Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Summary

Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.

Abstract

Kanser hücre hareketlilik metastaz kabul töreni için önemlidir. Bu nedenle, araştırma hücre hareket ve invaziv kapasitesi büyük önem taşıyor. İstila deneyleri içinde vivo kanser hücre dislodgment Orijinal siteden taklit ve hücre dışı matriks ile işgal daha fizyolojik alakalı ise geçiş deneyleri 2D bir düzeyde hücre hareketinin temel anlayış sağlar. Geçerli protokol geçişi ve işgal deneyleri için tek bir iş akışı sağlar. Entegre otomatik mikroskobik kamera ile birlikte gerçek zamanlı HD görüntüleri ve yerleşik analizi modülü için araştırmacılar bir zaman verimli, basit ve tekrarlanabilir deneysel seçeneği verir. Bu protokol sarf malzemeleri için oyuncu değişikliği ve alternatif analiz yöntemleri seçmek kullanıcılar için de içerir.

Introduction

Hücre göç ve işgal yara kapatma, plasenta rahim ve meme bezi morfogenez^1,2,3içine işgali gibi insan vücudu normal işlevlerini etkinleştirmek önemli biyolojik işlemlerdir. İnsan vücudu bu biyolojik olayların hassas ve sıkı denetime sahip; Ancak, bazı istisnalar vardır. Malign tümörler, örneğin, bu korumayı kaçmak, anormal proliferasyonu sergi ve metastaz denir komşu doku istila edebiliyoruz. Metastaz kanserle ilgili mortalite⁴önemli nedenidir.

Meme kanseri en sık kadınlarda kanser tanısı ve gelişmiş ülkelerde dünya çapında⁵' kadınlar arasında kanser ile ilgili ölüm ikinci en yüksek nedeni var. Meme kanseri kanalları veya epitel hücrelerinin bir veya daha fazla kat oluşur lobules gelmektedir. Normal meme, epitel hücreleri birbirleriyle ve üzerinden E-cadherin ve integrinler⁶gibi membran proteinlerinin membran uygun. Ancak, invaziv meme kanseri hücrelerinin kendi Polarite ve hücre-hücre adezyon, kaybetmiş ve klasik epitel mezenkimal geçiş (EMT) geçmesi ve taşıma becerisi kazanırsınız. Ekstravazasyonu sonra bu hücreler hücre dışı matriks (ECM) gidin ve kan damarı veya lenfatik sistem, o zaman ardından intravasation ve metastatik büyüme⁷girin. Bu oluştuğu tarafından mekanizmaları anlama büyük önem taşıyor, metastaz Scotlan kanserle ilgili en sık nedenidir ve kanseri ile yakından ilgili geçiş/işgali hücre. Kanser hücrelerinin hareket görselleştirmek için göç ve işgal deneyleri hücre hareketi, 2D ve 3D sırasıyla eğitim için ideal modellerdir. İstila microenvironment ve biyolojik engelleri aşağılamak yeteneği ile etkileşimi içerir, ancak geçiş hücreleri hareket doğrudan değerlendiriyor. Geçiş işgalinin bir gereklilik olduğu gibi iki süreç bir başka tamamen bağımsız değildir.

Göç ve işgal çalışmaya çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Tarafından Kramer ve ark., yara iyileşmesi gibi geçiş deneyleri gözden olarak çit ve mikro-taşıyıcı deneyleri alan değişikliği değerlendiren hücreleri içine, taşımak izin vermek için bir boş hücre alanı oluşturmak; Oysa, transwell ve kılcal deneyleri cezbedici⁸doğru hareket hücreleri temel alır. İstila deneyleri için bir ECM ortam ECM jel veya kollajen ile örneğin ayarlanması gerekiyor ve 3D hareket değerlendirildi işgal alanı, mesafe ve hücre sayımları (örneğin transwell tahlil, platypus tahlil) izleyerek⁸. Başka bir istila tahlil non-invaziv hücreleri ile invaziv hücreleri birleştirmek ve invaziv hücreleri davranışını değerlendirmek için türüdür (örneğin küresel deneyleri). Belgili tanımlık yukarıda yöntem kendi artılarını ve eksilerini ve yaklaşım, tekrar ve geçiş tahlil birleştirmek kolay kolay bir şekilde ve işgal tahlil benzer iş akışında deneysel tasarım Tercihli.

Bu iletişim kuralı hücre göç ve canlı hücre Imager kullanarak işgali ölçümü açıklar. Standart hücre kültür kuluçka makinesine yüklü sistem izleme gerçek zamanlı bir hücredir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri tarama aralıkları ve ölçümler hücreleri veya floresan hedefler için uygun maskeleri uygulayarak kümesi göre alır. Geçiş/işgali tahlil modülü bir 96-şey tabak içinde sıfırdan yaraya homojen bir hücre monolayer yapmak için uygun bir 96-pin sıfırdan aracını kullanarak içerir. Mekanizması deneyleri şifa, bir plastik veya kaplı yüzey sadece 2D hücre hareket izleme tüp bebek yara temel alır. İşgal veya 3D hareket yara çizik içinde ek bir ECM arasında da tespit edilebilir. Kısa bir iş akışı Şekil 1' de gösterilmiştir.

Protocol

Not: İki hücre satırı ayrı olarak ele alınmalıdır. Aşağıdaki yordamlar tek tek hücre satıra uygulanan belirtilmediğinde.

1. hücre yoğunluğu yaralama önce optimize

1. Kültür T75 cm² doku kültürü şişeler yaklaşık % 80 yapışık hücreleri izdiham içinde fenol kırmızısı ücretsiz Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum (FBS), 200 mM L-glutamin ve % 5 CO₂ () ile 37 ° C'de 2 µg/mL insülin ile takıma DMEM) Standart kuluçka koşulları çoğu kanser hücre hatları, kültür formülasyonları için hücre satırı bağımlı vardır).
2. Kültür ortamını bir atık konteyner içine kapalı pipetting çıkarın. Önceden ısıtılmış % 0,1 tripsin EDTA kısaca hücre monolayer ve damlalıklı durulayın için 2 mL damlalıklı. Başka bir 2 mL % 0,1 tripsin-EDTA ekleyin ve 5 min için 37 ° C'de standart kuluçka koşulları altında şişeye koyun.
3. Şişeye dekolmanı hücrelerin emin olmak için yavaşça dokunun ve sonra önceden ısıtılmış kültür proteolitik reaksiyonu durdurmak için medya 10 mL ekleyin.
4. Hücre süspansiyon 15 mL santrifüj tüpü ve 200 x g (RT) Oda sıcaklığında 5 min için aşağı spin içine aktarın. Dikkatle süpernatant hücre Pelet Tantanacı olmadan kaldırmak ve başka bir 10 mL önceden ısıtılmış Kültür medya ile resuspend.

2. bir otomatik hücre Counter (veya herhangi bir sayma yöntemi) kullanarak hücre sayılması

1. Resuspended hücre süspansiyon seyreltik 200 µL ile 1 Dulbecco'nın fosfat x 800 µL serum fizyolojik (DPBS) bir 1,5 mL santrifüj tüpü arabelleğe alınmış.
2. 60 µm hücre sayısı algılayıcıyı hücre Sayaç Ekle, Değiştir tutun ve ucu hücre süspansiyon birleştirme. Hücre süspansiyon başarıyla sensör çizilmiş kadar yavaş yavaş geçiş serbest bırakın. Hücre konsantrasyonu hücre/mL görüntülenir.
3. 10 mL hücre süspansiyon hücre sayısında hesaplayın.

3. hücre kaplama

1. Bir dizi hücre yoğunluğu (40.000-90.000 hücreler/de) nüsha bir 96-şey plaka, plaka hücreleri.
2. Plaka canlı hücre Imager yerleştirin ve her 2 h 24 h için tarama zamanlayabilirsiniz.
   1. Yazılım, program inceden inceye gözden geçirmek görev listesinden tıklatın. Çekmece Kur bölmesinde, plaka konumunu belirlemek, Ekle gemi tıklatın ve plaka türünü seçin. İnceden inceye gözden geçirmek kurulum bölmesinde seçin veya deneysel plaka kuruluma göre tarama kalıbı düzenlemek ve Tarama türü Standartayarlayın.
   2. Zaman çizelgesi üzerinde sağ tıklatıp Küme aralıklarıseçin. Eklemek inceden inceye gözden geçirmek her 2 h 24-h zamanlama olarak ayarlayın. Uygula' yı tıklatın.

4. yoğunluk geçiş tahlil için tohum optimum hücre belirleyin

1. 24 saat sonra tarama Stop çözümleme aracı otomatik olarak toplanan HD-faz kontrast görüntü işleme izdiham uygulamak ve zamana karşı bir hücre proliferasyonu eğrisi oluşturmak.
   1. 3-6 temsilcisi görüntüleri belirlemek ve yer onları içinde yeni bir Resim koleksiyonu.
   2. Uygun bir maske İşleme tanımıolarak belirleyin.
   3. Bir analiz iş başlatmak.
   4. En iyi duruma getirilmiş hücre yoğunluğu izdiham zamana karşı göre belirlemek (yaklaşık % 100 izdiham içinde 6-18 h bağlı olarak geçiş tahlil ne zaman başlar).
      Not: O izdiham için hücreleri büyümek için gereken zaman miktarı tohumlama seyreltme bağlı olarak değişir.

5. gün 1 ve 2: göç ve işgal deneyleri için hazırlık

1. Gün 1'de, plaka işgali tahlil için kat.
   Not: ECM jel her zaman ele alınabilir buz ve buzdolabında bir gecede yer var ipuçları ile.
   1. ECM jel ile buz gibi kültür kitle iletişim araçları 100 µg/ml seyreltik ve 50 µL seyreltilmiş ECM jel/medya belirlenen kuyu ekleyin.
   2. Yer plaka Standart kuluçka koşulları, bir gecede.
2. Gün 2, yavaşça aşırı medya Aspire edin. Geç öğleden sonra (geçerli protokol için en iyi duruma getirilmiş tohumlama yoğunlukları ile en iyi duruma getirilmiş hücre yoğunluğu 2 96-şey tabak (kaplanmamış) geçiş tahlil için belirlenmiş ve (Bölüm 1-3 takip triplicates kaplı) işgali tahlil içine hücreleri plaka ZR75-1 ve MDA-MB-231 edildi 90.000/iyi ve 50.000/iyi, sırasıyla).
3. Plakaları standart kuluçka koşulları gecede yerleştirin.

6. gün 3: Yara çizik

1. Sprey ve karalama aracı ve tekneler % 70 etanol ile onları içinde Biyogüvenlik kabini yerleştirmeden önce yıkama 2 silin. 1 ve 2 yıkama teknenin sırasıyla tam olarak 45 mL steril (autoclaved) distile su ve % 70 etanol doldurmak.
2. Sterilizasyon için karalama aracı iğne bloğu (üst) tekne 1 ve 2 5 min için yıkama üzerine yerleştirin.
3. Geçiş tahlil plaka ile başlayın.
   1. Kuluçka makinesi hücreleri içeren plaka taşımak ve hiçbir şey sıfırdan aracın zarar görmemesi için kuru olduğundan emin olun. Plaka kapağını çıkarın ve karalama aracı taban plakası yuvasına yerleştirin ve dikkatle dübeller göstererek taban parçası üzerine üst kısmında yer. Basýn ve siyah kolu tutun ve bu arada dikkatle PIN blok. Her şey boşluklar genellikle çıplak gözle ve mikroskop altında görülebilir.
   2. Hızlı bir şekilde iğne suda ıslatın; Bu plaka Kur aynı ise önce işgal tahlil plaka tırmalamak karalama aracı temizlemek yeterlidir. Aksi takdirde, her biri 5 min için steril distile su ve % 70 etanol ile sterilizasyon adımları yineleyin.
4. Yıkama plaka 1 veya 2 kez önceden ısıtılmış kültür müstakil hücreleri veya hücre önlemek için medya ile kuyuya reattaching sayfaları.
5. Taze sıcak ortam 100 µL belirlenen kuyu veya tedavileri olmadan içine ekleyin.
6. İstila tahlil için ek adımlar.
   1. Equilibrate ve dikkatli bir şekilde soğuk ortam Aspire edin 5 min için 4 ° C'de işgali tahlil tabak koyun.
   2. ECM jel ile buz gibi kültür kitle iletişim araçları 5 mg/ml seyreltik ve 30 dk için standart kuluçka altında yer 50 µL seyreltilmiş ECM jel belirlenen kuyu içine ekleyin.
   3. Sıcak-up medya veya bileşikler test olmadan 100 µL ekleyin.
7. Plaka canlı hücre Imager koyun ve 5 dk. Seç Gemi türü olarak imagelock plaka için equilibrate izin verin. Tarama türü Sıfırdan yaraayarla, seçin veya Tarama deseni deneysel plaka göre (1 görüntü/iyi ve geniş modu) düzenlemek ve yaraları iyileşene kadar 24-h tekrar her 1-2 h 72 h için tarama zamanlayabilirsiniz.
8. Karalama aracı temizlemek için en iyi PIN blok her aşağıdaki çözümleri (45 mL tekneler yıkama içinde) 5 dk: %0.5 deterjan 1 koymak (bakınız Tablo malzemeler), % 1 deterjan (bkz. Tablo reçetesi) 2, steril distile su ve % 70 etanol. Kazı-kazan aracın geri mağaza ve taban plakası üzerine bir tozsuz ortamda getirin.

7. veri analizi

1. Çekmece Kur deneysel plaka seçme ve Gemi kaldır'ıtıklatarak tüm yaraları iyileşti sonra belirlenen plaka Taramayı durdur.
2. 3-6 temsilcisi görüntüleri ses yüzdeleri, yara, yara kapatma % 10 ve % 50 tarafından yapıldıktan sonra görüntüleri hakkı da dahil olmak üzere bir dizi kapsayan toplamak.
3. Uygun işlem tanımını belirlemek için uygun Yara maskesi çizik ve İzdiham maskesiuygulamak için Segmentasyon ayarlama, Temizleme ve filtreleri kullanın. Önizleme geçerli/tüm maskeler doğruluğunu görüntülemek için kullanın.
4. Analiz iş başlatmak.
5. Veri yazılım içinde analiz veya daha ayrıntılı bir çözümleme için verilebilir. Yazılım tarafından sağlanan üç ölçümleri HD fazlı görüntüleri değerlendirmek için kullanılabilir: yara yara genişliği (µm), izdiham (%) ve göreceli yara yoğunluğu (%). Karşılaştırma aşağıdaki bölümde ele alınacaktır.

Results

Bu geçiş/işgali tahlil 96-pin karalama aracı tarafından oluşturulan boş hücre alana taşıma hücre oranı değerlendirir yara iyileşme tahlil temel alır. Göç ve işgal deneyleri arasındaki fark vardır geçiş ECM jel arasında hareket doku kültürü tedavi plastik yüzey ve işgal önlemler hücrelerde taşıma ölçü birimi hücre deneyleri.

Karalama aracı belirlenen plaka tutarlı sıfırdan yara açmak için tasarlanmıştır ve canlı hücre Imager sıfı...

Discussion

Göç ve işgal kanser hücrelerinin hareketliliğini değerlendirmek için önemli parametreleridir. 96-pin karalama aracı kullanarak, aynı anda deneyleri 2D ve 3D şifa yara yapmak mümkündür. Otomatik tarama kolaylaştırıcı dışında en az kesinti ile istikrarlı hücre kültür ortamı sağlayarak 96-pin karalama Aracı kullanılarak yürütülen karalama tahlil daha sağlam deneyler etkinleştirme tutarlı sıfırdan yaralar sağlar ve tekrarlanabilir. 96-şey plaka biçim hücre hatları veya farklı ilaç tedavileri sayısı artan ek seçenekler sunar....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
% 0.5 tripsin-EDTA çözeltisi (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	DPBS
Countess II FL Otomatik Hücre Sayacı	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Otomatik hücre sayacı
Deterjan 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	% 0.5 çalışma konsantrasyonu
Deterjan 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		% 1 çalışıyor konsantrasyon
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium, fenol kırmızısı içermeyen	ThermoFisher Scientific	21063-045	%10 FBS, 200 mM L-glutamin, 2 & ile birlikte verilir; g/ml insülin
ECM Jel (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Büyüme faktörü azaltılmış, fenol kırmızısı içermez
Essen ImageLock 96 oyuklu plaka, düz tabanlı	Essen	4379
EVE Sayma slaytları	BioTools	EVS-50
Fetal sığır serumu (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96 oyuklu çizik yara hücresi istilası aksesuarlar	Essen	4444	CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Hücre migrasyon kiti	Essen	4493	96 oyuklu pim bloğu, 2x yıkama teknesi ve
IncuCyte ZOOM	Essen		Canlı hücre analiz sistemi
İnsülin çözeltisi insan	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-glutamin çözeltisi (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Doku kültürü şişesi, 75 cm2 büyüme alanı	Greiner Bio-One	658175