Yöntem makalesi

Genetik Mühendisliği hücreleri Dictyostelium discoideum alan seçimi ve bakteri büyüme

DOI:

10.3791/58981

⸱

25 Ocak 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 3Cancer Research UK Beatson Institute Glasgow, 4MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 5Department of Cell and Developmental Biology, University College London

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dictyostelium discoideum hücre göç, endositoz ve geliştirme gibi karmaşık hücresel süreçler çalışmaya bir popüler bir model organizmadır. Belgili tanımlık yarar organizmanın genetik manipülasyon fizibilite üzerinde bağlıdır. Burada, sıvı ortam kodlamayla hücrelerde varolan sınırlamalar üstesinden Dictyostelium discoideum hücre transfect yöntemleri mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dictyostelium discoideum hücre farklılaşması işlemlerin incelenmesi için ilgi çekici bir model organizma geliştirme, hücre sinyallemesi ve diğer önemli Hücresel biyoloji soruları sırasında olur. İyi gelişmiş teknolojileri Dictyostelium hücrelerin genetik olarak işlemek kullanılabilir. Transfections farklı seçilebilir işaretleri ve bisiklet, Homolog rekombinasyon ve insertional mutagenesis de dahil olmak üzere yeniden işaretleyici kullanarak gerçekleştirilebilir. Bu iyi açıklamalı Genom tarafından desteklenir. Ancak, bu yaklaşımlar sıvı kültürlerde büyüyen axenic hücre hatları için optimize edilmiş ve sadece bakteri yem axenic yaban tipi hücrelere uygulamak zordur. Axenic suşların mevcut mutasyonlar sinyal, aşırı macropinocytosis beslenmesi için gerekli yol açan Ras rahatsız eder ve sinyal iletimi ve bu suşlar deneylerde kemotaksisi yorumlanması zihnimi karıştıran hücre geçiş etkileyebilir. Genetik olarak axenic olmayan hücreleri değiştirmek için önceki girişimleri verimliliği ve gerekli karmaşık deneysel prosedürler yoktu. Biz, ilk kez, bu sınırlamalar üstesinden basit transfection protokol geliştirdik. Dictyostelium moleküler genetik büyük gelişmeler bu dizi vahşi-türü olarak standart laboratuar suşları olarak kolayca manipüle edilebilir hücrelere izin. Avantajları bozulmamış sinyal ve motilite süreçleri çalışmak için ek olarak, macropinocytosis dayalı büyüme bozabilir mutantlar şimdi kolayca ayrılmış olabilir. Ayrıca, tüm transfection iş akışı büyük ölçüde, hafta yerine gün içinde oluşturulan rekombinant hücrelerle hızlandırılır. Moleküler genetik daha fazla taze izole vahşi tipli Dictyostelium örnekleri çevre ile yapılabilir başka bir avantajdır. Bu bu araştırma alanlarında kullanılan yaklaşımlar kapsamını genişletmek için yardımcı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dictyostelium cins çoğunlukla bakteri yem toprak-yaşayan sosyal amip vardır. Şube Kökbacaklılar konuyor, çok sayıda tür-si olmak be izole dört farklı clades1gruplandırılabilir. Türler Dictyostelium discoideum (D. discoideum) hücre göç ve fagositoz gibi karmaşık hücresel süreçler eğitim için popüler bir model organizma haline gelmiştir. Kontrol ve deneysel koşullar, karmaşık veya tanımlanmış sıvı ortamda bakteri2yokluğunda büyümek mümkün axenic hücre hatları geliştirilmiştir standartlaştırmak için. Ax2, Ax3, belirli önemlidir ve tüm 1970'lerde üretilen ve sonuçta elde edilen tek bir vahşi Ax4 suşları NC43yalıtır. Genetik mühendisliği için araçlar ilk yayımlanan nakavt 19874,5sonuçlanan bu axenic suşları geliştirilmiştir. İletişim kuralları daha da geliştirilmiş olup axenic koşulları6,7altında kullanım için optimize edilmiş.

Adaptasyon Bu protokollerden vahşi tipi D. discoideum için sıvı suyu büyümek mümkün değildir suşları birkaç laboratuvarları tarafından kurulması denenen. Transfection iletişim kuralları karmaşıktır ve verimlilik, kısmen kapasitesi9seçici reaktifler8,için bir lavabo olarak hareket bakteri nedeniyle eksikliği beri Ancak, bu tam olarak başarılı olamamıştır. Sonuç olarak, temelde tüm Moleküler veriler D. discoideum üzerinde tek bir vahşi tipi izole soyundan gelir. Bu sınırlamayı aşmak ve genetik olarak D. discoideum hücreler sıvı ortamda büyümeye yeteneklerini bağımsız değiştirmek için bir yöntem geliştirmek istedim. Böyle bir yöntem ihtiyacını axenic büyüme sağlayan mutasyonlar esas olarak tarafsız geçmişte kabul edildi ve hücre fizyolojisi zarar değil gözlem tarafından açıklanabilir. Bu varsayım sadece kısmen doğru olduğunu. Genel olarak, iki önemli fark vardır; İlk olarak, arasında farklı axenic suşları ve ikinci ne zaman axenic bu suşların axenic vahşi yalıtır8,9ile karşılaştırılır, izole.

Belki de en önemli faktördür son zamanlarda RasGAP NF1 tanımlanan anahtar axenic gen, baltaB. NF1 bir RasGAP olarak büyük Ras aktivitesi3tutmaya işlevidir. Tüm axenic suşları enzim silinmesi büyük etkin Ras yamalar oluşum olarak kendini gösteren aşırı Ras faaliyet yol açar. Bu genişlemiş Ras düzeltme ekleri PIP3 birikimi plazma zarı neden. Bu tesadüfi görünen yamaları PIP3 ve etkin Ras sonunda kapatan ve macropinosomes10oluşumuna yol açar bir dairesel fırfır oluşumu için bir şablon vardır. Macropinocytic aktivite aşırı bir artış sonucudur. Macropinocytosis, aktin odaklı bir süreçtir. Hücre iskeleti bileşenleri oluşumu için bir yarışma macropinosomes veya pseudopods sonucudur. Hücre davranış üzerindeki etkilerini folat11bitkisel hücrelerin kemotaksis neredeyse tamamen önlenmesi yansıtılır. Ağır genişlemiş PIP3 yamalar çok ısrarcı. Bile aç olan hücrelerde, PIP3 yamalar kalır ve kemotaksisi kamp çalışmaları yorumlama sorunlara neden olabilir pseudopods olarak yanlış anlaşılabilir.

Bazı durumlarda, NF1 mutasyon deneysel olarak yararlıdır. Bu bir transfection yöntemi bacterially yetişkin D. discoideum için geliştirmek için ikinci bir motivasyon için ulaşabilirsiniz hücreleri, macropinocytosis oranı artış axenic hücreleri bu sürecin12 temel yönleri soruşturma için değerli yapan bu yana . Ancak, macropinocytosis, Ras ve PI3-kinaz10gibi gerekli genlerde mutasyon hemen hemen iptal axenic büyüme, bakteri büyüme ile bu hücreleri işlemek gerekli yapma. Bakteri tabanlı transfections değerli kılan bir başka neden Dictyostelids çok cellularity13,14, kin tanıma15,16evrim sorular keşfetmek için artan kullanmaktır, ve esas olarak taze izole vahşi türünün kullanımı üzerinde bağlıdır fedakar hücresel davranış17yalıtır. Tüm araştırma alanlarına axenic sigara ve sıvı suyu büyümek değil vahşi yalıtır genetik manipülasyon için etkili yöntemler tarafından kolaylaştırılabilir söz.

Protokolümüze açıklanan sınırlamalar üstesinden gelmek için izin verir. Birlikte, bu sadece artan hız nedeniyle seçim sürecinin daha hızlı da olsa D. discoideum hücreleri tutar yararları tüm Dictyostelium araştırmacılar için yetiştirilen bakteriyel ile genetik manipülasyon gerçekleştirme imkanı ele alındığında Amip (4 h katlama zaman) axenic medya (10 saat iki katına h) büyüme kıyasla bakteri büyümesi.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre ve malzemelerin hazırlanması

  1. SorMC arabellek hazırlık
    1. SorMC (MgCl2 ve CaCl2de dahil olmak üzere Sorensen arabellek) arabellek x 100 100 mL 20.36 g KH2PO4 (15 mM) ve 5,47 g Na2HPO4·7 H2O (2 mM) 100 ml GKD2O su ile çözülerek hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) çözüm karıştırın ve dH2O. ile 100 mL ses getirmek
      Not: Elde edilen arabellek bir pH 6 ve daha fazla ihtiyacı yoktur ayarlama.
    2. 1 GKD2O. Ekle 50 µL MgCl2 ve son 50 µM konsantrasyonları elde etmek için CaCl2 içinde her çözüm çalışma x 1000 mL üretmek. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak çözüm.
      Not: Her zaman MgCl2 ve CaCl2 100 x hisse senedi çözüm tuzları yağış önlemek için 1 x tampon ekleyin.
    3. Alternatif olarak, 50 µM MgCl2 ile desteklenmiş KK2 tampon (KH2PO4 2,2 g ve 1 L arabelleği için K2HPO4 0.7 g) ve (burada KK2MC denir) 50 µM CaCl2 hazırlayın. Bu arabelleği boyunca yerine SorMC kullanın.
  2. D. discoideum için besin kaynağı olarak bakteri hazırlık
    1. LB-Orta (lysogeny et suyu) 1 L aşılamak ve K. aerogenes bir koloni kullanın. 2 lt şişeye kullanın. Bakteri gecede 37 ° C'de 220 devir / dakikada sallayarak ile büyümeye izin.
      Not: Büyük miktarda bakteri gerekliyse, 2xTY gibi daha zengin medya kullanın (Maya özü tryptone orta) veya SOB (süper en iyi suyu) LB yerine. K. aerogenes bakteri kullanımı güvenlik sınırlamaları nedeniyle izin verilmiyor diye, BL21 E. coli bunun yerine kullanılabilir.
    2. Hücreleri onları aşağı ~ 6.600 x g 20 dk. yıkama bakteri SorMC arabellek 500 mL ile bir kez için adlı iki 500 mL santrifüj tüp içinde iplik tarafından ertesi gün hasat.
    3. Pelet 20 mL SorMC resuspend. OD600 kontrol (optik yoğunluk 600 nm) bir foto ölçüler kullanarak. Yaklaşık 100 OD600 aynı arabellek ile oranında seyreltin.
      Not: Nedenle nispeten yüksek bir hız aşağı bakteriler iplik için gıda bakteri kayıplarını önlemek için gerekli olan K. aerogenes bakteri cips zordur. Elde edilen bakteriyel hisse senedi çözüm için 4 ay 4 ° C'de buzdolabında saklanabilir ve D. discoideumiçin besin kaynağı olarak yararını korumak. Gecede genellikle LB ortamda yetiştirilen K. aerogenes süspansiyon 1 L 20 mL bir doz600 civarında 100 verir.
      Uyarı: Hazırlanan bakteri K. aerogenesMonokültür olduğundan emin olmak için bir başlık altında tüm adımları uygulayın.
  3. H40 Elektroporasyon arabellek hazırlanması
    1. 100 mL tampon çözeltisi hazırlamak, HEPES GKD2O suda 0.952 g geçiyoruz ve bir 1 M hisse senedi çözümden MgCl2 100 µL ekleyin. PH 7 ayarlamak KOH titrasyon için kullanma. 0,22 µm filtre veya basınçlı kap kullanarak arabellek sterilize. Asitsiz HEPES ve sodyum tuzu kullanın.
  4. Üreticinin protokol sonrası ve Malzemeler tabloözetlenen kitleri kullanarak plazmid hazırlık gerçekleştirin. Tablo 1' de özetlenen plazmid kullanın.
    Not: Transfection için kullanılan DNA kalitesi çok önemlidir. D. discoideum transfectants bakteri büyüyen seçim seçim ve ifade kaset sürüş Organizatör için belirli gereksinimleri vardır (konuya bakın).
Plazmid adıdirenç/seçim bakterilerdedirenç/Dictyostelium seçimindeEtiket
extrachromosomal ifade plazmid
pDM1203AmpicilinG418yok
pDM1207AmpicilinG418N-terminal GFP
pDM1208AmpicilinG418N-terminal mCherry
pPI159AmpicilinG418N-terminal mNeon
pPI437AmpicilinG418N-terminal mScarlet
pPI54AmpicilinG418N-terminal mTurquoise2
pDM1209AmpicilinG418C-terminal GFP
pDM1210AmpicilinG418C-terminal mCherry
pPI143AmpicilinG418C-terminal mNeon
pPI459AmpicilinG418C-terminal mScarlet
pPI142AmpicilinG418C-terminal mTurquoise2
Servisi plazmid
pDM344Ampicilinyokyok
pDM1019AmpicilinyokN-terminal GFP
pDM1018AmpicilinyokN-terminal mCherry
pPI152AmpicilinyokN-terminal mNeon
pPI418AmpicilinyokN-terminal mScarlet
pPI150AmpicilinyokN-terminal mTurquoise2
pDM1021AmpicilinyokC-terminal GFP
pDM1020AmpicilinyokC-terminal mCherry
pPI153AmpicilinyokC-terminal mNeon
pPI457AmpicilinyokC-terminal mScarlet
pPI151AmpicilinyokC-terminal mTurquoise2
indüklenebilir extrachromosomal ifade plazmid
pDM1038AmpicilinHygromycinyok
pDM1047AmpicilinHygromycinN-terminal GFP
pDM1046AmpicilinHygromycinN-terminal mCherry
pPI450AmpicilinHygromycinN-terminal mNeon
pPI452AmpicilinHygromycinN-terminal mScarlet
pPI449AmpicilinHygromycinN-terminal mTurquoise2
pDM1049AmpicilinHygromycinC-terminal GFP
pDM1048AmpicilinHygromycinC-terminal mCherry
pPI470AmpicilinHygromycinC-terminal mNeon
pPI460AmpicilinHygromycinC-terminal mScarlet
pPI469AmpicilinHygromycinC-terminal mTurquoise2
act5 güvenli bir sığınak plazmid hedefleme
pDM1501AmpicilinHygromycinyok
pDM1513AmpicilinHygromycinN-terminal GFP
pDM1514AmpicilinHygromycinN-terminal mCherry
pPI231AmpicilinHygromycinN-terminal mNeon
pPI419AmpicilinHygromycinN-terminal mScarlet
pPI228AmpicilinHygromycinN-terminal mTurquoise2
pDM1515AmpicilinHygromycinC-terminal GFP
pDM1516AmpicilinHygromycinC-terminal mCherry
pPI230AmpicilinHygromycinC-terminal mNeon
pPI458AmpicilinHygromycinC-terminal mScarlet
pPI229AmpicilinHygromycinC-terminal mTurquoise2
REMI ifade plazmid
pDM1220AmpicilinHygromycinyok
pDM1351AmpicilinHygromycinN-terminal GFP
pDM1259AmpicilinHygromycinN-terminal mCherry
pPI465AmpicilinHygromycinN-terminal mNeon
pPI468AmpicilinHygromycinN-terminal mScarlet
pPI466AmpicilinHygromycinN-terminal mTurquoise2
pDM1352AmpicilinHygromycinC-terminal GFP
pDM1305AmpicilinHygromycinC-terminal mCherry
pPI471AmpicilinHygromycinC-terminal mNeon
pPI467AmpicilinHygromycinC-terminal mScarlet
pPI472AmpicilinHygromycinC-terminal mTurquoise2
çerçeve plazmid hedef
pDM1355AmpicilinHygromycinC-terminal GFP
pPI461AmpicilinHygromycinC-terminal mCherry
pPI462AmpicilinHygromycinC-terminal mNeon
pPI464AmpicilinHygromycinC-terminal mScarlet
pPI463AmpicilinHygromycinC-terminal mTurquoise2
Knock-out plazmid
pDM1079AmpicilinBlasticidinyok
pDM1080AmpicilinNourseothricinyok
pDM1081AmpicilinHygromycinyok
pDM1082AmpicilinG418yok
CRE ifade plazmid
pDM1483AmpicilinNourseothricinyok
pDM1489AmpicilinHygromycinyok
pDM1488AmpicilinG418yok

Tablo 1: Plazmid listesi axenic transfections için.

  1. Dictyostelium hücreler transfection için ayarlama
    1. İzdiham SM ortamda (besin açısından zengin Orta) K. aerogenes büyümeye RT. kültürler, bir gecede en fazla 2 hafta 4 ° C'de depolanan
    2. Bu bakteriyel süspansiyon SM agar plaka üzerine, yaklaşık 400 µL ekleyin (pepton 10 g/L; 1 g/L; ayıklamak Maya şekeri 10 g/L; KH2PO4 1.9 g/L; K2HPO4 x 3 H2O, 1.3 g/L; MgSO4 susuz 0,49 g/L; %1,7 agar) ve eşit yayılmış. Bir kısır döngü al ve Dictyostelium hücreleri ile aşılamak. Hücreleri plaka bir kenarında yayıldı.
    3. Plaka 22 ° c transfection için yeterince büyük büyüme bölgeleri sağlamak 2 gün kuluçkaya.
      Not: Büyük büyüme bölgeleri (Örneğin, Ax3, DH1 veya JH10), sağlar, veya deneyimsiz Denemecileri için kullanın Dictyostelium suşları için bunun yerine plakalar temizleniyor. Bunun için adımları 1.5.4 1.5.6 yönergeleri izleyin.
    4. Bir kısır döngü al ve Dictyostelium hücreleri (yaklaşık 2-4 x 105 hücreleri) ile aşılamak. Hücreleri yoğun K. aerogenes 800 µL için aktarım süspansiyon SM. Mix hücrelerdeki tarafından yukarı ve aşağı pipetting.
    5. 400 µL, 200 µL, 100 µL ve 50 µL taze SM agar tabaklarda aktarmak. Ek SM K. aerogenes süspansiyon için her plaka 400 µL eklemek, eşit olarak yayılmış ve kuru.
    6. Plakayı 22 ° C'de tabakları yarı saydam olana kadar yaklaşık 2 gün kuluçkaya.
      Not: Onların daha hızlı büyüme hızı nedeniyle bakteri başlangıçta konfluent çim üretmek ve amip daha sonra bakteri tabak "Temizle". Bu işlem için gereken süreyi zorlanma arka plan ve yetenek mutant hücre bakteri büyümeye bağlı olarak farklı olabilir.

2. transfection bakteriyel seçime göre Dictyostelium hücre

figure-protocol-1
Resim 1 : İş akışı için bakteri yetiştirilen Dictyostelium hücrelerinin transfection. Transfection için adımları aşağıda listelenmiştir. D. discoideum hücrelerin büyümesine (kırmızı) SM tabakta K. aerogenes bakterilerle seçilir. Zaten (koyu yeşil) gelişmekte olan hücreleri kaçınarak hücrelerden yalnızca besleme açık (yeşil), hasat. H40 hücrelerde yıkayın. 2-4 x 107 hücre/mL son yoğunluğu hücrelere resuspend. Hücre süspansiyon ile DNA'ın 1-2 µg karıştırın. Karışımı bir Elektroporasyon küvet ve nabız hücrelere aktarın. Hücreleri doğrudan Elektroporasyon sonra bir tabak SorMC ve bakteri ile aktarın. Hücrelerin seçilebilir işaretçiyi eklemeden önce 5 h için kurtarmak izin verir. Extrachromosomal plazmid için doğrudan yemek için seçime ekleyin. Transfectants ~ 2 gün sonra genellikle görünür değildir. Genom tek entegrasyon amacı Doğrusallaştırılmış yapıları için üç dilutions kadar belirtildiği gibi ayarlayın ve seçime ekleyin. Bakteri aşırı doz600 alınır 100 hisse senedi çözüm =. Tüpler karıştırın ve hücreleri 96-şey düz-alt doku kültürü kalıplara aktarın. Seyreltme başına iki tabak kullanın. Hücre süspansiyon 150 µL her kuyuya pipet. O sıkı kolonileri görünür hale gelene kadar 5 gün sürer. Kırmızı wells başarıyla dönüştürülen hücrelerin (üst paneli önceki yayın22değiştiren) elde edilen her zamanki miktarda bir örnek göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. SorMC arabellek OD600 yoğunluğunun K. aerogenes bakteri içeren 10 mL pilakalar ve K. aerogenes süspansiyon hazırlamak için Ekle = 2 (hazırlanan OD600 200 µL eklemek 100 K. aerogenes hisse senedi çözüm için istenen = bakteri konsantrasyonu) 10 cm doku kültürü petri kabına tedavi.
    Not: Bu plaka daha sonra transfected yetiştirmek için gerekli D. discoideum hücreleri. Alternatif olarak, bir 6-iyi doku kültürü tabak-ebilmek var olmak kullanılmış. Extrachromosomal plazmid transfection söz konusu olduğunda, 6-iyi doku kültürü plaka daha kaynak verimli olur. K. aerogenes SorMC 2 mL kullanın (OD600 = 2) süspansiyon iyi başına.
  2. Dictyostelium hücreleri hazırlanması
    1. 10 µL tek kullanımlık aşılama döngü kullanarak, büyüme bölgeleri (yaklaşık 3 cm) hücrelerden kültür plaka (temizlenmiş alanının kenarına) veya plaka temizleyerek kazı. Hücreler buz gibi H40 arabelleği 1 mL içeren bir 1,5 mL tüp içine aktarın.
      Not: plakaları takas dan hücre hasat zaman çok önemlidir. Çok erken verimleri hücreleri, çok az bir miktar geç artışları hasat hasat kısmen verimli riskini hücreleri geliştirdi.
    2. Hücreleri aşağı 1.000 x g veya flash-iplik 2 için 2 dk iplik tarafından yıkama 10.000 x gs. Süpernatant atın ve 2-4 x 107 hücre/mL son yoğunluğu H40 arabelleğe hücrelerde resuspend. Hücreleri tüm transfection işlem sırasında soğuk tutmak. Bir buz-su Bulamaç tüp ve buz doğrudan temas sağlamak için kullanın.
  3. Elektroporasyon
    1. Hücre 100 µL bir tüp ile DNA'ın 1-2 µg ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından dikkatlice karıştırın.
    2. Hücre/DNA karışımı önceden soğutulmuş Elektroporasyon küvet (2 mm boşluk) aktarın.
    3. Aşağıdaki kare dalga ayarlarını kullanarak hücreleri Nabız: 350 V, 8 ms, 2 bakliyat ve 1 s nabız aralığı.
      Not: DNA'ın 2'den fazla µg eklemeyin. Yüksek miktarlarda hücrelere zehirlidir ve transfection verimliliği azaltır. Eklenen toplam DNA'sı birim 5 µL aşmaması gerekir.
    4. Hücreleri hemen daha önce hazırlanan 10 cm K. aerogenes SorMC ile Petri kabına aktarın ve hücreleri 5 h için yeniden elde etmek için izin verir.
      Not: Petri kabına ters bir mikroskop altında hücreleri denetleyin. Hücreleri doğrudan Elektroporasyon sonra yuvarlak görünür, ancak protozlar şekilleri düzgün yüzeye eklemek için yeterli zamana sahip yaklaşık 30 dakika sonra döndürecektir.
  4. Transfectants yelpazesi: bir seçim sürecinde olup olmadığını transfection bir knock-out, çakma veya act5 knock bileşenini oluşturmak veya bir extrachromosomal plazmid bir floresan muhabir protein Hızlı hedefleniyor bağlı olarak, yürütmek Aşağıdaki yöntemleri açıklanmıştır.
    Not: Axenically yetişkin hücreler farklı olarak bacterially yetişkin blasticidin için son derece dirençli hücrelerdir. Seçimi, bu nedenle, her zaman yapılmaktadır G418 veya hygromycin kullanarak (konuya bakın).
    1. Knock-çıkışları, knock-ins ve act5 knock-ins
      1. Petri kabına dikkatle hücrelerden bir pipet yüzeyine gelen art arda sıvı zorlayarak bağlantısını kesin.
      2. Üç dilutions SorMC K. aerogenes süspansiyon ayarlayın (OD600 = 2) ve direnç kullanılan (bkz. Şekil 1) göre seçmeli aracısı ekleme.
      3. Düşük seyreltme: hücre süspansiyon 9 mL SorMC 20.4 mL ve K. aerogenes hisse senedi çözüm 600 µL karıştırın.
      4. Orta seyreltme: 28,5 mL SorMC ve K. aerogenes hisse senedi çözüm 600 µL hücre süspansiyon, 900 µL karıştırın.
      5. Yüksek seyreltme: hücre süspansiyon 90 µL ile 29,3 mL SorMC ve K. aerogenes hisse senedi çözüm 600 µL karıştırın.
      6. Seçilebilir işaretleyici (100 hisse senedi çözüm x) 30 µL ekleyin.
      7. 96-şey düz-alt doku kültürü tabak içine hazırlanan dilutions hücre süspansiyon pipetting 150 µL tarafından her kuyuya dağıtın.
        Not: Bu yordam için ekran tek klonlar tercihan--dan nüfus amaçlamaktadır. Seçime bağlı olarak kullanılır yapısı yaklaşık 5-7 gün sürer.
    2. Extrachromosomal plazmid
      1. 10 mL yemek için seçilebilir marker ekleme (bkz. Şekil 1).
        Not: Bu yana klonal nüfus bir isteğim yok dilutions kadar ayarlamak için gerek yoktur. Extrachromosomal plazmid seçim süreci daha hızlı yüksek kopya numaraları D. discoideum hücrelerde mevcut kaynaklanmaktadır. Transfectants 32 h 2 gün sonra beklenebilir.
        Dikkat: seçilebilir işareti olarak kullanılan antibiyotikler zehirlidir. Eldiven giymek.
  5. Pozitif tranfectants için elde edilen klonlar ekran. Knock-out veya çakma denemeleri için adım 2.5.1 yönergeleri izleyin. Transfection başarı için extrachromosomal plazmid yönergeleri adım 2.5.2 kullanarak kontrol edin.
    1. Knock-çıkışları, knock-ins ve act5 knock-ins için ilk ekran yapı entegrasyon içine doğru genomik locus onaylamak için PCR üzerinden gerçekleştirin.
      Not: Klonal nüfus olasılığını en üst düzeye çıkarmak için seçimden sonra transfectants veren en yüksek seyreltme mümkün kullanın. Amaç en fazla üçte Wells işgal vardır plakaları için.
      1. Klonal nüfus genişletmek için yeterince hücre genomik DNA izolasyonu için büyümeye bir 12-iyi doku kültürü tabak içine 96-iyi doku kültürü plaka seçimden sonra büyüdü klonlar aktarın. Her şey SorMC K. aerogenes 1 mL ile tedarik (OD600 = 2) ve taze seçilebilir marker.
        Not: 1 gün bir birleşmesi de DNA izolasyon için uygun elde etmek için genellikle yeterli olur.
      2. Mini genomik DNA izolasyon gerçekleştirmek için konfluent iyi hücre hasat ve üreticinin yönergeleri izleyin mini bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak genomik DNA izole.
      3. İzole genomik DNA ile birlikte uygun astar ve Taqkullanın-polimeraz ( Tablo malzemelerigörmek) için pozitif integrands PCR ekran.
        Not: Pozitif entegrasyon içine doğru genomik locus onay sonra bir Southern blot analizi yapılmalıdır. Bu ek ekleme olayları belirsiz genomik bölgelerde değil ortaya çıkan daha fazla güven sağlar.
    2. Floresan muhabir proteinler, görsel olarak olumlu floresan hücreleri tanımlamak ve floresan mikroskop ile denetleyin. Alternatif olarak, uygun antikorlar ile Batı bir leke için biyokimyasal kimlik gerçekleştirin.
PCR programı
adımsıcaklıkzaman
İlk denatürasyon94 ° C30 s
30 döngüleri94 ° C15-30 s
42 ° C15-60 s
68 ° C1 dk./kb
Son uzantısı68 ° C5 dk
Basılı tutun4-10 ° C
Reaksiyon kompozisyon
bileşen25 μL tepkiSon konsantrasyonu
10 µM ileri astar0.5 ΜL0.2 ΜM
10 µM ters astar0.5 ΜL0.2 ΜM
Şablon DNAdeğişken (ca. 5 µL)< 1000 ng
2 x standart polimeraz da dahil olmak üzere arabellek ile Master Mix (malzemelerin tabloya bakın)12.5 ΜL1 x
Nükleaz ücretsiz su25 µL< 1000 ng

Tablo 2: amplifikasyon için PCR program ve örnek oluşturmaya D. discoideum genomik DNA'sı.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extrachromosomal plazmidler bir hücre veya mutant hücre hücresel yapısında değişiklikler içinde belirli proteinlerin yerelleştirme tanımlamak için amaç muhabir çalışmaları için kullanılır. Hücre döngüsünün kontrolü gibi pek çok yaklaşım için aynı anda iki gazetecilere ifade etmek önemlidir. Bu şimdi çift muhabir extrachromosomal plazmid sistemimizi (Tablo 1) kullanarak mümkündür. 1 gün, 5 h (Şekil 1) sonra seçilebilir işaret G418 eklemeden önce hücreleri transfected. Örneğin, NC4, DdB, Ax2 ve bağımsız olarak türetilmiş vahşi yalıtır V12M2 ve WS2162 (ek tablo 1) GFP-TubulinA, mikrotübüller ve mCherry-PCNA, olan bir protein için bir işaretleyici için kodlar plazmid pPI289 ile transfected hücre döngüsü (Şekil 2A) izlemek için kullanılır. 32 h sonra hücrelerin mikroskop altında tespit edildi. Her iki floresan etiketli füzyon proteinler, hücre çoğunluğu ifade tutarlı ile önceki raporlar bu ifade aynı plazmid gösterir benzer ifade düzey, iki gazeteci iki farklı plazmid kullanırken neredeyse imkansız olduğu 18,19. Temsil edici bir hücre (NC4, DdB, Ax2, V12M2 ve WS2162) her hücre satırı için istenen çift muhabir ifade Şekil 2' deBgösterilir. Transfection verimlilik Şekil2 Cözetlenir. NC4 türetilmiş hücre hatları en iyi transfection verimliliği göster. Ancak, hücre satır V12M2 ve WS2162, transfectants oldukça yüksek sayıda elde edildi.

figure-results-1
Resim 2 : Extrachromosomal bir plazmid ifadesidir. (A)Extrachromosomal plazmid doğrudan dairesel formda transfected. Örneğin, Çift muhabir pPI289 gösterilir. NgoMIV siteleri ikinci muhabir extrachromosomal ifade plazmid içine ekleme gösterir. (B) Z-projeksiyon temsilcisi bir hücrenin GFP-TubulinA (sitoplazmik) ve mCherry-PCNA (büyük ölçüde nükleer) kullanılan beş farklı vahşi-türü hücre hatları (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162) için ifade. (C) transfection verimliliği (B) resimde beş hücre hatları için hesaplanır. Gösterilen iki deney ortalamasıdır. Hata Çubuklarõn ± SD Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Belirtilen genomik locus hedefleme vektör entegrasyonu daha zordur ve oluşturulan hücre kültürünü daha dikkatli analiz gerektirir. Şekil 3' te, bir act5- mCherry NC4 kı denenir. İlk olarak, plazmid transfection takip rekombinasyon olayları sıklığını artırmak için linearized gerekir. Bunun için sivil toplum örgütüile MIV plazmid pDM1514 kesilir. İki grup üzerinde bir özel jel "denemeler" den çalıştırdıktan sonra elde edilir. 4127 bp grup istenen yapı (Şekil 3) içerir. Transfection, sindirilmiş DNA jel çıkarılan ve üreticinin yönergelerini izleyerek bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saf.

figure-results-2
Şekil 3 : Act5 knock bileşenini ve DNA hazırlanması için transfection. Örnek kullanım bir hareket5 knock-in plazmid pDM1514 gösterilir. Hazırlık adımları aşağıda listelenmiştir. (A)belirtilen NgoMIV sites'ı kullanarak plazmid Elektroporasyon daha önce linearize. (B, C) İki beklenen grup düzgün ayrılır kadar kesilmiş plazmid üzerinde bir özel jel çalıştırın. Rekombinasyon silah, mCherry ve direnç-kaset içeren 4127 bp bant kesme ve jel ayıklamak DNA. DNA şimdi transfection için hazırdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Saf DNA NC4 hücre transfection için kullanıldı. Seçimin 5-6 gün sonra klonlar elde edilmiştir. Temsilcisi transfection verimliliği ve birkaç act5 çakma girişimleri için pozitif saptanan klonlar miktarını Tablo 3' te özetlenmiştir. NC4 transfection iki klon rastgele seçilmiş ve PCR (Şekil 4A) tarafından analiz ve her ikisi de tahmin edilen bant desen bir knock beklenen ve daha fazla Southern blot analizi ile tek bir entegrasyon sağlamak için doğrulanmış gösterdi yapı içine genom20olay. Leke açık tek bir entegrasyon istenen act5 odağı (Şekil 4B) gösterir. Oluşturulan NC4::act5 mCherry hücre kültürünü şimdi deneylerde kullanılabilir.

figure-results-3
Şekil 4 : Act5- mCherry kıs NC4 içinde doğrulanmasını. (A)düzeni ve kontrol PCR act5 odağı içine pozitif entegrasyonlar doğrulama için. Belirtilen astar iki bağımsız klon ve üst analiz etmek için kullanılmıştır. Her iki klonlar ebeveyn zorlanma mevcut olmayan beklenen bantları direnç-kaset ve aşağı akım (P1) veya ters yönde astar (P2), göster. Astar kombinasyonu (P1/P2) act5 odağı doğru entegrasyon mCherry ve direnç kaset onaylar. Her iki KI klonlar bu grup eksikliği ve bunun yerine 1400 baz çifti daha büyük hakkında bir PCR ürünü görüntülemek vahşi tipli NC4 beklenen 2800 bp grubu gösterir. (B) düzeni için kullanılan kısıtlama Özet ve Güney leke. Her iki çakma klonlar daha küçük 3400 bp grup göstermek hangi yapı entegrasyon 5 hareketlocus içine sonucu, özellikle ek Bclı hygromycin direnç kasete site. Vahşi-tipi kumanda gösterir beklenen 5.8 kb iki aşağı akım bulunduğu Bclkaynaklanan ben siteler. Leke kırpılmış ve netlik için spliced. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

act5 odağı içine hedeflenen yapıPlazmid adıişgal altındaki kuyu sayısıchecked klonlar sayısıPozitif klonlarDoğru klonlar (%)Kullanılan Dictyostelium zorlanmatransfection verimlilik (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µg DNA)
LifeAct-mCherrypPI22677114,2AX23.5 x 10 ^ -6
LifeAct-GFPpPI2271212541,6AX26 x 10 ^ -6
GFPpDM151333266,6AX21.5 x 10 ^ -6
mCherrypDM151433133,3AX21.5 x 10 ^ -6
GFPpDM1513669555.5AX23.3 x 10 ^ -5
mCherrypDM1514221121083.3AX21.1 x 10 ^ -4
H2B-mCherrypPI42033133,3AX21.5 x 10 ^ -6
H2B-mCherrypPI42077685.7AX23.5 x 10 ^ -6
mCherrypDM15141010770DdB5 x 10 ^ -6
mCherrypDM1514240121191.6DdB1.2 x 10 ^ -4
mCherrypDM15143201212100NC41.6 x 10 ^ -4

Tablo 3: Transfection verimliliği ve miktarını elde edilen olumlu transfectants nesil için act5 Kıs içinde farklı zorlanma arka planlar 22 .

5 hareketlocus entegre muhabir21nispeten homojen ifade sunmaktadır. Oluşturulan NC4::act5-mCherry hücreleri ile diğer act5 knock-ins GFP gibi farklı bir floresan protein kullanarak gerçekleştirilecek mix deneyler izin. Bu sistemin en büyük avantajı vurgulamak için Ax2::act5-GFP ile karıştırma deneyler gösterilir. Axenic yaban-türü hücre transfect yetersizlik nedeniyle, bu tür bir yaklaşım önce gerçekleştirilemedi. Çünkü onlar aynı deneysel koşullar karşılaşan farklı hücre hatları arasında doğrudan bir karşılaştırma izin Mix deneyler hücre davranış, analiz etmek için önemli bir araç vardır. NC4 hücreleri Ax2 hücreleri (Şekil 5A) daha bakteriyel çimenler üzerinde daha hızlı büyür. Bu bakteri ya da taşımak ve bir besin kaynağı doğru kemotaksisi göstermek için geliştirilmiş yetenek phagocytose için daha yüksek bir kapasite nedeniyle olabilir. Bir eksik agar folat kemotaksisi tahlil kullanarak, doğrudan karşılaştırma NC4::act5-mCherry ve Ax2::act5-GFP nüfusun, NC4::act5-mCherry folat algılama çok daha etkili olduğunu gösteren gerçekleştirildi. 4 h sonra daha fazla NC4::act5-mCherry hücreleri özel Ax2::act5-GFP hücreleri (Şekil 5B) daha altında tarama başardık. Altında özel geçiş hücrelerin kemotaksis standart ölçümleri analiz ortaya NC4::act5-mCherry hücreleri daha hızlı olduğunu ve Ax2::act5-GFP hücreleri (Şekil 5C-E daha güçlü kemotaktik tepki gösterdi ).

figure-results-4
Şekil 5 : 5 hareketkıs kullanarak yansıma tabanlı kemotaksisi mix deneyler için. (A) NC4::act5-mCherry ve Ax2::act5-GFP ifade 5 hareketodağı belirtilen floresan protein için yetenek bir bakteriyel çim büyümeye analiz. 4 gün sonra yalnız kaplama Dictyostelium hücrelerden ortaya çıktığı plak çapı ölçüldü. Sigara axenic act5:: NC4 hücreleri yapmak axenic Ax2::act5-GFP hücreleri daha önemli ölçüde daha büyük plaklar (± SD, demek *** p < 0,0001, n = 3, 5 mm Ölçek). (B) karıştırıldı bakteri-amip her iki suşlarının yetiştirilen özel altında folat kemotaksisi kullanımı tahlil için doğrudan NC4::act5-mCherry ve (A) kullanılan Ax2::act5-GFP kemotaktik yetenekleri karşılaştırmak için22 , bir 50: 50 oranı. Hücreleri altında özel tarama için izin verildi. 4 h sonra folat degrade geçiş hücreleri confocal bir mikroskop kullanarak görüntüsü. NC4::act5-mCherry ve Ax2::act5-GFP hücre sayısı sonra tespit edilmiştir. NC4::act5-mCherry hücreleri folat algılama daha verimli. 10 kat daha fazla NC4::act5-mCherry hakkında Ax2::act5-GFP hücrelere kıyasla hücreleri bulundu (± SD, demek *** p < 0,0001, n = 6, ölçek 100 µm bar). (C, D) Hücreleri için 60 dk çekildi ve onların hızı ve kemotaktik endeksi hesaplanmıştır. Sonra ön seçim en chemotactically duyarlı hücrelerin (yalnızca bu özel altında geçirilen) Ax2::act5-GFP gösterdi daha düşük değerler hücre hız ve kemotaksisi hücreleri. Hücre başına elli hücre analiz edildi. (ortalama ± SD, * p < 0,01, n = 3). (E) NC4::act5-mCherry ve Ax2::act5-GFPact5 knock-ins parça üzerinde 60 dk daha yönlendirilmiş hareketi doğru NC4::act5 mCherry hücre chemoattractent kaynak gösterilen, çizilir (ortalama ± SD, ** * p < 0,0001, n = 6). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Act5 çakma hücre satırları akış sitometresi için de kullanılabilir. Gibi büyüme bakteri ile geliştirme axenic suşları ve axenic wild-türleri arasında büyük farklılıklar vardır. Sonra geliştirme, Olgun cesetleri NC4 hücre yaklaşık iki katı kadar büyük Ax2 hücrelerden türetilmiş. Hücreleri karışık, bir orta boy meyve vücut elde edilir. Her iki hücre hatları katkısını daha kantitatif analiz etmek için akış sitometresi kullanıldı. Bu analizler açıkça orta boy olgun cesetleri farklı düzeylerinden her iki hücre hatları katkı nedeniyle olduğunu gösterdi. Süre ölçülen Sporlar yaklaşık % 75 ' NC4::act5-mCherry hücreleri yapılmış, Ax2::act5-GFP axenic sigara suşları (Şekil 6) için potansiyel bir fitness avantaj ortaya sadece % 25, katkıda bulunmuştur. Analiz sapı hücre nüfus izlemez beri geliştirme Ax2 ve NC4 arasındaki dengesizlik açıklamak için iki olasılık vardır. Ax2 hücreleri esas olarak SAP hücre nüfus yerine spor hücre nüfus girerek katkıda bir ihtimal. Alternatif olarak, daha fazla NC4 hücreleri Ax2 görece gecikmeli gelişim döngüsü girebilirsiniz ve sonuç olarak bir meyve vücut derlemeye katkı edemiyoruz. Axenic wild-türü hücre transfect imkanı daha fazla diğer yaklaşımlar geliştiren ve büyük ölçüde deneysel prosedürler kolaylaştırır.

figure-results-5
Şekil 6: hareket5 kıs izin akış sitometresi kullanarak karışım deneyleri analizini. (A) NC4::act5-mCherry ve Ax2::act5-GFP ayrı ayrı veya 50: 50 karışım besin olmayan agar plakalar üzerinde geliştirilmiştir. NC4::act5-mCherry hücreleri Ax2::act5-GFPdaha büyük Olgun organları oluşturur. Mix, bunun yerine bir ara boyut gösterir (ölçek 5 mm). Confocal floresan ışık mikroskobu NC4::act5-mCherry Sporlar karışımları türetilmiş spore kafaları daha yüksek bir miktar önerir. (Bu gözlem, Sporlar hasat spor kafa karıştırma deneme (a) akış sitometresi tarafından analiz edildi miktarda ölçmek içinB). Sporlar yaklaşık % 75 Ax2::act5-GFP hücrelerden yalnızca % 25 ile NC4::act5-mCherry hücrelerden kökenli. (C) her iki hücre satırları akış sitometresi dağılım gelen sporlar temsilcisi dağılımı. Yaklaşık % 0.05 mCherry ve GFP sinyalleri, parasexual füzyon süreçleri ortaya çıkan veya Sporlar birbirine yapışmasını düşündüren pozitif göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Hücre kültürünüGenetik olarak arka planReferans numarasıDaha önce yayınlananTürü
AX2 (Ka)DBS0235521Bloomfield vd., 2008vahşi türü
NC4 (S)Bloomfield vd., 2008vahşi türü
act5::mCherry klon 5NC4HM1912Paschke vd., 2018act5 kapı açma
act5::Gfp klon 2AX2HM1930Paschke vd., 2018act5 kapı açma
V12M2Bloomfield vd., 2008vahşi türü
WS2162Bloomfield vd., 2008vahşi türü

Ek tablo 1: farklı suşları Dictyostelium okudu.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sigara axenic, vahşi-tipi Dictyostelium hücreleri kullanımı çok sınırlı defa moleküler araştırma olmuştur. Bu suşların genetik mühendisliği için kullanılabilir yöntemleri güvenilirlik ve verimliliği23genel onların evlat edinmek önlenmesi, yoktu. Yaratılan malzeme ve burada sunulan iletişim kuralları için herhangi bir D. discoideum zor onun yeteneğini bağımsız sıvı ortamda büyümeye kullanılabilir. Bu iletişim kuralı NC4 elde edilen hücre hatları için optimize edilmiş olduğu belirtilmelidir. Biz daha önce gözlemledim ve V12M2 ve WS21628,9için aşağıda gösterildiği gibi transfection verimliliği vahşi üzerinden taze izole suşları için NC4 farklı. Elektroporasyon koşulları ve özellikle transfection verimliliği üzerinde önemli bir etkiye sahip görünüyor daha fazla optimizasyon bazı suşları için gereken. Genel olarak, transfectants yeterli miktarda bu yöntemler uygulanabilir olduğunu gösterecek kadar test tüm suşların içinde gözlenen. Olumlu transfectants NC4 elde edilen suşların kullanılarak elde sayısı diğer axenic wild-türü suşları için ama her durumda daha göre transfectants yeterli sayıda daha fazla deneyler için izin vermek için elde edilir. Bu artı bizim iletişim kuralı, sadeliği, önceki girişimleri8,9' a göre önemli gelişme.

Bu yeni axenic iletişim kuralları tüm standart genetik yordamlar kapsar ve transfections hızla ve verimli bir şekilde paralel olarak yapılabilir bu yana daha fazla avantajları ekleyin. Pozitif klonlar büyüme bakteri yarım bölümü saat bu yana hafta yerine gün elde edilebilir. Yeni kurulan plazmid aynı zamanda axenic şartlar altında çalışmayı ve rutin olarak her iki büyüme koşullar altında bu methology22başka bir gelişme olduğu kullanılabilir. Protokol tanıttı gibi bakteri seçimi için kullanılan plazmid transfection başarısı için çok özel gereksinimleri vardır. Özellikle, ifade ve direnç kaset sürüş Rehberleri başarılı transfection için önemlidir. Hücreleri bakteri yetiştirilen direnç veya ifade kaset sürüş için sık kullanılan act6 (aktin 6) Organizatörü24 verimliliği yoksun. Direnç kaset bir coA (a coactosin) Organizatörü, her ikisi de hangi aktif axenic koşullar altında ve vardır kontrol altında iken plazmid sistemimizde tüm ifade kaset, son derece etkin act15 (aktin 15) Organizatörü sürücüler hücreleri bakteri yetiştirilen. Ifade bir muhabir için gereksinimleri yapıları knock-in yanı sıra ve knock-out yapıları bizim plazmid repertuar kullanmak gerekli yapmak, ama ne yazık ki zaten bu verimsiz act6 organizatörü olarak oluşturulan vektörel çizimler kısıtlar.

Organizatörü verimliliği doğru genomik locus bir tek tümleştirme olaya bağlı transfections için özellikle önemlidir. Direnç gen ekspresyonu sürüş Rehberleri bizim iyileşme nedeniyle, yeterli direnç protein tek locus entegrasyonlar üretilmektedir. Genom içine birden çok entegrasyonlar, hygromycin ya da açıklandığı gibi G418 kullanırken lehine büyük bir endişe vardı. Yok birden çok entegrasyonlar lehine şimdiye kadar daha önce G418 seçimlerinde büyük organizatörü sistemleri25kullanarak rapor olarak gözlenmektedir. Bu hem temiz knock-çıkışları ve knock-Ins. üretimi için uygun seçilebilir işaretleri vardır ne yazık ki hygromycin ve G418, seçilebilir marker blasticidin axenic olmayan koşullar altında çalışmıyor demektir. Blasticidin direnç kaset rutin olarak D. discoideumiçinde knock-out yapıları oluşturmak için kullanılan bu yana bu bizim Yöntem, büyük bir dezavantaj olduğunu. Zaten blasticidin direnç kasetleri ile oluşturulan yapıları bir uygulanabilir seçilebilir işaretleri kullanarak rederived gerekir. Yeni kurulan axenic D. discoideum CRISPR birleştirmek için bu sınırlamayı aşmak için başka bir olasılık var teknoloji ile bu transfection Protokolü26. Basit ve hızlı tam knock-out yapıları yeniden inşası uygun, tek rehber RNA'ların (sgRNAs) kuşağıdır. Gelecekteki yönelimler, olasılığını için birden çok knock-çıkışları üreten CRISPR/Cas9 bu transfection kuralıyla birlikte kullanarak itiraz ediyor ve Dictyostelium toplumda pek çok araştırmacı için önünü. Ancak, işlenebilirlik için CRISPR/Cas9 axenic yetişkin hücrelerinde kullanılan kurulan geçici ifade sisteminin dikkatle incelenmelidir.

Sunulan act5 çakma sistemi güvenilir ve güvenli entegrasyon sistemi istikrarlı hücre hatlarında D. discoideum, nesil benzer siteler diğer organizmaların22yılında kurulan avantajı ile sunuyor. Ayrıca genom bir tek tümleştirme etkinliğinde bağlıdır ve farklı araştırma yönleri için birçok seçenek sunuyor. Act5 düzenleyici güçlü etkindir ve neredeyse homojen ifade27 ekimi koşullardan bağımsız garanti eder. Floresan muhabir proteinler mühendislik hedefleme plazmid kullanarak bu sığınak locus kolayca entegre edilebilir. Bu karışımı deneyde aþaðýda gösterildiði gibi hücre izleme açısından yararlı olabilir. Hücreleri izleme otomatik hücreye yardımcı olabilir en az hücre hücre ifade değişkenlik gösterir. Önemlisi, istenen sırayı 5 hareketlocus içine ekleme phenotypically tarafsız28,29görünür. Ifade protein ifade, korumak için seçilebilir bir işaretleyici üzerinde rastgele integrants veya extrachromosomal vektör taşıyan hücre hatları görüldüğü gibi bağlı değildir, act5 sistem kurtarma deneyler için de yararlı olabilir. Hücre hatları homojen olduğundan, tüm hücreleri analiz edilebilir. Bu extrachromosomal bir plazmid olduğu önemli heterojenite ifadede ifade kullanarak mümkün değildir.

Yanı sıra bu genel yönelik tüm suşları için axenic wild-türü hücreleri moleküler araştırma için kullanabilme geçerli laboratuar suşları içinde birikmiş mutasyonların etkileri bir değerlendirmesini sağlar. Birden çok genetik düzenlemeler bulundu beri Ax2 zorlanma kabulü 1970 yılında, daha önce yayımlanmış Mikroarray analizleri26tarafından gösterildiği gibi. Sentetik fenotipleri Bu mutasyonlar varlığı nedeniyle gözlenir. Örneğin, bir rapor phg2 mutant azalmış yapışma bir laboratuvar zorlanma arka plan ve başka bir3yüksek yapışma gösterir. Böyle çakışan veri şimdi (Bu durumda, DdB) ortak atası zorlanma deneyde tekrar ederek çözülebilir. Bu yaklaşım gücünü son zamanlarda küçük GTPazlar Semud'u30,31için göstermiştir.

Yetenek herhangi bir D. discoideum suşu genetik deneyler yapmak vahşi yalıtır, özellikle toplumsal evrimin, kin tanıma ve cinsel döngüsü22ilgili olanlar kullan seçeneğine bağlı yeni araştırma yönleri potansiyelini genişletir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu yöntemi giriş için Kay laboratuarı ve LMB mikroskobu ve akış sitometresi imkanları mükemmel bilimsel ve teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser tıbbi araştırma Konseyi grant MC_U105115237 R. R. Kay, BBSRC (Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi) için hibe BB/K009699/1'e R. R. Kay tarafından finanse edildi, kanser Araştırmaları İngiltere hibe A15672 R. H. olmak, hoş geldiniz güven kıdemli bursu 202867/Z/16/Z Jonathan R Chubb ve UCL MRC LMCB Üniversitesi birimi (MC_U12266B) finansman MRC.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman< / güçlü >
Eppendorf Mikrosantrifüjler 5424/5424RThermoScientific05-400-002
Eppendorf 5702R A-4-38 Model Rotorlu SantrifüjlerThermoScientific12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Termal DöngüleyicilerSigma AldrichEP6331000025
Gen Pulser X Hücresi, CE ve dahil PC modülleriBioRad1652660
Güvenlik Kabini Foruna - SCANLAFLabogene
BioPhotometer PlusEppendorf
CLSM 710Zeiss
Media & Agarozlar
LoFlo OrtaFormediumLF0501
Seakem GTG AgaroseLonza50071
Düşük EEO AgaroseBioGene300-200
Saflaştırılmış AgarOksoitLP0028
SM suyuFormediumSMB0102
2x LB et suyuFormediumLBD0102
Kimyasallar
SYBR Güvenli DNA Jel LekesiThermoScientificS33102
1 Kb Plus DNA MerdiveniThermoScientific10787018
1 Kb DNA MerdiveniNEBN3232L
HEPES serbest asitSigma Aldrich/Merck391340 EMD
KH2PO4VWRP/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2OVWR10028-24-7
MgCl2 * 6 H2OSigma Aldrich/Merck5982 EMD
CaCl2 * 2 H2OSigma Aldrich442909
Folik AsitSigma AldrichF7876
KOHVWR26668.263
Cultur Yemekleri
96 Kuyu Hücre Kültürü Kümesi, Düşük Buharlaşma Kapaklı Düz Tabanlı, Doku Kültürü TedaviEdilmiş Corning Incorporated3595
6 Kuyulu Hücre Kültürü Kümesi, Kapaklı Düz Tabanlı, Doku Kültürü UygulanmışCorning Incorporated3516
100 x 20 mm stil Doku Kültürü Tabağı, Doku Kültürü UygulanmışCorning Incorporated353003
50 mm Cam Tabanlı Microwell Tabakları No1.5MatTek CorporationP50G-1.5-30-F
Antibiyotikler
üretilen Geneticin G418-sülfatGibco11811-023
Higromisin B AltınInvivoGenant-hg-1
Ek Sarf Malzemeleri
2 mm boşluklu elektroporasyon küvetleri, uzun elektrotGeneflow LimitedE6-0062
10 & mikro; L Aşılama Döngüsü, Mavi 10 Mikro LThermoScientific129399
Yayıcı, L şeklinde, sterilgreiner bio-one730190
Combitips gelişmiş 5 mLEppendorf BIOPUR30089669
Kits
ZR Plazmid Miniprep KlasikZymoresearchD4016
Hızlı DNA MiniprepKiti ZymoresearchD3025
Zymoclean DNA KurtarmaKiti ZymoresearchD40002
Enzimler
Kısıtlama enzimleriNEB
OneTaq 2X Standart Tamponlu Master MixNEBM0482L
T4 DNA LigazNEBM0202S
PrimeSTAR Max DNA PolimerazTakaraBioR045A
Life Technologies tarafından

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schaap, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum. Development. 138 (3), 387-396 (2011).
  2. Sussman, R., Sussman, M. Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).
  3. Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), 75(2008).
  4. Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein. The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).
  5. De Lozanne, A., Spudich, J. A. Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination. Science. 236, 1086-1091 (1987).
  6. Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum. Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).
  7. Knecht, D., Pang, K. M. Electroporation of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).
  8. Wetterauer, B., et al. Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene. Plasmid. 36, 169-181 (1996).
  9. Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains. Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).
  10. Bloomfield, G., et al. Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium. eLife. 4, (2015).
  11. Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. eLife. 5, (2016).
  12. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).
  13. Hoeller, O., Kay, R. R. Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients. Current Biology. 17, 813-817 (2007).
  14. Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement. Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).
  15. Schaap, P., et al. Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas. Science. 314, 661-663 (2006).
  16. Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).
  17. Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes. Science. 333 (6041), 467-470 (2011).
  18. Strassmann, J. E., Queller, D. C. Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).
  19. Wolf, J. B., et al. Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success. Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).
  20. Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).
  21. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).
  22. Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), 0196809(2018).
  23. Woznica, D., Knecht, D. A. Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).
  24. Dubin, M., Nellen, W. A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium. Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).
  25. de Hostos, E. L., et al. Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility. Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).
  26. Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium. Scientific Reports. 8 (1), 8471(2018).
  27. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  28. Rosengarten, R. D., et al. Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum. BMC Genomics. 16, 294(2015).
  29. Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).
  30. Gebbie, L., et al. Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).
  31. Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bakteriyel Se ilimElektroporasyon ProtokolTransfeksiyon Do rulamasSouthern Blot AnaliziKemotaksi DeneyiMakropinositoz B y mesiTaze zolatlarEkstrakromozomal Plazmit

İlgili makaleler