Yöntem makalesi

Bütün genomik DNA analizi için olağanüstü uzun okunur sıralama

27.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58954

⸱

15 Mart 2019

 ,  ,  ,  , 
1Genome Technologies, Jackson Laboratory for Genomic Medicine

Bu makalede

Özet

Uzun okunur dizileri büyük ölçüde karmaşık genleri ve yapısal değişim karakterizasyonu montajı kolaylaştırmak. Biz sıralama nanopore tabanlı platformlar tarafından olağanüstü uzun dizileri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım kilobaz okuma orta kapsama ile yüzlerce insan hücreleri oluşturmak için değiştirilen kitaplığı hazırlıklar ardından en iyi duruma getirilmiş bir DNA ekstraksiyon benimser.

Özet

Üçüncü nesil tek molekül DNA sıralama teknolojileri artık bu önemli ölçüde teklif okuma karmaşık genleri ve karmaşık yapısal değişik analizini Meclisi kolaylaştırabilir uzunluğu. Nanopore platform tek molekül sıralama doğrudan gözenekleri geçitle DNA tarafından aracılı geçerli değişiklikleri ölçerek gerçekleştirmek ve kilobaz (kb) okuma en az sermaye maliyeti ile yüzlerce oluşturabilir. Bu platform için çeşitli uygulamalar birçok araştırmacılar tarafından kabul edilmiştir. Uzun sıralama okuma uzunlukları elde nanopore sıralama platformlar değerini kaldıraç için en önemli faktördür. Olağanüstü uzun okuma oluşturmak için özel dikkat DNA kırılmaları önlemek ve verimli sıralama şablonları oluşturmak için verimliliği elde etmek için gereklidir. Burada, biz ve bir nanopore aygıtında sıralama yüksek molekül ağırlıklı (HMW) DNA ekstraksiyon taze veya dondurulmuş hücrelerden, Kütüphane inşaat mekanik kesme veya transposase parçalanma, dahil olmak üzere olağanüstü uzun DNA sıralama detaylı Protokolü sağlar. 20-25 µg HMW DNA dan N50 90-100 KB okuma uzunluğu transposase ile parçalanma aracılı ve yöntem N50 okuma uzunluğu 50-70 KB mekanik kesme ile elde edebilirsiniz. İletişim kuralı tüm genom sıralama yapısal türevleri ve genom derleme tespiti için gerçekleştirmek için DNA memeli hücrelerinden çıkarılan uygulanabilir. DNA ekstraksiyon ve enzimatik reaksiyonları ek iyileştirmeler daha fazla okuma yüksekliğini arttırın ve yararını genişletin.

Giriş

Son on yıl içinde kitlesel paralel ve son derece hassas ikinci nesil yüksek üretilen iş sıralama teknolojileri bir patlama Biyomedikal keşif ve teknolojik yenilik1,2,3tahrik var. Teknik gelişmeler rağmen ikinci nesil platformları tarafından oluşturulan veri kısa okuma karmaşık genomik bölgeleri çözümünde etkisiz ve hangi insan önemli rol oynarlar yapısal genomik türevleri (SVs), tespiti sınırlıdır Evrim ve hastalıklar4,5. Ayrıca, veri kısa okuma tekrarlama varyasyon gideremezseniz ve genetik varyantların6/ haplogrubundan phasing yüksek beklentileri karşılayan uygun olmayan.

Son tek molekül sıralama Teklifler önemli ölçüde uzun sürüyor okuma SVs7,8,9tam spektrum ve teklifler doğru ve eksiksiz derleme kompleks tespiti kolaylaştırabilir uzunluğu mikrobiyal ve memeli genleri6,10. Nanopore platformu doğrudan gözenekleri11,12,13geçitle DNA tarafından aracılı geçerli değişiklikleri ölçerek tek molekül sıralama gerçekleştirir. Herhangi bir varolan DNA sıralama kimya, nanopore sıralama uzun (on binlerce kilobases) okuma gerçek zamanlı polimeraz Kinetik güvenerek olmadan yapay içinde oluşturabileceğiniz veya amplifikasyon DNA örneği. Bu nedenle, nanopore uzun-(NLR-seq) tutan büyük söz özellikle düşük karmaşıklık veya tekrar-zengin Ultra uzun okuma uzunlukları büyük ölçüde genomik ve Biyomedikal analizleri14ilerlemek, 100 kb ötesinde oluşturmak için sıralama okuma genleri15bölgelerinde.

Özelliği nanopore sıralama, uzun oluşturmak için potansiyel bir teorik uzunluğu sınırlama olmaksızın okuyan yöntemdir. Bu nedenle, okuma uzunluğu DNA bütünlüğü ve sıralamanın şablon kalitesi ile doğrudan etkilenen DNA fiziksel uzunluğu bağlıdır. Ayrıca, manipülasyon ve adımları dahil, pipetting kuvvetler ve çıkarma koşulları gibi ölçüde bağlı olarak, DNA'ın kalite son derece değişkendir. Bu nedenle, bir uzun okuma sadece standart DNA ekstraksiyon protokolleri ve üretici sağlanan Kütüphane inşaat yöntemleri uygulayarak verim meydan okuyor. Bu amaçla doğru sağlam geliştirdiğimiz yöntemi olağanüstü uzun oluşturmak için hasat hücre çökeltilerini başlayarak sıralama veri (kilobases yüzlerce) okuyun. DNA ekstraksiyon ve Kütüphane hazırlama yordamları birden fazla iyileştirmeler evlat edindik. Biz DNA bozulması ve hasar neden gereksiz yordamlar dışlamak için protokol aerodinamik. Bu iletişim kuralı yüksek molekül ağırlığı (HMW) oluşan DNA ekstraksiyon, olağanüstü uzun DNA Kütüphane inşaat ve sıralama nanopore platformu üzerinde. İyi eğitimli bir moleküler biyolog, genellikle HMW DNA ekstraksiyon, 90 dakika veya kütüphane inşaat yamultma yöntemine bağlı olarak ve bir daha da 48 h DNA sıralama için en fazla 8 h tamamlanması için hasat hücreden 6 h alır. Protokolü'nün kullanılmasına genom karmaşıklık anlayışımızı geliştirmek ve insan hastalıkları genom varyasyon yeni bir anlayış kazanmak genomik topluluk güçlendirmek.

Protokol

Not: NLR seq Protokolü üç ardışık adımlardan oluşur: 1) çıkarımı yüksek moleküler ağırlık (HMW) genomik DNA; 2) istenilen boyutlarda HMW DNA'ya parçalanma ve ligasyonu sıralaması bağdaştırıcısı için DNA içeren olağanüstü uzun DNA Kütüphane inşaat sona erer; ve 3) bağdaştırıcısı bakmaksızın DNA nanopores (şekil 1) dizileri üzerine yükleme.

1. HMW DNA ekstraksiyon

  1. Reaktif Kur. 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) arabellek (1000 mL) x 100 mL PBS ekleyerek yapmak (10 x) 900 ml su ve karışımı iyi. Lizis arabellek (50 mL) 50 mL tüp 43,5 mL su ekleyerek getirin. 500 μL Tris (1 M, pH 8.0), 1 mL Sodyum Klorür (NaCl) (5 M), ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (0, 5 M, pH 8.0) 2.5 mL ekleyin ve 2.5 mL Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) (%10, wt/vol) tüp ve iyice karıştırın.
    Not: Bu PBS arabellek 4 ° C'de 6 aya kadar muhafaza edilebilir. Hazır lizis arabellek RT 2 aya kadar saklanabilir.
  2. Hücre ölüm kontrol edin ve hücreleri saymak. > %85 canlı orandır ve 30 x 106toplam telefon numarası olduğundan emin olun.
    Not: Bu protokol için kullanılan hücre HG00733 hücre satırı, Porto Riko kökenli 1000 genom konsorsiyum içinde yapısal değişim analizi için yaygın olarak kullanılan bir insan lymphoblastoid hücre satırı vardır (bkz. tablo sipariş bilgileri için malzemelerin) ait olduğu Uluslararası genom örnek kaynak için.
  3. 200 x g RT. atma orta, 5 min için de centrifuging tarafından hücreleri toplamak ve hücre Pelet (30 x 106 hücreler) ile 5 mL 1 x PBS arabellek de resuspend. 200 x g RT, 5 min için de yine santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    Not: 25-35 x 106 hücre bu yaklaşım için kabul edilebilir. Daha fazla varyasyon kullanılan hücre miktarı daha fazla en iyi duruma getirme gerekir. Hücre Pelet −80 ° C 6 aya kadar muhafaza edilebilir.
  4. Hücre Pelet 1 x PBS arabellek 200 μL içinde resuspend. Donmuş hücre Pelet kullanıyorsanız, 5 mL 1 x PBS arabellek ile yıkayın. Belgili tanımlık eriyik vasıl 200 x g RT, 5 min için santrifüj kapasitesi, süpernatant atın ve 1 PBS arabellek x 200 μL hücrelerde resuspend.
  5. 10 mL 50 mL tüp arabellekte lizis hazırlayın. 200 μL hücre süspansiyon lizis tampon ve girdap en yüksek hızda 3 s. Incubate için 1 h 37 ° C'de çözüm için ekleyin.
  6. 2 μL (100 mg/mL) RNase A, lysate için ekleyin. Örnek karıştırmak için 50 mL tüp Yavaşça döndürün. Çözüm için 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  7. 50 μL İndinavir K (20 mg/mL) lysate için ekleyin. Örnek karıştırmak için 50 mL tüp Yavaşça döndürün. 50 ° c 2 h için çözüm kuluçkaya. Kuluçka sırasında her 30 dakikada örnek karışımı yavaşça.
  8. 50 ° C'den 50 mL tüp kaldırmak ve RT 5 min için bekletin.
  9. Fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1, vol/vol/vol) fenol tabakası 10 mL lysate için ekleyin ve bir rotator Mikser tüp döndürmek ( Tablo malzemelerigörmek) RT bir duman başlıklı 10 dakika süreyle 20 RPM, tüp kap kaçağı önlemek için parafilm ile şal döndürme sırasında.
  10. İki 50 mL jel tüpler ( Tablo malzemelerigörmek) 1.500 x g RT. 2 min için de centrifuging hazırlamak
    Not: Jel nükleik asit içeren sulu faz ve organik çözücü arasında istikrarlı bir bariyer oluşturur.
  11. Örnek/fenol çözüm hazırlanan 50 mL birine jel tüpler kimden adım 1,10 dökün. 3000 x g 10 dk RT. az için de çözüm santrifüj kapasitesi
  12. Süpernatant yeni 50 mL tüp içine dökün. Fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1, vol/vol/vol) fenol tabakası 10 mL ekleyin ve bir rotator Mikser RT, bir duman başlıklı 20 devirde 10 dk metroyla döndürün.
  13. İkinci bir kez ile hazırlanan adım 1.11 jel boru tekrarlayın.
  14. Süpernatant yeni 50 mL tüp içine dökün. Buz gibi % 100 etanol 25 mL ekleyin ve DNA (Şekil 2) precipitates kadar yavaşça tüp el ile çevirin.
    Not: Yağış yaklaşım HMW DNA istikrara yardımcı olur.
  15. Bir kanca yapmak için 20 μL bahşiş viraj. Dikkatle HMW DNA kanca ile çıkar ve sıvı damla salmak.
  16. HMW DNA 40 mL % 70 etanol içeren bir 50 mL tüp içine yerleştirin. DNA yavaşça tüp 3 kez ters çevirme ile yıkayın.
  17. %1,15 70 etanol tüp sizden DNA toplamak için bir kez yineleyin.
  18. HMW DNA 1,8 mL % 70 etanol içeren bir 2 mL tüp içine yerleştirin.
  19. 10.000 x g 3 için de yıkanmış HMW DNA santrifüj kapasitesi RT. Kaldır artık etanol pipetting tarafından mümkün olduğunca daha fazla s.
    Not: DNA Pelet kalan etanol pipetting zaman rahatsız etmeyin.
  20. Örnek kuruması için açık kapaklı 10 dk 37 ° C'de 2 mL tüp kuluçkaya.
    1. Sürekli ile 2.1 (mekanik kesme ve 1 D ligasyonu sıralama Kit ile) çıkarsan, 2 mL tüp TE (10 mM Tris ve 1 mM EDTA, pH 8.0) 1 mL ekleyin.
    2. 10 mm Tris (pH 8.0) ile %0,02 200 μL (transposase tabanlı parçalanma ve hızlı sıralama seti ile), adım 2.2 ile devam eklerseniz Triton X-100.
      Not: DNA Pelet rahatsız etmeyin. Karanlıkta 4 ° C'de 48 h için stand tüp izin tam resuspend örnek yardımcı olacaktır. HMW DNA 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir. Daha uzun saklama süresi veya diğer saklama koşulları daha fazla kısa parçaları ile tanıştırayım.

2. olağanüstü uzun DNA Kütüphane İnşaat

Not: Nanopore sıralama kitleri ile birleştiğinde iki farklı kesme yöntemlerine bağlı Ultra uzun DNA kitaplıkları oluşturmak için iki yol vardır. Mekanik bir yamultma tabanlı kitaplık Kütüphane yapımı için 8 h hakkında alarak bir N50 50-70 KB, verilerle üretir. Transposase parçalanma tabanlı kitaplık Kütüphane yapımı için sadece 90 dakika alarak bir N50 90-100 kb veri üretir. Mekanik yamultma iletişim kuralı sıralaması bağdaştırıcısı ve kalite nanopore akışı hücre aynı sürümlerini kullanarak giriş aynı DNA'dan daha yüksek verim sağlar.

  1. Mekanik yamultma tabanlı kitaplık İnşaat
    1. Tezcan ve tüp ligasyonu üzerinden reaktifleri ( Tablo malzemelerigörmek) kit karışımı. Tezcan FFPE DNA onarım arabellek ve son onarım/dA-takip arabellek buz, sonra girdap ve mix aşağı spin. Bağdaştırıcı mix (AMX) ve buz, sonra pipet ve spin bağdaştırıcısı boncuk bağlama arabellek (ABB) karıştırmak için aşağı çözülme. Tezcan aşağı çalışan yakıt karışımını (RBF) ile tampon ve RT, sonra girdap ve spin, elüsyon tampon (ELB) karıştırmak için. RT ve pipet kullanmadan önce karıştırmak için boncuk (LLB) yükleme kitaplığı çözülme.
      1. Bir kez çözdürülen, tüm kit bileşenleri buz üzerinde tutun. Yalnızca gerektiğinde enzimler al. Manyetik boncuklar RT için kullanılmak üzere getir.
        Not: kullanmak manyetik boncuklar için öneriler malzemelerin tabloya bakın.
    2. Adım 1.21.1 HMW DNA'dan miktarı ve kalitesini kontrol edin. Pipet P200 geniş kullanarak HMW DNA tüp içinde üç farklı konumlardan yeni 1,5 mL tüpler içine DNA'ın 20 μL dışarı ipuçları verdi. Bir yer ve okuma bir UV kullanarak kalitesini kullanarak toplama algılamak için üç aliquots üzerinden 1 μL al. Görüntülenen sonuçları onaylamak için birden çok kez kontrol edin.
      Not: Beklenen sonuçları şekil 3Aiçinde gösterilir. OD260/280 değeri yaklaşık 1,9 ve OD260/230 değeri yaklaşık 2.3.
    3. Transfer HMW DNA kalan 940 μL P1000 geniş bir 50 mL tüp kap içine ucu delik.
    4. Tüm DNA 1 mL şırınga iğne olmadan içine Aspire edin.
    5. 27 G iğne şırınga koymak ve tüm DNA kap nazikçe ve yavaşça dışarı atmak (~ 10 s). 27 G iğne şırıngadan çıkarın.
    6. 2.1.4 2.1.5 30 yolcu olmak üzere toplam 29 kez için iğne aygıtlarından.
      Not: Yamultulmuş HMW DNA karanlıkta 4 ° C'de 24 h kalite kontrol (QC) en çok darbe alan Jel Elektroforez tarafından önerilir, ama pahalı ve zaman alıcı depolanabilir. QC bir otomatik darbe alan Jel Elektroforez makinede gerçekleştirme, bir 5-150 kb iletişim kuralını çalıştırmak 20 h için kullanmanız. Beklenen sonuçları şekil 4' te gösterilmiştir.
    7. DNA onarım tepki 0.2 mL tüp içinde yamultulmuş HMW DNA'ın 100 μL ekleyerek hazırlamak (20 μg), FFPE DNA onarım arabelleği 15 μL, 12 μL FFPE DNA onarım mix ve 16 μL nükleaz ücretsiz su. Yavaşça 6 kez flicking tarafından tepki mix ve Kaldır kabarcıklar aşağı spin.
    8. 60 dk. Transfer için 20 ° C'de tepki örnek P200 geniş geçişli bahşiş ile yeni bir 1,5 mL tüp içine kuluçkaya.
    9. Manyetik boncuklar pipetting veya vortexing tarafından resuspend. 143 μL boncuk (1 x) DNA onarım tepki için nazikçe 6 kez tüp flicking tarafından ekleyip karıştırın. Bir rotator Mikser RT, 20 rpm'de 30 dk metroyla döndürün.
    10. Spin aşağı 1.000 x g 2 için de örnek s RT. yerde 10 dakika süreyle manyetik bir raf tüp tüp manyetik raf tutmak ve süpernatant atın.
    11. Tüp manyetik raf tutmak, taze hazırlanmış % 70 etanol 400 μL Pelet bozmadan ekleyin. 30'dan sonra % 70 etanol kaldırmak s.
    12. 2.1.11 bir kez yineleyin.
    13. Spin aşağı 1.000 x g 2 için de örnek s RT. tüp manyetik rafa geri yerde. Herhangi bir kalıntı etanol kaldırmak ve 30 için Kuru hava s. Üzerinde Pelet kuru değil.
    14. Manyetik raf tüpü çıkarması ve 103 μL TE (10 mM Tris ve 1 mM EDTA, pH 8.0) ekleyin. Yavaşça flick boncuk arabellekte kaplıdır ve yavaşça 30 dakika süreyle RT, bir rotator Mikser üzerinde kuluçkaya sağlamak için tüp fiske tüp her 5 dk resuspension Pelet, yardım etmek için.
    15. En az 10 dk. Transfer 100 μL eluate ile geniş bir P200 ipucu 0.2 mL tüp içine delik için manyetik raf üstündeki cips.
    16. Son onarım ve dA-takip tepki bir 0.2 mL tüp 100 μL onarılan HMW DNA'ın, son onarım/dA-takip arabelleği 14 μL ve 7 μL son onarım/dA-takip karışımı ekleyerek hazırlayın. Yavaşça 6 kez flicking tarafından tepki mix ve Kaldır kabarcıklar aşağı spin.
    17. 60 dk 65 ° C 20 dk ardından 20 ° C'de tepki kuluçkaya ve 22 ° C'de basılı tutarak Örnek bir P200 geniş kullanarak yeni bir 1,5 mL tüp içine delik transfer ipucu.
    18. Manyetik boncuklar pipetting veya vortexing tarafından resuspend. 48 μL boncuk ekleyin (0,4 x) son onarım/dA-takip tepki ve karışımı yavaşça tüp 6 kez flicking tarafından. Bir rotator Mikser RT, 20 rpm'de 30 dk metroyla döndürün.
    19. Adımları 2.1.10-2.1.13 bir kez yinelenir.
    20. Manyetik raf tüpü çıkarması ve 33 μL TE (10 mM Tris ve 1 mM EDTA, pH 8.0) ekleyin. Yavaşça flick boncuk arabellekte kaplıdır ve yavaşça 30 dakika süreyle RT, bir rotator Mikser üzerinde kuluçkaya sağlamak için tüp fiske tüp her 5 dk resuspension Pelet, yardım etmek için.
    21. En az 10 dk. 30 Transfer μL eluate ile geniş bir P200 ipucu yeni 1,5 mL tüp içine delik için manyetik raf üstündeki cips. Bir yer kullanarak toplama algılamak için ilave 1-2 μL al.
      Not: Bu adımda 5-6 μg kurtarılması bekleniyor.
    22. Hazırlamak ekleyerek 30 μL tarafından 1.5 mL örnek tüp ligasyonu tepki son tamir HMW DNA'ın, 20 μL bağdaştırıcısı mix (AMX 1D) ve 50 μL blunt/TA ligasyonu ana karıştırın. Tepki hafifçe her ardışık toplama ve Kaldır kabarcıklar aşağı spin arasında 6 kez flicking tarafından karıştırın.
    23. RT, reaksiyon 60 dk için kuluçkaya.
    24. Manyetik boncuklar pipetting veya vortexing tarafından resuspend. 40 μL boncuk ekleyin (0,4 x) tüp ligasyonu tepki ve karışımı yavaşça tüp 6 kez flicking tarafından. Bir rotator Mikser RT, 20 rpm'de 30 dk metroyla döndürün.
    25. 2.1.10 bir kez yineleyin.
    26. Bağdaştırıcı boncuk bağlama (ABB) arabelleği 400 μL tüpün içine ekleyin. Tüp boncuk resuspend için 6 kere hafifçe vur. Tüp boncuk arabellek ayırmak ve süpernatant atmak için geri manyetik rafa yerleştirin.
    27. 2.1.26 bir kez yineleyin.
    28. Spin aşağı 1.000 x g 2 için de örnek s RT. tüp manyetik rafa geri yerde. Herhangi bir kalıntı arabellek kaldırmak ve 30 için Kuru hava s. Üzerinde Pelet kuru değil.
    29. Manyetik raf tüpü çıkarması ve Pelet elüsyon arabellek 43 μL içinde resuspend. Yavaşça flick boncuk arabellekte kaplıdır ve yavaşça 30 dakika süreyle RT, bir rotator Mikser üzerinde kuluçkaya sağlamak için tüp fiske tüp her 5 dk resuspension Pelet, yardım etmek için.
    30. En az 10 dk. 40 Transfer μL eluate ile geniş bir P200 ipucu yeni 1,5 mL tüp içine delik için manyetik raf üstündeki cips. Bir yer kullanarak toplama algılamak için ilave 1-2 μL al.
      Not: Bu adımda 1-2 μg kurtarılması bekleniyor. Mekanik yamultma tabanlı kitaplık yükleme için hazırdır. Kütüphanede buz en fazla 2 saat için sıralama için yükleme kadar gerekirse saklanabilir.
  2. Transposase parçalanma tabanlı kitaplık İnşaat
    1. Tezcan ( Tablo malzemelerigörmek) transposase dan reaktifleri kit. Parçalanma mix (FRA) ve karıştırmak için hızlı bağdaştırıcı (RAP) üzerinde buz ve pipet çözülme. Sıralama arabellek (SQB), boncuk (LB) yük çözülme, (FLB) tamponunu boşaltır ve urgan (FLT) RT, temizleme ve pipet karıştırmak için. RT ve pipet kullanmadan önce karıştırmak için yükleme boncuk (LB) çözülme. Bir kez çözdürülen, tüm kit bileşenleri buz üzerinde tutun. Yalnızca gerektiğinde enzimler al.
    2. Adım 1.21.2 HMW DNA'dan miktarı ve kalitesini kontrol edin. Pipet P200 geniş kullanarak HMW DNA tüp içinde üç farklı konumlardan yeni 1,5 mL tüpler içine DNA'ın 20 μL dışarı ipuçları verdi. Bir yer ve okuma bir UV kullanarak kalitesini kullanarak toplama algılamak için üç aliquots üzerinden 1 μL al. Görüntülenen sonuçları onaylamak için birden çok kez kontrol edin.
      Not: Beklenen sonuçları şekil 3B' gösterilir. OD260/280 değeri yaklaşık 1,9 ve OD260/230 değeri yaklaşık 2.3.
    3. DNA tagmentation reaksiyon 0.2 mL tüp içinde 22 μL HMW DNA, 10 mm Tris (pH 8.0) ile %0,02 Triton X-100 ve 1 μL parçalanma (FRA) mix 1 μL ekleyerek hazırlayın. P200 geniş ile pipetting tarafından Mix ipucu mümkün olduğunca yavaş kabarcıklar tanıtmak değil dikkat çekici 6 kez, delik.
    4. 30 ° c için 1 dk 1 dk 80 ° C ardından tepki kuluçkaya ve 4 ° C'de basılı tutarak Transfer karışımı bir P200 geniş ile yeni bir 1,5 mL tüp içine çap ipucu ve hemen sonraki adım git.
    5. Hızlı bağdaştırıcısının (RAP) 1 μL 1,5 mL örnek tüp için ekleyin. P200 geniş ile pipetting tarafından Mix ipucu mümkün olduğunca yavaş kabarcıklar tanıtmak değil dikkat çekici 6 kez, delik.
    6. RT, reaksiyon 60 dk için kuluçkaya.
      Not: Transposase parçalanma tabanlı kitaplık yükleme için hazırdır. Kütüphanede buz en fazla 2 saat için sıralama için yükleme kadar gerekirse saklanabilir.

3. üstünde belgili tanımlık nanopore aygıt sıralama

  1. Nanopore sıralama aygıtı denetleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Hem yazılım ve donanım çalışıyoruz ve yeterli depolama alanı olduğundan emin olun.
  2. Akış hücre kontrol. Yeni bir akım hücre açın ve akış hücre nanopore cihazın içine yerleştirin. Kontrol kutusunu akışı hücre konumunun (X1-X5) eklenmiş. Doğru akım hücre tipi seçin. Akış hücreleri kontrol iş akışı üzerinde'yi tıklatın. Akış hücre QC analizi başlatmak için Testi Başlat düğmesini tıklatın.
    Not: bildirilen toplam etkin gözenek sayısı 800'den daha az ise, yeni ve farklı bir akış hücre sıralama için kullanın.
  3. Astar arabellek hazırlayın. Bir mekanik yamultma tabanlı kitaplık için çalışan yakıt karışımını (RBF) ile tampon ve 624 576 μL eklemek μL nükleaz ücretsiz su 1,5 mL tüp içine. Girdap ve karışımı macun arabellek aşağı spin. Transposase parçalanma tabanlı bir Kütüphane, floş urgan (FLT) 30 μL floş arabellek (FLB) tüp için ekleyin. Girdap ve karışımı macun arabellek aşağı spin.
  4. Akış cepten astar bağlantı noktası kapak astar bağlantı noktası ortaya çıkarmak için saat yönünde hareket.
  5. P1000 pipet için 100 μL ayarla ve ucu astar portuna takın. Geri akışı hücreden herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için arabellek (30'dan az μL) küçük bir hacim çizin. Sarı sıvı az miktarda bahşiş girer bir kez pipetting kes.
  6. P1000 pipet astar portu üzerinden akışı hücre içine astar Mix 800 μL yüklemek için kullanın. Kabarcıklar tanıtımı önlemek için 30 μL astar bağlantı noktasının ilk olarak, kapak sonra ucu astar portuna takın ve üst gerisi astar karışımı yavaş yavaş ekleyin için astar karışımı ekleyin. Yaklaşık 50 μL sol ucu almak. Astar karışımı macun bağlantı noktası üstünde kalan ekleyin. Sıvı içinde tek başına gidecek.
  7. 5 min için kuluçkaya için ayarları bırakın. Bu arada, Kütüphane içeren 1,5 mL tüp Kütüphane karışımda hazırlayın.
    Not: mekanik yamultma tabanlı kitaplık için arabellek DNA Kütüphane 40 µL için yakıt karışımını (RBF) ile çalışan 35 µL ekleyin. 34 µL sıralama arabelleği (SQB) ve 16 transposase parçalanma tabanlı kitaplık için eklemek µL nükleaz ücretsiz su 25 µL DNA Kütüphanesi için.
  8. Yavaşça örnek bağlantı noktası ortaya çıkarmak için akış hücre örneği bağlantı noktası kapağını açın. P1000 pipet astar bağlantı noktası üzerinden astar karışımı 200 μL 3.5 adımda anlatıldığı gibi akışı hücreye eklemek için kullanın. Astar mix örnek bağlantı noktası üzerinden akışı hücresine yüklü değil emin olun.
  9. P200 pipet 80 μL için ayarlayın. Kütüphane geniş geçişli ucu ile karışımı yavaşça yukarı ve aşağı hemen önce yükleme 6 kez pipetting.
  10. Kütüphane mix dropwise örnek bağlantı noktası üzerinden akışı hücre yükleyin. Sadece önceki açılan bağlantı noktasına tamamen yüklendiğinde her damla ekleyin.
  11. Örnek bağlantı noktası kapak yavaşça koy ve örnek bağlantı noktası tam olarak ele emin olun. Astar bağlantı noktası kapak astar bağlantı noktası karşılamak için saat yönünün tersine hareket. Aygıt kapağını kapatın.
  12. Yeni bir deneme iş akışı üzerinde'yi tıklatın. Kitaplık adı yazın, kullanılan yordamlar göre doğru takımı seçin ve ayarları doğru (48 koş, gerçek zamanlı Bankası-arama ON h) olduğundan emin olun.
  13. Başlat Çalıştır'ıtıklatın. 10 dakika sonra akışı hücre kimliği ve çalışma bilgi active nanopore numara (toplam sayısı ve her dört grup numaraları) kaydedin.
  14. Veri analizi. Verileri bir yerel bilgisayarı veya kümeyi nasıl yapılacağını veya çalışma tamamlandıktan sonra herhangi bir zamanda kopyalayın. Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2) başvuru genom dizisi verileri hizalama için kullanın. Ham sıralı veri ve hizalamaları olan sıralama performansı NanoPlot17 tarafından (https://github.com/wdecoster/NanoPlot) özetler.

Sonuçlar

Olağanüstü uzun DNA sıralama Protokolü HMW DNA Kütüphane yapımı için geçerlidir. Bu nedenle, canlı oranı ile iyi kültürlü hücreleri seçmek için önemlidir > adım hasat hücre % 85. DNA ekstraksiyon için kullanılan hücre miktarı kalite ve HMW DNA miktarını etkiler. Hücre lizis de çok fazla hücre ile başlayarak, çalışmaz. HMW DNA yağış nazik döndürme el ile yerine yüksek hızlı Santrifüjü kullanarak gerçekleştirilir çünkü çok az sayıda hücre kullanarak kütüphane yapımı için yeterli DNA oluşturmaz. HMW buz gibi % 100 etanol ekleme ve döndürerek Şekil 2' deki Beyaz pamuk benzeri çökelti olarak gösterilir sonra DNA örneği.

Kütüphane inşaat başlamadan önce giriş DNA kalitesini kontrol etmek önemlidir. Bozulması, hatalı miktar, kirlenme (örneğin, proteinler, RNA'ların, deterjanlar, yüzey aktif ve artık fenol veya etanol) ve düşük moleküler ağırlıklı DNA sonraki yordamlar ve son okuma uzunluğu önemli bir etkiye sahip olabilir. Biz üç farklı yerlerde HMW DNA içeren tüp içinde DNA'yı kullanarak QC çözümlemesini öneririz. UV, sonuçları HMW DNA için okuma dan OD260/OD280 değeri yaklaşık 1,9 ve OD260/OD230 değeri yaklaşık 2.3 (şekil 3AB). Bu oranı değerleri üç testleri için iyi HMW DNA örneği arasında tutarlıdır. Farklı kesme yöntemleri giriş DNA'sı farklı hacimleri gerektirir. HMW DNA konsantrasyon olması gerekir > 200 ng/µL olması gerekir iken mekanik kesme için > 1 µg/µL transposase parçalanma için. Bir yer tarafından algılanan konsantrasyon biraz okuma UV düşüktür. Ancak, aynı HMW DNA örneği toplama varyasyon katsayısı yer ve deneyleri okuma UV ile % 15'den az olması için gereklidir. Mekanik kesme bir şırınga HMW DNA iğne geçer sayısı yamultulmuş DNA boyutunu etkiler ve son okuma uzunluğu break bir iğne ile geçerlidir. Bu iğne HMW DNA çoğunluğu sağlamak için kesme 50 şekil 4' te gösterildiği gibi kb değerinden daha büyük olduğunda boyutu QC gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Mekanik Kesme yönteminde 30 geçer en iyi sıralama sonuçları çıktı ve uzunluğu dikkate alınarak oluşturulur.

Transposase parçalanma tabanlı kitaplık 90-100 kb ise mekanik bir yamultma tabanlı kitaplık N50 50-70 kb'tır. HG00733 hücre satırı kullanarak dört çalışmalarını sonuçları Tablo 1

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

Tartışma

Prensip olarak, nanopore sıralama uzunluğu11,12,13megabase okuma için 100 kb oluşturmak yapabiliyor. Dört önemli faktörler sıralama çalışma ve veri kalitesi performansını etkiler: 1) etkin gözenek numaraları ve etkinliği ile gözenekleri; 2) motor protein, DNA nanopore geçerken hızını kontrol eder; 3) DNA şablonu (uzunluk, saflık, kalite, kitle); 4) giriş örnek kullanışlı DNA'dan belirleyen sıralaması bağdaştırıcısı ligasyonu verimlilik. İlk iki faktör akışı hücre ve üretici tarafından sağlanan sıralama kiti sürümü bağlıdır. Bu iletişim kuralı (HMW DNA ekstraksiyon, Yamultma ve tüp ligasyonu) kritik adımlarda ikinci iki faktörlerdir.

Bu iletişim kuralı uygulama ve sabır gerektirir. HMW DNA kalitesini olağanüstü uzun DNA kitaplıkları6için önemlidir. Protokol ile yüksek canlılık toplanan hücre ile başlar (> % 85 uygun hücre tercih), ölü hücreleri bozulmuş DNA'dan sınırlama. Tazminat (örneğin, güçlü rahatsız, sallayarak, girdap, birden çok pipetting, yinelenen dondurma ve çözme) DNA'yı tanıştırabilir miyim sert herhangi bir işlemde kaçınılmalıdır. Protokol tasarımında, DNA ekstraksiyon tüm sürecinde pipetting atlayın. Pipetting mekanik Kütüphane inşaat sırasında kesme ve sıralamanın sonra gerekli olduğunda kullanılacak geniş geçişli ipuçları gerekir. Nanopores odası arabellek12kimyaları duyarlı olduğundan, olmalı az kalıntı kirletici maddeler (örneğin, deterjanlar, yüzey aktif maddeleri, fenol, etanol, proteinler RNA'ların, vb) mümkün olduğunca DNA'sı. Uzunluğu ve verim göz önüne alındığında, fenol ayıklama yöntemi şimdiye kadar test birden çok farklı çıkarma yöntemleri ile karşılaştırıldığında en iyi ve en tekrarlanabilir sonuçlar gösterir.

Uzun okunur diziler üretmek için yetenek bu protokol rağmen hala bazı sınırlamaları kalır. İlk olarak, bu iletişim kuralını nanopore sıralama cihaz yayın sırasında kullanılabilir göre optimize edildi; Böylece, seçici nanopore tabanlı sıralama kimya sınırlıdır ve başka tür uzun okunur sıralama cihazların gerçekleştirildiğinde suboptimal olabilir. İkinci olarak, sonuç son derece başlangıç malzemeden (doku veya hücreleri) çıkarılan DNA kalitesine bağlıdır. Başlangıç DNA zaten bozulmuş veya bozuk okunur uzunluğu tehlikeye girer. Üçüncü olarak, her ne kadar birden fazla QC adım DNA kalite kontrol etmek için iletişim kuralında dahil edilmiştir, son verim ve uzunluğu, okuma akışı hücre tarafından etkilenebilir ve değişken nanopore sıralama platformu bu erken aşamada olabilir etkinlik, gözenek geliştirme.

Açıklanan protokol burada DNA ekstraksiyon için insan süspansiyon hücre satırı örnekleri kullanır. Kesme, HMW DNA oranı transposase ve açıklanan sonuçlar üretmek için ligasyonu zaman iğne geçen zamanlarda en iyi duruma. Protokol dört şekilde genişletilebilir. İlk olarak, kullanıcı-ebilmek başlamak ile kültürlü diğer memeli hücreleri ve hücre, doku, klinik örnekler veya diğer organizmaların farklı miktarda. Lizis kuluçka süresi, tepki birim ve Santrifüjü üzerinde daha fazla optimizasyon gerekli olacaktır. İkinci olarak, olağanüstü uzun okuma sıralama için hedef boyutunu tahmin etmek zordur. Okuma uzunlukları beklenenden daha kısa ise, kullanıcılar geçen zamanlarda mekanik kesme tabanlı yöntemi ayarlamak veya transposase transposase parçalanma tabanlı yöntemi için HMW DNA oranını değiştirin. HMW DNA çok yapışkan olduğundan daha uzun bağlama ve elüsyon zaman temizleme adımları sırasında yararlıdır. Üçüncü olarak, farklı nanopore sıralama cihazlar ile bir miktar ve birim DNA Sekanslama ölçütlerine ayarlayabilirsiniz. Dördüncü olarak, sadece sıralaması bağdaştırıcısı için bakmaksızın DNA sıralı. Tüp ligasyonu verimliliği daha da geliştirmek için bir bağdaştırıcı ve ligaz konsantrasyonları titre deneyebilirsiniz. Değiştirilmiş ligasyonu zaman ve moleküler kalabalık ajanlar PEG18 gibi gelecekte uygulanabilir. CRISPR19,20 ile birlikte olağanüstü uzun DNA sıralama iletişim kuralı hedef zenginleştirme sıralama için etkili bir araç sunabilir.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Yazarlar Y. Zhu el yazması üzerine onun yorum için teşekkür ederiz. Bu yayında bildirilen araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası P30CA034196 altında Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler< / güçlü >
Mutlak etanolSigma-AldrichE7023
Agencourt AMPure XPbeadsBeckmanA63881manyetik boncuklar
BD konvansiyonel iğneleritemizlemek için Becton Dickinson30513627G, mekanik kesme için
BD Luer-Lok şırıngaBecton DickinsonMekanikkesme için
Künt / TA Ligase Master MixNEBM0367S
Kontes Hücre Sayma Odası SlaytlarıHücre sayımı içinInvitrogenC10228
EDTAInvitrogenAM9261pH 8.0, 0.5 M, 500 mL
Akış HücresiOxford Nanopore TeknolojileriFLO-MIN106R9.4.1
HG00773 hücreleriCoriell Buprotokolde kullanılanHG00733
Ligasyon Sıralama Kiti 1DOxford Nanopor TeknolojileriSQK-LSK108nanopor ligasyon kiti
MaXtract Yüksek Yoğunluklu tüplerQiagen129073jel tüpleri
NEBNext FFPE DNA Onarım KarışımıNEBM6630S
NEBNext Ultra II Uç Onarımı/dA-Kuyruk ModülüNEBM7546S
Nükleaz içermeyen suInvitrogenAM9937
Fosfat Tamponlu Salin, PBSGibco70011044 10X, pH 7.4
Fenol: kloroform: IAAInvitrogenAM9730
Proteinaz KQiagen1913120 mg / mL
Qubit dsDNA BR Test KitiDNA kantitasyonu içinInvitrogenQ32850
Hızlı Sıralama KitiOxford Nanopore TechnologiesSQK-RAD004nanopor transpozaz kiti
RNase AQiagen19101100 mg/mL
SDSInvitrogenAM9822%10 (ağırlık/hacim)
Sodyum klorür çözeltisiInvitrogenAM97595.0 M
TE tamponuInvitrogenAM9849pH 8.0
TrisInvitrogenAM9856pH 8.0, 1 M
Triton X-100 çözeltisiSigma-Aldrich93443~% 10
Name< / strong><strong>Company< / strong> Katalog Numarası< / strong>Yorumlar< / strong>
Equipment< / strong>
Bio-Rad C1000 Termal DöngüleyiciBio-Rad1851196EDU
Santrifüj 5810REppendorf22628180
Kontes II FL Otomatik Hücre SayacıHücresayımı içinAMQAF1000
DynaMag-2 MıknatısÖmrü Teknolojileri12321Dmanyetik raf
Eppendorf ThermoMixerEppendorf5382000023inkübasyon için
DondurucuLabRepCoLHP-5-UFMB
GridIONOxford Nanopore TeknolojileriBu protokolde kullanılanGridION X5
HulaMixer Numune KarıştırıcıThermo Fisher Scientific15920Ddöndürücü karıştırıcı
MicroSantrifüjBenchmark ScientificC1012
NanoDrop ND-1000 SpektrofotometreThermo Fisher ScientificUV okuma için ND-1000
Pippin NabızAdaçayı BilimPPI0200darbeli alan jel elektroforez aleti
Qubit 3.0 FlorometreInvitrogenQ33216florometre
BuzdolabıLabRepCoLABHP-5-URBSS
Vortex-Genie 2Bilimsel EndüstrilerSI-A236
Su banyosuVWR89501-464
309628enstitü hücreleri florometre testleri nanopor cihazı

Kaynaklar

  1. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).
  2. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  3. Shendure, J., et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).
  4. Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. Genome structural variation discovery and genotyping. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).
  5. Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease. Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).
  6. Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. Long reads: their purpose and place. Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).
  7. Cretu Stancu, M., et al. Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing. Nature Communications. 8 (1), 1326(2017).
  8. Gong, L., et al. Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads. Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).
  9. Sedlazeck, F. J., et al. Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing. Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).
  10. Jain, M., et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).
  11. Jain, M., et al. Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer. Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).
  12. Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).
  13. Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biology. 17 (1), 239(2016).
  14. Editorial, The long view on sequencing. Nature Biotechnology. 36 (4), 287(2018).
  15. Jain, M., et al. Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome. Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).
  16. Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).
  17. De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data. Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).
  18. Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. Impact of macromolecular crowding on DNA replication. Nature Communications. 4, 1615(2013).
  19. Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping. bioRxiv. , (2017).
  20. Gabrieli, T., et al. Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH). Nucleic Acids Research. , (2018).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Nanog zenek DizilemeY ksek Molek ler A rl kl DNAMekanik Par alamaTranspozaz FragmantasyonuK t phane Haz rlamaAk H cresi Y klemeFenol kloroform EkstraksiyonuPuls Alan Jel ElektroforeziYap sal Varyant Tespiti
Bütün genomik DNA analizi için olağanüstü uzun okunur sıralama
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.