve bir ultraviyole (UV) kullanarak yakalanan taze donmuş doku örnekleri için özel olarak tasarlanmıştır-LCM sistem. Burada, kesit ve taze donmuş öldükten sonra insan serebellar dokusu ve arıtma RNA'ın UV-LCM tarafından sonraki RNA-sıralama için RNA kalitesini koruyarak izole Purkinje hücrelerinden sabitleme için tam bir iletişim kuralı mevcut. Bizim ellerde bu protokolü reaktifler boyama gerek kalmadan hücresel görselleştirme olağanüstü düzeyde üretir ve RNA yüksek RNA bütünlük sayılarla (≥8) transkripsiyon profil oluşturma denemeleri için gerektiği gibi verimleri.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) sonraki tatlı tahrik değerlendirme için patolojik olarak ilgili hücreleri ayırma verir bir değerli araştırma aracıdır. Moleküler analiz bu türdeş olmayan doku örnekleri ve korelasyon patolojik ve klinik verilerle biyolojik araştırma1translasyonel önemini değerlendirmek gerekli bir adım kullanmaktır. Gen ifadesi verileri RNA üzerinden analiz ederken, donmuş doku bölümleri kullanımını RNA mükemmel kalitesi için verdiğinden önerilir yanı sıra miktar2ekranı kaplamış. Evet yüksek kalite ve RNA miktarı RNA sıralama3den anlamlı veriler için gerekli olan kurulmuştur. Ancak, RNA LCM için taze donmuş post-mortem doku kullanırken, RNA bozulması büyük bir sorun, ölümü üzerine hemen gerçekleşir ve ölçüde kendi doku toplama Yöntem4ile,5 ilişkili çeşitli faktörler tarafından aracılık ettiği gibi olduğunu . Ayrıca, boyama teknikleri histolojik ayrıntıları ve hücre kimliğini tanımak için gerektiğinde RNA bozulması şiddetlenir. Hematoksilen ve eozin, Nisl leke gibi teknikleri boyama İhtisas ayirt ve immünhistokimya çevreleyen stroma hücreleri ayırt yararlı ama RNA aşağılamak ve transkript ifade değiştirmek için gösterilen profilleri6. Bu nedenle, bizim laboratuvar RNA öldükten sonra insan beyincik LCM yalıtım Purkinje nöronların sonra RNA sıralama amaçları için korumak için özel olarak tasarlanmış bir paslanmaz protokol yarattı.

Taze donmuş doku LCM için işleme, fiksasyon yöntemi degisken RNA ve doku bütünlüğü etkileyebilir. Formalin fiksasyon morfolojik korunması için standart, ancak bu cross-linking nedenleri RNA parçası ve RNA amplifikasyon7ile müdahale. 1cross-linking teşvik değil koagülatif bir sabitleştirici olarak etanol fiksasyon RNA izolasyonu için daha iyi bir alternatiftir. Lipidler dokudan kaldırır gibi doku morfoloji görselleştirme, ksilen en iyi seçenek, artırmaktır. Ancak, orada sınırlamalar ne zaman belgili tanımlık doku kurumasına ve kırılgan neden doku parçalanma üzerine lazer yakalama7haline LCM, ksilen kullanan denir. Ksilen da uçucu bir toksin ve düzgün bir duman mahallede ele alınması gerekir. Yine de, ksilen doku görselleştirme Ayrıca RNA bütünlük8koruma sırasında artırmak için gösterilmiştir. Bu nedenle, bizim iletişim kuralı kullanımı % 70 etanol fiksasyon ve etanol dehidratasyon, ksilen kuluçka morfolojik netlik için ardından etrafında merkezleri.

Onlar hızlı, hassas ve RNA kalite farklı gösterildiği gibi farklı türde mikrodiseksiyon lazer tabanlı sistemleri, unutmamak önemlidir. Kızılötesi (IR) lazer yakalama mikrodiseksiyon ve ultraviyole (UV) lazer microbeam mikrodiseksiyon sistemleri neredeyse aynı anda8ortaya her iki roman LCM platform olduğunu. IR-LCM sistem "doğrudan doku bölümüne yerleştirilen bir şeffaf termoplastik film kullanarak bir iletişim sistemi" istihdam ve ilgi hücreleri seçerek film tarafından odaklı bakliyat bir IR Lazer uygun. Alternatif olarak, UV-LCM sistemidir "bir temassız sistem sayede odaklı lazer ışını uzakta hücreleri ya da doku; ilgi bölgelerinde keser" bir ters veya dik mikroskop tasarımı kullanma iki mevcut ticari platformlarda yapılandırmasına doku içine bir koleksiyon aygıt yerçekimine karşı mancınık bir lazer kaynaklı basınç dalgası tarafından kazanılır veya doku sırasıyla yerçekimi tarafından toplanan. UV-LCM sisteminin önemli avantajı daha hızlı hücre satın alma, temassız yaklaşım ve daha kesin diseksiyon nedeniyle bir çok küçük lazer ışın çapı9ile kirlenme ücretsiz toplama içerir. Bu iletişim kuralı bir UV-LCM sistemi için özel olarak tasarlanmıştır ve bir IR-LCM sisteminde test edilmemiştir. Koleksiyon kap içine biriken hücreler, bir coverslip kullanımını artırır hücreleri toplama kap girmek mümkün olacak gibi ya da UV-LCM sistem tasarımı, hücresel netlik mikroskobu sırasında uygun, değildir. Bu nedenle, doku görselleştirme geliştirmek için karşı sıvı dolgulu koleksiyonu kapaklar UV-LCM sistemlerindeki mikroskobik görüntüleme için bir coverslip olarak hareket için tasarlanmıştır opak koleksiyonu büyük harf kullanımını test ettik. Sıvı buharlaşma tabidir ve mikroskop çalışırken sık sık değiştirilmesi gerekir gibi sıvı dolgulu koleksiyonu kapaklar, zor olabilir. Yakalanan doku hemen7çözülür gibi zaman RNA istikrar için önemli bir faktör haline gelir.

Beyincik esansiyel tremor (ET) hastalarda ve beyincik ilgili nörodejeneratif bozuklukları öldükten sonra neuropathologic değişimler bizim laboratuvar çalışmaları. Biz morfolojik değişiklikler ET durumlarda denetimleri, Purkinje hücreleri, azaltılmış bir dizi de dahil olmak üzere karşı ayırt Purkinje hücreleri merkezli arttı dendritik regresyon ve çeşitli aksonal değişikliklere, bize önermeyi önde gelen göstermiştir bu Purkinje hücre dejenerasyonu çekirdek biyolojik ET Patogenez10,11,12,13özelliğidir. Transkripsiyon profil oluşturma birçok nörolojik hastalıklarda dejeneratif hücresel değişiklikler temel alınan moleküler temeli keşfetmek için kullanılmıştır. Ancak, beyin doku bölgeleri gibi heterojen örnekleri transkripsiyon profillerden effectually düşük bereket transkript ifade maske ve/veya etkilenen, sadece küçük bir nüfus içinde moleküler değişiklikler tespiti azaltmak serebellar korteksin Purkinje hücreleri gibi hücrelerin. Örneğin, Purkinje hücreleri büyük ölçüde serebellar korteksin bol granül hücrelerde tarafından yaklaşık 1:3000 tarafından sayıca; Böylece, etkili bir şekilde hedef için onların transcriptome bu nöronların belirli yalıtımı gerektirir. Serebellar korteksin farklı hücre yoğunluğu ve hücre boyutu farklı katmanları tarafından belirlendi. Bu hücresel mimarisi boyama reaktif boya içeren olmadan taze donmuş doku örneği görselleştirmek idealdir. Teorik olarak, bu iletişim kuralını da benzer farklı doku var diğer doku türlerine uygulanabilir organizasyon.

Bu protokol insan öldükten sonra beyincik Purkinje hücre görselleştirme için özel olarak çalışmak üzere tasarlanmıştır. Görselleştirme ve dokuların birçok türde RNA koruma, her iki IR - ve UV-LCM amaçlı boyama fiksasyon için çok sayıda protokoller bulunmaktadır. Ne zaman UV-LCM için deneysel bir tasarım düşünürken, bireylerin ihtiyaçları ve başlangıç ve bitiş malzeme gereksinimlerini en iyi sığacak şekilde onların Protokolü terzi. Burada, biz öldükten sonra insan beyincik boya boyama reaktifler içeren yüksek kaliteli RNA transcriptome için hazırlamak gerek kalmadan Purkinje hücreleri görüntülenmesi için geliştirilmiş bir yöntem sağlamak için farklı LCM iletişim kuralları, bir çok yönünü birleştirmek sıralama.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için kullanılan tüm insan örneklerini onam ile elde edilen ve Columbia Üniversitesi ve Yale Üniversitesi İç İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır.

Not: Bu iletişim kuralının tamamı katı RNA yönergeleri, işleme takip etmeli sayede eldivenli elini her zaman kullanıldığında, tüm yüzeyler RNase decontaminator ile temizlenir ve RNA/DNA/nükleaz ücretsiz tüm çalışma malzemelerdir.

1. doku başlayan okek önce RNA bütünlüğünü test

Not: RNA kalite test tarafından pek çok yöntem yapılabilir. RNA tüm bölümünden bir temsilcisi RNA bütünlük sayı (RIN) için örnek sağlamak için test emin olun.

  1. Dikkatle doku örneği deneysel tasarım parametre içinde uygun dahil etmek üzere seçin. Cryostat kesme, adım 1.2 için taşıyın. Aksi takdirde, doku buna göre işlemek ve adım 1.11 için hareket.
  2. Kuru buz iki kapsayıcı olsun. Boyutu örnek sayısına bağlıdır.
    1. Kuru buz ilk kapsayıcısına doku koduyla bir boş, etiketli 2 mL tüp getirin.
      Not: Dondurmak tüpler için 10 dakika sürer. Tüpler doku yerleştirerek önce dondurulmuş olması; yoksa, doku boru yüzey üzerinde eriyecek.
    2. Kuru buz ikinci bir kap içinde doku RNA onay gerektiren bir-80 ° C dondurucudan yerleştirin.
  3. Cryostat temiz. Adım 4.7 ayrıntılı yordam Temizleme için bkz.
  4. Kuru buz dokuyu ve doku dekontamine RNase jilet ile küçük bir bölümünü kesti. Doku yaklaşık 1 cm x 1 cm boyutunda olmalıdır.
  5. Bir cryostat 'chuck' bileşik bir yaklaşık 3 mm yüksek höyüğün en uygun kesme sıcaklık (OCT) yerleştirin ve kısmen dondurmak sağlar. Sonra doku OKT üstüne yerleştirin — bas OCT, sadece üzerine dinlenmek izin değil.
  6. OCT sertleşince, chuck bağlı doku ile cryostat kesim kol ve pozisyon cryostat bıçak önünde yerleştirin.
  7. Doku bile olana 30 mikron bölümleri trim.
  8. Doku ve donmuş 2 mL tüp yerde 300 mikron kesilmiş. Tüp kuru buza koyun.
  9. 'Chuck'tan' dokuyu ve hazır kadar hapse geri Kuru buz yerleştirin.
  10. 1.4-1.9 tüm dokular için yineleyin.
  11. Tüm örneklerini tamamlandıktan sonra sağlanan RNA ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo #15) kullanarak RNA ayıklayın. Detaylı bir protokol RNA ayıklama kit ile sağlanır. Toplama tüp membran ve DNaz sindirim (Malzemeler tablo #16) için isteğe bağlı adım kuru için isteğe bağlı bir adım de dahil olmak üzere tüm yönergeleri izleyin.
  12. Kalite değerlendirme bioanalyzer14üzerinden ayıklanan RNA bütünlüğünü sınayın.

2. başlangıç kesit önce hazırlamak için LCM

  1. Slaytlar sahipleri doku LCM için kesit, her turdan önce temiz. Gün gece kurutma tam izin kullanmadan temizlik yordamı gerçekleştirin.
    Not:     slayt sahipleri doku bölümü fiksasyonu etanol ve Ksilen takas için kullanılır.
    1. Tutucu yordam Temizleme slayt: RNase decontaminator dietil tedavi pyrocarbonate (DEPC) su tarafından takip ile durulayın. Herhangi bir toz veya diğer hava kirliliği önleme baş aşağı bir RNA/DNA/nükleaz ücretsiz yüzeyi kuru gecede olanak sağlar.
      Uyarı: DEPC çok zehirli ve ele ve gereken EH & S Standart tehlikeli kimyasalların protokolünü kullanarak bertaraf.
  2. Temiz RNase ile kesit için fırçalar decontaminator ve kuru gece kalmak için izin verir. Herhangi bir toz ve diğer kirletici kaçının.
  3. UV ışığı, oda sıcaklığında 30 dakika altında yer membran slaytlar. UV slaytlara daha--dan 1-2 gün önce kullanmak maruz yapmak. Bu bağlama membran slayda dokusunun artırır.
    Not: Adım 2.3 slayt için doku parça (bkz. Adım 4.4) aynı günde gerçekleşmesi UV tedavi sağlar adım 4 ile kombine edilebilir.

3. RNase Free su ve yüksek kaliteli etanol ile fiksasyon çözümleri hazırlayın

Not: Tüm çözümler her deneme için taze hazırlanır. Adım 1.1 yordam Temizleme slayt tutucu tamamlanmasını sağlamak. Tüm çözümler slayt sahipleri içinde hazırlanır.

  1. 30 mL % 100 etanol bir slayt tutucuya yerleştirin.
  2. Etanol RNase/DNaz/nükleaz ücretsiz suyla seyreltik. Yer 30 mL % 95 etanol bir tutucu slayt ve buza koy.
  3. Etanol RNase/DNaz/nükleaz ücretsiz suyla seyreltik. Yer 30 mL % 70 etanol bir tutucu slayt ve buza koy.
  4. Yer 30 mL % 100 ksilen iki slayt sahipleri ayırmak ve #1 ve #2 etiket.

4. Cryostat doku kesit için hazırlayın

  1. Bir kova dolusu buz etanol çözümleri ve doku için Kuru buz ile bir kapsayıcı için olsun.
    Uyarı: Kuru buz son derece soğuk, bu yüzden koruyucu eldiven kullanın. Aynı kapta buz ve kuru buz şey koymayın. Farklı sıcaklıklarda buz ve kuru buz onları forma belirsiz bir sıcaklıkta birlikte neden olur.
  2. Doku-80 ° C dondurucu ve yer taşıma için kuru buzda cryostat için kaldırın.
  3. Cryostat ayarları:
    1. Bölüm kalınlığı 14 mikron için ayarlayın.
    2. Döşeme kalınlığı 30 mikron doku miktarını korumak için ayarlayın.
    3. Çift odası ve sıcaklıklar tutan numune ile Kriyostaz için-18 ° C'ye Oda sıcaklığı (CT) ayarla Bir ayar ile Kriyostaz için-17 ° c sıcaklık ayarla
    4. Çift odası ve sıcaklık tutan numune ile Kriyostaz için nesne sıcaklık (OT)-16 ° c için ayarlayın.
      Not: OT bile kesme emin olmak için CT sıcak olması gerekir. Doku hala parçalama, OT-15 ° C ile arttırılabilir ve CT-18 ° C'ye artırılabilir
  4. Doku cryostat için en uygun sıcaklık gelmek için izin vermek en az 20 dakika yerleştirin.
    Not: Doku en uygun sıcaklıkta değilse, kesme üzerine parça. Doku, RNA bütünlüğünün korunması ve buz kristal oluşumu engellemek için önceki gece-20 ° C'de koymayın. Doku olduğu kadar izin zamanı gerektiği gibi sorunsuz kesmek için en uygun sıcaklık equilibrate. İsteğe bağlı uygulama, UV altında slayt kuluçka burada (bkz. Adım 1.3) ortaya çıkabilir.
  5. 'Chuck' cryostat cryostat sıcaklığa gelmesini sağlamak en az 20 dakika yerleştirin.
  6. Temiz fırçalar cryostat cryostat sıcaklığa gelmesini sağlamak en az 20 dakika yerleştirin.
  7. Cryostat temiz
    1. Sahne sahne alanı'nda donma önlemek için RNA/DNA/nükleaz boş su ile seyreltilmiş RNase decontaminator ve % 70 etanol 1:1 karışımı ile temizleyin.
    2. Sahne Alanı'nda RNase decontaminator ve bıçak tutucu yerde yeni bir tek kullanımlık cryostat bıçak temiz. En az 20 dk cryostat blade cryostat sıcaklık için gelmek için izin verir.
    3. Anti-roll plaka RNase decontaminator ile temiz ve sahne alanı'na ekleyebilirsiniz. En az 20 dk anti-roll plaka cryostat sıcaklık için gelmek için izin verir.
      Not: Bir anti-rulo levha kesme için gerekli değildir ancak şiddetle tavsiye edilir. Anti-roll plaka yoksa, temiz bir fırça alternatif olarak çalışır. Anti-roll plaka doğru sıcaklıkta değilse, doku eritebilir veya kesme üzerine sopa.

5. doku kesit

  1. (~ 1 cm x 1 cm) dokusunun kesit için küçük bir parça kes. Kalan doku Kuru buz /-80 ° C dondurucu için dönmek.
    Not: Doku bölümü Purkinje hücreleri konumlandırıldığı ~ %95 serebellar korteksin olduğundan emin olun.
  2. Bir yaklaşık 3 mm yüksek Höyük, Ekim 'chuck' kapsayacak şekilde yerleştirin. Küçük bir höyük kadar yavaş, dairesel bir hareketle, üst katmanları kurarak başlayın.
  3. OCT kısmen donmuş, ancak yine de bazı sıvı ortasında kez doku OCT üstüne yerleştirin. Doku, derin Ekim izin ver tamamen donmuş kadar OCT üstüne oturmak için doku içine itmeyin. Bu 1-2 dk sürer.
  4. Donmuş OCT ile chuck ve doku cryostat kesim kol yerleştirin. Kesici bıçağın ile aynı hizada doku ayarlayın.
  5. Doku kesim kol için yeni sıcaklığı ayarlamak 15-20 dakika oturmak izin.
    Not: Doku kalınlığına bağlı olarak, sıcaklık calıştıkları için zamana ihtiyacım vardı. Temiz bir şekilde kesmek için gerekli sürece oturup doku sağlar. OT ve CT doku sıcaklık calıştıkları ile yardımcı olmak için ayarlayın.
  6. Yavaş yavaş daha yakın doku için bıçak taşımak. Doku bıçak ulaştı sonra kırpma işlemini başlatmak. Döşeme kalınlığı 30 mikron için ayarlamanız gerekir.
  7. Korteks katmanlar görünür hale gelene kadar 2-3 x kırpın.
  8. Yer ve hemen cryostat bıçak üzerinde anti-roll plaka hizalayın.
    Not: Gümüş bir çizgi üzerinden arayüz bıçak ve anti-roll plaka cryostat ışıkta görünür. Bu bıçak kenarına doğrudan anti-roll plaka olduğunu gösterir.
  9. 14 mikron bölümleri kesmeye başlayın. Düzgün kesme bölümleri düz anti-roll plaka altında olacak.
    Not: Doku takılırsa anti-roll plaka yeterince soğuk olduğundan emin olun. Eğer gerekli, Kuru bir parça yerleştirerek dış (yan sahne değil müessir) isteği üzerine hızla buz anti-roll plaka chill.
  10. 4-6 Bölüm kesin ve cryostat sahne alanı boyunca yatay hizalamadan.
  11. Slayt olta balıkçılığı, doku tüm parçaları aynı anda toplamak.
    Not: Fırçaları kullanma, doku slayt üzerine almak için kullanıma hazır olur biter kaldırın. Teker teker bir bölüm seçme. Oda sıcaklığında havaya maruz RNA bütünlük düşer.
    Uyarı: Cryostat aşaması touch membran izin vermeyin. Membran sahne dokunursa, cam slayttan ayırmak başlayacak ve LCM girişimi sırasında hatalara neden olur.
  12. Hemen adım 6 için hareket. Fiksasyon gecikme yok.

6. doku/leke-daha az görselleştirme sabitleme

  1. Hemen etanol fiksasyon protokolü için hareket
  2. Slayt 2 min için % 70 etanol ile slayt sahibi yerleştirin — buz üzerinde.
  3. 45 için % 95 etanol ile slayt sahibi slayt yer s — buz üzerinde.
  4. Slayt 2 min için % 100 etanol ile slayt sahibi yerleştirin —, RT.
  5. Slayt slayt tutucu ksilen 1 ile 3 kez daldırma —, RT.
  6. Ksilen 2 5 min için ile slayt sahibi slayt yer —, RT.
  7. İçin en az 30 dk. daha uzun kuru kere 60 dk için en uygun kadar temiz bir alanda kurumasını sağlar.
    Uyarı: Slaytlar bir duman mahallede kurutma için ayağa kalk. Ksilen kırılgandır. Döşeme slaytlar düz ksilen havuzuna doku çok karanlık olmak neden olur doku bölümünde neden olur.

7. isteğe bağlı — Slayt depolama

  1. Kurutulmuş slaytları tek tek 50 mL tüpler (tüp başına bir slayt düzeninde) ve-80 ° C dondurucu yerde 7 gün için yerleştirin.
    Not: Slaytların-80 ° C dondurucuya koyarak önce kuru olması gerekir. Parçacıklar doku ve membran embed kurutucu tüpü içinde kullanmayın. Tüp kap sıkı olduğundan emin olun; Eğer değilse, yoğunlaşma slayt üzerinde kullanım için çözdürme ortaya çıkar.
    Uyarı: Doku görselleştirme kalitesini yaptığı gibi RNA bütünlük 7 gün sonra azalır.

8. çözdürme kullanılmak üzere slaytlar depolanabilir

  1. Tek bir slayt ile tüp-80 ° C dondurucu 1s kullanım amacı önce kaldırın.
  2. Hemen tüp açmayın. Tüp oda sıcaklığına gelmesini sağlar. Yoğunlaşma tüp sadece dış tarafında ortaya çıkar.
  3. Bir kez tüp oda sıcaklığına gelmiş ve tüm yoğunlaşma öldü (yaklaşık 30-40 dk), kapağını çıkarın ve oda sıcaklığında hava slayta bulaşmasına neden.
  4. Slayt 15-20 dk. kapaklı tüp içinde slayt kaldırıldı bırakmak için oda sıcaklığında alışmana izin.
    Not: Slayt şimdi LCM için hazırdır.

9. lazer yakalama mikrodiseksiyon Purkinje hücre:

Not: Bu bölüm iletişim kuralının yalnızca Purkinje hücreleri sonraki RNA sıralama için yakalama için ilgili özelliklerini ele alınacak. Bu bölüm Kullanıcı UV Lazer yakalama mikroskop ve bağlı yazılım hakkında bilginiz olduğunu varsayar.

  1. Temiz mikroskop sahne ve kap koleksiyonu RNase decontaminator ile kol.
  2. Eldivenli elleriyle, mikroskop slaytta ve 500 μL opak kap koleksiyonu kolundan yerleştirin.
    Not: Her zaman uygun RNA tekniği RNase decontaminator ile çalışma alanını temizleyerek sağlamak ve slayt veya opak kap dokunmadan süre eldivenli elini kullan. Eldiven-ebilmek var olmak çıkarmak bir kez slayt ve kap gidiyoruz ve lazer yakalama başladı.
  3. Düşük büyütme oranında opak kap kap göz parça halinde görüntülenir tüm alanı kaplamaktadır sağlanması serebellar doku üzerinde hizalayın.
    Not: Sadece mikroskop göz parça opak kap merkezli olduğunu gösterir. Kamera kapağı doku üzerinde ortalanmış göstermez. Lazer yakalama kapsam tasarımına bağlı olarak, opak kap ile görselleştirme ya tek veya göz parça ve kamera görüntülenmeyecektir göz parça olacak.
  4. 5 x - 10 x objektif lens ile serebellar katmanlar görselleştirmek ve moleküler katman ve granül hücre katmanı (Purkinje hücre katmanı) kesiştiği bölümünün üzerine imleci getirin.
  5. 40 X taşımak ve Purkinje hücreleri görselleştirin.
    Not: İçin örnek görsel bkz: Şekil 1 ve Şekil 2 .
  6. Purkinje hücreleri yakalamaya başla.
    Not: RNA-sıralama, en az 5 gerçekleştirmek için ng RNA'ın gereklidir. Yaklaşık 1600-2000 Purkinje hücreleri yeterli RNA malzeme sıralama için neden. RNA istikrarlı için mikroskop, en fazla 8 saat olacak. UV enerji ve UV odak toplama düzeyleri doğru olduğundan emin olmak için önce sınayın. Zamanla, doku kurumaya devam edecek ve UV enerji ve UV odak değiştirilmesi gerekebilir.

10. RNA koleksiyonu yazı LCM

  1. Hücre lizis arabellek hazırlamak (her zaman taze hazırlamak)
    1. 2-mercaptoethanol lizis tampon 1: 100, seyreltik (10 μL:1 mL, sırasıyla). Lizis (RLT) arabellek Malzemeler tablo (#14 ve #15) sağlanır.
  2. Hücre lizis arabelleği 50 μL yukarı dönük olacak şekilde kap ile opak kap ekleyin. Dikkatle tüp üzerinde kapağı kapatın.
  3. 1 dk. için baş aşağı tüp bırakın.
  4. Girdap tüp 30 s ve hızlı bir şekilde lizis tampon tüp altına spin.
  5. Tüp yeniden açın ve 10.2-10,4 arasındaki adımları yineleyin.
  6. Tüm örneklerini bitmiş ve RNA çıkarılması (Malzemeler tablo #14) için hazır olana 100 μL lizis arabellek ve-80 ° C dondurucu gelen RNA içeren tüp yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı taze donmuş öldükten sonra insan beyin dokusu UV-LCM için hazırlanması için gereken adımları ayrıntılı. Taze donmuş beyin dokusu duyarlık yüksek düzeyde kesmek zor olabilir gibi ayrıntılı özellikleri ve ek açıklamaları cryostat kesme için verilir. En önemli nokta göz önünde taze donmuş doku aşırı soğuk ve bir cryostat daha sıcak sıcaklık alışmana için zaman önemli miktarda gerektirir olmasıdır. Bu adımı aceleye gelmez ve nasıl bu adım başarılı veya başarısız bu protokol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan Protokolü özellikle morfolojik farklı dokuların UV-LCM için görselleştirme Paslanmaz bir yaklaşım olarak değiştirilir. Bu yöntem doku görselleştirme geliştirilmiş bir düzeyde muhafaza süre sonraki doğrudan RNA sıralama, RNA bütünlüğü en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. İnsan doku15farklı moleküler profilde anlamak için gerekli hücrelerin en saf nüfus mümkün oluşturmak için farklı hücre tipleri için yakalama, ayırt etmek için yeteneğidir. Bu protokol kapsamında doku seçimi, a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, New York beyin banka, Dr. Jean Paul Vonsattel ve Dr. Etty Cortés, kesme ve donmuş insan beyin doku örnekleri bu deneyler için koruma onların yardımını kabul etmek istiyorum. Yazarlar kim cömertçe esansiyel Tremor devam eden araştırma için onların beyin bağışlanan bireylerin kabul etmek istiyorum. Doktor Faust ve Dr Martuscello Columbia Üniversitesi patoloji bölümü ve hücre biyolojisi onların sürekli destek ve çekirdek araştırma alanı için kabul etmek istiyorum. Yazarlar NIH R01 NS088257 Louis/Faust kabul etmek istiyorum) Bu proje için araştırma fonu için. LCM görüntüleri Confocal içinde gerçekleştirilen ve ihtisas mikroskobu paylaşılan kaynak-Herbert Irving kapsamlı Kanser Merkezi, Columbia Üniversitesi, NIH tarafından desteklenen hibe #P30 CA013696 (Ulusal Kanser Enstitüsü). Yazarlar Theresa Swayne ve Laura Munteanu özel mikroskobu ile devam eden onların yardımını kabul etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MembraneSlide NF 1.0 PENZeiss415190-9081-000Doku için membran slaytları. Cam kaydırakların kullanılmasını önermiyoruz.
AdhesiveCap 500 OpakZeiss415190-9201-000Opak kapaklar yalnızca ters çevrilmiş dürbünlerde görselleştirmeyi geliştirmek için kullanılır
RNase AwayMolecular BioProducts7005-11Diğer RNase dekontaminasyon ürünleri de uygundur. Çalışmadan önce tüm yüzeyleri temizlemek için kullanın.
200 Proof EthanolDecon Laboratories2701Alternatif Etanol kullanıyorsanız, yüksek kaliteyi sağlayın. Doku fiksasyonu için gereklidir.
Ksilenler (Sertifikalı ACS)Fisher ScientificX5P-1GALAlternatif ksilen kullanıyorsanız, yüksek kaliteyi sağlayın. Doku görselleştirme için gereklidir.
UltraPure Damıtılmış SuInvitrogen10977-015Diğer RNA/DNA/Nükleaz içermeyen su da uygundur. Sadece etanol seyreltmede kullanılır.
Slide-Fix Sürgülü Kavanozlar Evergreen240-5440-G8KHerhangi bir sürgü tutucu/kavanoz da uygundur. Kullanmadan önce temizlenmelidir. Kesit almayı takiben sabitleme için kullanılır.
Viraj Önleyici Plaka, Assy. 70 mm 100 & mu; mLeica Biosystems14041933980Rulo önleyici plaka tipi, kriyostat tipine ve sahnedeki bağlantı konumuna göre belirlenir. Tüm kriyostatların farklı gereksinimleri vardır.
Dietil pirokarbonat (DEPC)Sigma AldrichD5758-50mLDEPC herhangi bir satıcıdan yapacaktır. Su arıtma talimatlarını izleyin. 
KimwipesFisher Scientific06-666AKimwipes herhangi bir satıcıdan sipariş edilebilir ve herhangi bir boyutta kullanılabilir. Mikroskop ve kriyostatı temizlemek için kimmendiller kullanılmalıdır.
Tissue-Plus OCT BileşikFisher Scientific23-730-571Herhangi bir OCT markası kabul edilebilir. OCT'ye hiçbir doku gömülmeyecektir, dokuyu 'aynaya' takmak zordur.
Edge-Rite Düşük Profilli Mikrotom BıçaklarıThermo Scientific4280LBıçak tipi, kriyostat tipine göre belirlenir. Tüm kriyostatların farklı gereksinimleri vardır.
Leica Microsystems 3P  25 + 30MM KRİYOSTAT AYNALARIFisher ScientificNC0558768Ayna tipi, kriyostat tipine göre belirlenir. Tüm kriyostatların farklı gereksinimleri vardır. Her iki boyut da uygundur. 
RNeasy Micro Kit (50)Qiagen74004LCM sonrası RNA ekstraksiyonu için gereklidir. Opak kapaktan yakalanan hücreleri toplamak için gerekli olan RLT Lizis tamponu.
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104Başlangıç dokularının RNA bütünlüğünü test etmek için LCM'den önce gerçekleştirilen kesit hazırlıklarının RNA ekstraksiyonu için gereklidir.
RNaz İçermeyen DNaz SetiQiagen79254Dnase, saf bir RNA popülasyonuna izin vermek için herhangi bir DNA'yı çıkaracaktır. Dnase'nin taze yapıldığından emin olun.
2-MerkaptoetanolSigma AldrichM6250-100MLKullanıcının takdirine bağlı olarak satın alınan hacim. Hücre lizizi için RLT tamponuna eklenmesi için gereklidir. RNaz aktivitesini önler.
Küre Bilimsel  Lot Sertifikalı Dereceli Mikrosantrifüj Tüpü (2 mL)Fisher Scientific22-010-092RNaz içermeyen, DNaz içermeyen, insan DNA'sı içermeyen ve Pirojen içermeyen herhangi bir 2 mL tüp yeterli olacaktır.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, H., et al. Laser capture microdissection for the investigative pathologist. Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).
  2. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  3. Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).
  4. Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).
  5. Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality. Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).
  6. Wang, H., et al. Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA. BMC Genomics. 7, 97(2006).
  7. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Springer. (2018).
  8. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  9. Graeme, M. I. Laser Capture Microdissection. Third edn. , Humana Press. (2018).
  10. Louis, E. D. Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology. Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).
  11. Choe, M., et al. Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis. Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).
  12. Louis, E. D., et al. Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls. Brain. , Pt 12 3297-3307 (2007).
  13. Louis, E. D., et al. Neuropathologic findings in essential tremor. Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).
  14. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  15. Jensen, E. Laser Capture Microdissection. The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).
  16. Waller, R., et al. Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).
  17. Lee, S., et al. Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).
  18. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  19. Sonne, S. B., et al. Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ. PLoS One. 4 (5), 5536(2009).
  20. Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
  21. Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (1), 442(2017).
  22. Kumar, A., et al. Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).
  23. Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PLoS One. 8 (2), 56507(2013).
  24. Walker, D. G., et al. Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program. Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).
  25. Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).
  26. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  27. Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Scientific Reports. 6, 25533(2016).
  28. Carl Zeiss Microscopy. , Carl Zeiss. Germany. (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lazer Yakalama MikrodisseksiyonuUV LCM SistemiKsilenle SabitlemeEtanolle DehidratasyonRNaz DekontaminasyonuRNA B t nl k Numaras

İlgili makaleler