$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Not: Tahmini saat de dahil olmak üzere tüm MEMA işleminin genel bakışı Şekil 1' de gösterilen akış diyagramında özetlenmiştir. Bu protokol 8-kuyu plakaları içinde MEMAs imalatı ayrıntıları. Protokol diğer plakalar veya slaytlar için uyarlanabilir.
1. protein, Seyreltilme ve boyama tamponları hazırlanması
- ECMs, ligler ve sitokinlerin oda sıcaklığına (RT) ve kısaca santrifüjlerin dengelenme şişeleri. Uygun RT arabelleğinin uygun hacmini ürün veri sayfasında belirtildiği şekilde ekleyin. Stok konsantrasyonları için üreticinin tavsiyesini takip edin.
Not: Tablo 1 ve Tablo 2' de hisse senetleri ve nihai konsantrasyonları Ile ligler ve ECMS tam listesi sağlanmıştır. Her iki ligler ve ECMs genellikle standart 2 günlük kültür assays bir biyolojik etkisi ortaya çıkarır üretici tarafından önerilen aralığın en yüksek konsantrasyonda kullanılır. Kontaminasyonu önlemek için laminar akımı altında yavaşça ve biyogüvenlik dolapları proteinleri ele.
- 1 h için RT 'de hafif sallanan şişeleri kulkaylar. Bu onları denature neden olabilir gibi protein Vortex etmeyin.
- Uzun süreli depolama için aliquot proteinleri böylece tüm plakaya sadece tekrarlanan dondurma/çözme döngüleri ile bozulma önlemek için tek kullanımlık. Likofilize proteinlerin-80 °C ' de (aksi belirtilmediği sürece) gerekli olana kadar saklayın. : (İ) protein adı, (ii) hazırlanan Tarih, (iii) lot/toplu iş numarası, (iv) Tedarikçi, (v) katalog numarası, (vi) konsantrasyon, (vii) hacim ve (VIII) preparer gibi gelecekteki referanslar için tüm meta verileri toplamak için özen yapın.
- % 20 (v/v) gliserol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 ve filtre sterilizasyonu içeren seyreltilici tampon hazırlayın. Bu tamponu steril tutun ve RT 'de saklayın.
- % 2 (w/v) BSA, 1 mM MgCl2ve 0,02% Nan3 ' ü fosfat-TAMPONLU tuz (PBS) içeren boyama tamponunu hazırlayın. 4 °C ' de filtreleyin ve saklayın.
2. ECM kaynak plakasının hazırlanması
- ECM proteinleri, yazılı ve buzda çözülecek olan seyreltilmemeli stokları çıkarın. Meta veri izleme için tüm lot numaralarını kaydedin.
- Çözülür proteinleri yavaşça doğru Resuspension sağlamak ve bir santrifüjte aşağı döndürmek için fiske tüpler.
-
ECM baskı karışımları (EPMs) ve randomize 384-Well kaynak plakaları yaratacak bir sıvı taşıma robotu tarafından kullanılacak bir floresan fiducial olun.
Not: 384-Well kaynak plakaları, 8 kuyu plakalarına yazdırılan dizileri oluşturmak için bir dokunma pin dizisi yazıcısı tarafından kullanılacaktır.
- Etiket 1,5 her EPM ve fiducial için mL mikrosantrifüjler tüpleri.
- Her bir EPM 'ye, 125 μL seyreltilme tamponunu birleştirerek (bkz. Adım 1,4) ECM stokunun uygun hacmine göre hazırlayın ve karışımı PBS ile toplam 250 μL hacmine getirin. Her EPM tüpünün son konsantrasyonları 1x ECM protein, 5 mM EDTA,% 10 gliserol ve 100 mM Tris olacaktır.
- Üretici tarafından belirtilen uygun tamponda çözülerek floresan fiducial hazırlayın ve 250 μL 'yi etiketli bir fiducial tüpe aktarın.
3. sıvı Işleyici kullanarak kaynak plakasının oluşturulması
- ECMs konumlarını randomizes ve kullanılan dizi yazıcı pin kafası için optimize edilmiş bir 384-kuyu plaka düzeni tasarlayın. Dizi oryantasyonunda yardımcı olmak için her iyi satır 1, sütun 1 pozisyon yazdırılır böylece fiducial yerleşimi tasarlayın.
Not: Her ECM 'nin toplam 14 − 15 çoğaltır güçlü veri sağlamak için kullanılır. Bağlayıcı tekdüzelik değerlendirmesi için sağlam bir ek veren kollajen veya başka bir ECM ek çoğaltır dahil. Düzen ilgi ECMs sayısına bağlı olarak birden fazla 384-kuyu plakaları kullanmak gerekebilir.
- EPM tüpleri soğutulmuş bir tüp raf ile veya soğuk bir odada bulunan bir sıvı taşıma robotu kullanarak, 4 °C ' de tüpler tutarak, bir sıvı işleyici aktarın.
- Sıvı iþleyicinin yazılımını kullanarak, her EPM 'nin 15 μL 'i ve 384-Well kaynak plaka (lar) içinde önceden belirlenmiş kuyulara fiducial aktarmak için bir program çalıştırın.
- Pipet, baskı işlemi sırasında nem ve kurutmaya karşı koruma artırmak için kullanılmayan kuyuların içine PBS.
Not: 4 x 7 pin kafası için optimize edilmiş ve ı bloğu ve PBS kollajen içeren bir 384-iyi kaynak plaka seti örneği için Şekil 2 bakın.
- Plakayı (s) mühürleyin ve yazdırmaya hazır olana kadar 4 °C ' de tutun.
4. bir dizi baskı robotu kullanarak MEMAs yazdırma
Not: Protokolün aşağıdaki bölümü, MCF7 hücrelerinin büyümesi ve proliferasyonu üzerinde farklı mikroçevre proteinlerinin etkisini araştırmak için MEMA 'nın hazırlanması ve kullanımını özellikle açıklar. Ancak, protokol kolayca farklı ligler, ECMs ve hücre diğer hücre hatları ve ilgi uç noktalarını incelemek için kullanılmak üzere adapte edilebilir.
-
Bir dokunmatik PIN yazıcısı kullanarak, EPMs ve fiducial lekeler 8 kuyu plakaları içine yazdırın. Tekrarlanabilirlik sağlamak için her ECM koşulunun birden çok çoğaltır yazdırın.
Not: diğer plaka formatları veya slaytlar yazdırmak için kullanılabilir, ancak optimum spot oluşumu elde etmek için tampon optimizasyonu gerekebilir.
- 4 x 7 baskı kafası konfigürasyonda düzenlenmiş 350 μm çap pimleri kullanarak MEMA için ECMs 'i yazdırın. 8-Well plakalardaki dizileri, toplam ~ 700 Spotlar için 35 satır olarak 20 sütun olarak yazdırın. Bu plaklarda daha büyük diziler mümkündür ancak hem hücre bağlaması hem de boyama sırasında artan kenar efektlerinin takas edilmesi ile birlikte gelir.
- Yazdırdıktan sonra, kullanım öncesinde en az 3 gün boyunca bir kurutucu içinde depo plakaları.
5. ligand tedavi plakalarının oluşturulması
- İlgi liglerini de içeren bir 96-Well plaka düzeni Tasarla. Aynı anda birçok MEMA plakasının tedavisinde kolaylaştırmak için, 8-Well MEMAs ve 96-Well plaka kuyuları arasında sıvı aktarmak için 4 aralıklı ipuçları ile çok kanallı pipet kullanımı için izin aralığı ile bu plaka tasarımı.
Not: Bu protokolde, Tablo 2 ' de listelenen ligin tam kümesi kullanılır.
- Buz üzerinde ligin çözülmesi. Kısaca Flick ve her tüp aşağı spin.
- Üreticinin önerilen arabelleğini (genellikle PBS) kullanarak 200x çalışma stokunda seyreltmeli ligeler.
- Her 200x ligand stoktaki pipet 10 μL, 96-kuyu plakasının içinde karşılık gelen kuyu içine girer.
- -20 °C ' de mühür ve saklama plakaları.
Not: Akış Analizi için tüm meta verileri yakalama, gruplar halinde ligand tedavi plakaları olun.
6. MEMAs üzerindeki hücreler kültür
- Çift distile su (ddH2O) içinde 1% kirlenme engelleme maddesi (malzeme tablosu) içeren, kirlenme yapmayan engelleme tamponunun başına 2 ml Ile 20 dakika boyunca Memas engelleyin.
- Aspirate engelleme tampon ve üçlü durulama kuyuları PBS ile. Kurutma önlemek için, hücre kaplama için hazır olana kadar kuyularda PBS son hacmi bırakın.
Not: MEMAs üzerinde hücre kültürü adımları için iki tezgah çalışanı olması son derece yararlıdır. Bir tezgah çalışanı aspirasyon adımlarını gerçekleştirebilir, ikincisi ise ek adımlar gerçekleştirir. 1 mL çok kanallı pipet ile pipetleme için 8-kuyu plakasını ve iki Pasteur pipeti ile Y-Splitter ile aynı anda birden fazla kuyu aspirine uyacak şekilde aralıklı ipuçları kullanmak önerilir.
- Tohum 2 x 105 MCF7 hücrelerde her Iyi 2 ml Dulbecco 'Nun modifiye kartal Orta (dmem) orta içeren 10% fetal sığır serumu (FBS).
Not: Tam MEMA deneyinden önce, MEMA noktalarının yüksek hücre numaralarıyla (ancak confluent olmayan) istenen deneysel sürenin sonunda hücre numaralarını en iyi duruma getirmek için bir hücre titrasyon deneyi gerçekleştirin.
- 2 − 18 h yapışma, aspirat orta ve 2 mL azaltılmış büyüme orta (DMEM ile 0,1% FBS) ile değiştirin.
Not: Azaltılmış serum (örn.% 0,1 FBS) veya büyüme faktörü-tükenmiş koşullar Şu anda belirli liglerin uyarıcı etkisini izole etmek için kullanılabilir.
- Buz üzerinde bir ligand tedavi plakasını çözün. Santrifüjlü çözünen plaka 200 x g 'de 1 dk.
- Transfer 200 μL, kültür plakasının her bir kuyunda, tedavi plakasında uygun bir şekilde orta olan. Pipet yukarı ve aşağı orta ile ligand hacmi karıştırın ve MEMA plaka uygun iyi geri bu karışımı aktarmak için.
- Elle hafifçe kaya ve MEMA plakaları inküyaya dönün. 37 °C ve 5% CO2' de ligand/ECM kombinasyonunun varlığını deneme süresi için kültür.
Not: Tipik bir MEMA deneyi 72 h için çalışır; uzun süreli deneyler orta ve yeniden tedavi ligand ile değiştirilmesi gerekebilir.
- 71 h 'de nabız MEMA kuyuları 10 μM son konsantrasyon için 100x 5-etynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ile. EdU ile deneysel koşullarda, 37 °C ' de 1 h ve% 5 CO2' de inkük edilir.
Not: Diğer canlı hücre uygulamaları da şu anda kullanılabilir.
7. sabitleme ve boyama MEMAs
- Sonra 72 h ve herhangi bir canlı hücre tedavileri, Aspire kuyuları. Min 'de 15 dakika boyunca 2% civarında formaldehite (PFA) başına 2 ml 'de Memas 'ı düzeltin.
- Aspirate PFA. 15 dk için 0,1% noniyonik yüzey başına 2 mL ile geçirgen.
- Noniyonik yüzey kaynağı aspirate ve PBS iyi başına 2 mL ile yıkayın. Aspirate PBS. 0,05% polisorbat 20 (PBS-T) ile 2 ml PBS ile yıkayın.
Not: MEMA yüzeyi hidrofobiktir ve leke ve antikor inkübasyon öncesinde PBS-T ile yıkanmaması, kuluçk basamakları sırasında kuyularda boşlukların oluşması ve boyama yapılarına yol açacaktır.
- Aspirate PBS-T. EdU algılama reaksiyon reaktifleri ekleyin. RT 'de 1 saat boyunca kulbirer yapın, sallanan ve ışıkta korunur. 1 h inkübasyon sonra, sağlanan ticari gidermek tampon ile reaksiyonu azaltma.
Not: EdU algılama ve boyama/antikor basamakları maliyeti azaltmak için iyi başına 1,5 mL 'de gerçekleştirilebilir.
- Su giderici tamponu aspirate ve lekeleri veya antikorlar ile inküp önce PBS-T ile yıkayın.
- MEMA kuyularını% 2 (w/v) Sığır serum albümin (BSA), 1 mM MgCl2 ve 0,02% Nan3 gece 4 °c ' de içeren boyama tamponunda histon H3K9me3 (1:1000) ve fibrillarin (1:400) karşı antikorlar ile kulbin.
Not: Tam MEMA kümesinde kullanmadan önce optimum konsantrasyonları belirlemek için antikor titrasyonları gerçekleştirin.
- Primer antikor veya leke İnkübasyon sonrasında, 2x PBS ile ve bir kez PBS-T ile yıkayın kuyuları.
- İkincil antikorlar ekleyin (eşek Anti-fare IgG ve eşek Anti-tavşan IgG, hem 1:300) ve 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI). Karanlıkta RT 'de 1 saat boyunca inküye yapın.
- 2 mL 'Lik PBS 'ye kadar, iki adet x, 2 ml ile yıkayın.
- Işıktan korunan 4 °C ' de PBS 'de daha sonra görüntüleme için görüntülenmiş MEMAs 'a devam edin.
8. MEMAs 'ın görüntülenmesi
- Uygun floresan algılama kanalları ile otomatik görüntüleme sistemi üzerinde görüntü MEMA.
- Bir görüntü yönetim sistemine elde edilen görüntü verilerini çıktı. Hücreleri segment ve Cell Profiler8kullanarak yoğunluk düzeylerini hesaplayın.
9. veri analizi
Not: Veri Analizi normalleştirme, varyasyon düzeltme ve ham CellProfiler türetilmiş veri özetleme oluşur. Bu örnekte, özel kod ile R-ortamı tüm adımları gerçekleştirmek için kullanılır. Ancak, herhangi bir istatistiksel ortam veya yazılım programı eşdeğer eylemleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Çözümleme için R ortamı için açık kaynak özel kod örneği kullanılabilir: https://www.SYNAPSE.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
- Bölümlenmiş görüntü verilerini preprocess ve Normalleştir.
- DAPı lekeli çekirdekleri kullanarak spot hücre sayısını belirleyin.
- Hücreleri EdU+olarak etiketlemek için edu yoğunluğu otomatik kapı. Her noktada EdU+ hücre oranını kullanarak proliferasyonu ölçün.
- Sitoplazmik lekeleri ve nükleer morfoloji ölçümlerini spot düzeyde özetlemektedir.
- Veri kalitesini artırmak için veriler üzerinde istenmeyen varyasyon (RUV) normalleştirme kaldırılması gerçekleştirin9.
Not: Bu yaklaşım, her yoğunluğa ve morfoloji sinyaline, daha önce9olarak açıklandığı gibi satırlar ve lekeler kullanarak diziler içeren bir matris olarak bağımsız olarak uygulanır.
- Uzamsal veya yoğunlukla ilgili efektler için düzeltmek için bağımsız değişkenler olarak dizi satırını ve dizi sütununu kullanarak ruv normalleştirilmiş kalıntılar için iki değişkenli Loess normalleştirme uygulayın.
- Normalleştirme tamamlandıktan sonra medyan, raporlama ve daha fazla çözümleme için her mikro ortam koşulu için çoğaltır özetler.