Yöntem makalesi

Oksijen tüketim oranını bir hücre dışı akı Analyzer kullanarak birincil kültürlü fare yenidoğan Cardiomyocytes içinde analiz

8.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59052

⸱

13 Şubat 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Pharmacology, University of California San Diego, 3Cardiology Section, Department of Medicine, Veterans Administration Healthcare, San Diego

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralının amacı fare yenidoğan cardiomyocytes bir modeli sistemi olarak nasıl çeşitli faktörler oksijen tüketimi kalp değiştirebilirsiniz incelemek için nasıl kullanılacağını göstermektir.

Özet

Mitokondri ve oksidatif metabolizma kalp kası fonksiyonu korumak için önemlidir. Araştırmalar bu mitokondrial disfonksiyon kalp yetmezliği bulunan Engelli kardiyak fonksiyon için önemli bir faktör olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, arızalı mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kalbinde kardiyak fonksiyon geliştirmek için yararlı etkileri olabilir. Bu nedenle, düzenleyici mekanizmaları eğitim ve Roman düzenleyiciler, mitokondriyal işlev için tanımlama kalp hastalığı tedavisi için yeni tedavi hedefleri geliştirmek için kullanılan fikir sağlayabilir. Burada, kardiyak myocyte mitokondrial solunum benzersiz hücre kültür sistemi kullanılarak analiz edilir. İlk olarak, bir protokol hızla yalıtmak ve yüksek canlılık yenidoğan fare cardiomyocytes kültür için optimize edilmiştir. Daha sonra bir 96-iyi biçim hücre dışı akı analyzer bu cardiomyocytes oksijen tüketim hızı değerlendirmek için kullanılır. Bu iletişim kuralı için koşullar tohum en iyi duruma getirilmiş ve o yenidoğan fare cardiomyocytes oksijen tüketim oranını kolayca bir hücre dışı akı Çözümleyicisi'nde tespit edilebilir gösterdi. Son olarak, biz daha büyük bir kültür boyutu bizim iletişim kuralı uygulanabilir ve diğer çalışmalar, contractile ve hücre içi sinyal gibi analiz çalışması unutmayın.

Giriş

Sürekli kardiyak contractile işlevini sürdürebilmek için cardiomyocytes hücresel enerji ATP1şeklinde öncelikle sürekli bir tedarik korumak gerekir. Kalbinden, ATP yaklaşık % 95'i mitokondri, Oksidatif fosforilasyon, mitokondri kardiyak fonksiyon2,3' te çok önemli bir Biyo-enerjetik rol oynamak gösterilen üzerinden olmak üzere oluşturulur. Bu fikri destekleyen olduğunu mitokondriyal işlev bozukluk kardiyomiyopati ve kalp yetmezliği4,5' e neden olabilir. Diğer taraftan, mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kardiyak fonksiyon geliştirmek için gösterilmiştir kalp6,7. Bu nedenle, mitokondriyal bioenergetics mekanizması eğitim ve mitokondrial fonksiyonunu kullanabilirsiniz cardiomyocytes roman düzenleyiciler belirlenmesi sadece kalp enerji üretim mekanik anlayışlar ortaya değil ama ayrıca yol açacak fikir sağlayabilir kalp hastalıkları6,8tedavisi için yeni tedavi hedefleri gelişimi için.

Tüm kalp için karşılaştırıldığında, hangi miyositler ve sigara miyositler9, cardiomyocyte kültürlerin karışımı içeren son derece saf, yürekten, fibroblastlar ve endotel hücreleri10gibi miyositler en az kirlenme ile. Buna ek olarak, cardiomyocytes yenidoğan pups dan izole zaman, Yetişkin kalpler10,11' den izole hücrelere kıyasla küçük bir miktarda çok sayıda hücre kültürü çalışmalarının sağlar. En önemlisi, birincil kültürlü yetişkin fare cardiomyocytes (örneğin 24 h) kez kısa hayatta kalma var ve de-puan daha uzun zaman ayırmak. Yenidoğan fare cardiomyocytes yaşayabilir ve yukarı 7 gün içinde kültür, onları cardiomyocytes10dakika sonra uyuşturucu bileşikler ve mitokondri gen düzenleme fonksiyonları üzerine etkilerini test etmek için idealdir için manipüle edilebilir. Tabii ki, Yetişkin ve neonatal hücreler arasında önemli biyolojik farklılıklar vardır, ama yenidoğan hücre kültürü için daha uzun süre onları çalışmalar, mitokondriyal işlev de dahil olmak üzere birçok farklı türleri için uygun hale getirir.

Bugüne kadar birincil kültürlü yenidoğan fare ve sıçan cardiomyocytes model olarak kardiyak bioenergetics12,13eğitim için kullanılmaktadır. Son yıllarda çalışmalar bir hücre dışı akı analizörü oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek ve fare ve sıçan yenidoğan cardiomyocytes14,15dakika sonra oksidatif kapasite değerlendirmek için kullanılır. Fareler için karşılaştırıldığında, fare yenidoğan cardiomyocytes hücre canlılığı düşüktür ve büyük değişkenlik16vardır. Ayrıca, hücre genetiği fare modelleri arasında çalışma olanağı fare hücre modeli çok önemli yapar. OCR çalışmalar hücre sayısı ve yoğunluğu tohum kadar hassas olduğunu göz önüne alındığında, tutarlı hücre verim ve canlılık elde etmek için tekrarlanabilir, güvenilir ve basit bir iletişim kuralı geliştirilmesi gereklidir.

Burada, kültürlü fare yenidoğan cardiomyocytes 96-iyi format hücre dışı akı analyzer ile birlikte OCR analiz için kullanan geliştirilmiştir bir en iyi duruma getirilmiş protokol raporu. Bu iletişim kuralı büyük tekrarlanabilirlik testin artırır. Ayrıca, protokol sadece bir roman ve OCR analiz için tekrarlanabilir yöntemi sağlar, ama aynı zamanda daha büyük bir boyut kültür ve hücre içi myofibrillar fonksiyonlar çalışma için gerekli olabilen bu gibi diğer Deneysel amaçlar için adapte Sinyal yollar.

Özellikle, bu iletişim kuralı bir günlük yordam yalıtım ve neonatal fare cardiomyocytes bir 96-şey hücre kültür plaka kültür açıklar. Buna ek olarak, bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak oksijen tüketimi ölçmek için yordamı açıklar. Tüm çözümler kullanılan steril veya steril filtre. Tüm araçları % 75 etanol tarafından sterilize. Yordamı çeşitli bölümleri için bir Tablo malzeme sağlar. Cardiomyocytes kültür için tüm yordamları ve adımları bir standart hücre kültür mahallede gerçekleştirilir. Bu iletişim kuralı--dan bir çöp (yaklaşık 8-10 yavru) yenidoğan fare kalplerin yalıtım için geliştirilmiştir. Ancak, iletişim kuralı da cardiomyocytes birden çok çöp üzerinden yalıtmak için adapte edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yenidoğan fareler ile çalışmaları için lütfen yerel üniversite/Enstitü yönergeleri ileri hayvan bakımı programlar tarafından bakın ve kişinin kurumsal ve diğer uygun düzenlemeler için uygun. Bu protokol için açıklanan tüm yöntemleri UC San Diego kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve federal ve eyalet düzenlemelere uygun.

1. hazırlanması reaktifler

  1. 25 mL öncesi sindirim çözeltisihazırlamak: tripsin (0,5 mg/mL) ile birlikte HBSS (olmadan Ca2 + ve Mg2 +). 0,22 µm filtre kullanarak çözüm sterilize ve buza kadar kullanmak tutun. Öncesi sindirim çözüm deneme günü olun.
    Not: HBSS Ca2 + kullanmak için önemlidir ve Mg2 +, olarak Ca2 + ve Mg2 + myocyte kasılma ve yalıtım sırasında sonraki hücre ölümüne neden olur.
  2. 30 mL collagenase sindirimarabelleği hazırlamak: HBSS (olmadan Ca2 + ve Mg2 +) arabellekte çözünmüş collagenase (0,8 mg/mL, yaklaşık 350 U/mL). 0,22 µm filtre kullanarak çözüm sterilize ve buza kadar kullanmak tutun. Collagenase sindirim çözüm deneme günü olun.
  3. Cardiomyocyte kültürortamının (büyüme medya) 500 mL hazırlamak: Mix DMEM 375 mL, M-199 125 mL, at serum 25 mL ve FBS 12,5 mL. % 1 penisilin ve % 1 streptomisin çözüm ile ek.
  4. Mitokondrial stres testi ortahazırlamak: DMEM yapmak 200 mL dayalı (DMEM NaHCO3, olmadan görmek Tablo reçetesi) stres testi orta 1 mM sodyum pyruvate, 2 mM L-glutamin ve 10 mM glikoz ve 2 mM Hepes ile desteklenmiştir.
    Not: Orta 1 L DMEM ile sodyum pyruvate, L-glutamine, glikoz ve Hepes, steril, filler yapmak ve 4 ° c'saklamak Stres testi orta tahlil gününde diğer ayıraçlar ekleyerek hazırlayın. DMEM kullanarak NaHCO3 olmadan orta önemlidir.
  5. PH 7.4 medyaya mitokondrial stres testi kullanım gününde ayarlayın. Kullanmadan önce 37 ° C sıcak ortama.
  6. Oligomycinhazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de
  7. FCCPhazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de
  8. Antimycin Ahazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de
  9. Rotenonhazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de
    Not: Tüm reaktifler ve çözümleri bu protokol için kullanılan Tablo 1' de listelenmiştir.

2. hasat ve Neonatal fareler (gün 1) üzerinden kalplerin öncesi sindirim

  1. Otoklav makas, pens ve sterilize etmek için Moria kaşıkla.
  2. Hücre kültür mahalle kısırlık için tüm adımları gerçekleştirin.
  3. Her şey bir 6-şey hücre kültür plaka için aliquot 5 mL HBSS (olmadan Ca+ 2, Mg2 +) de; Buza koyun. HBSS aliquot 10 mL 10 cm hücre kültür çanak içine.
  4. 20 mL 50 mL steril konik tüp içinde tripsin öncesi sindirim çözeltisi hazırlamak. Tüm çözümler buz üzerinde tutun.
  5. Hızlı bir şekilde % 70 etanol çözüm sterilizasyon için yenidoğan (0 gün) farelerde daldırma.
  6. Steril makas (düz) anestezi kullanarak pups başını kesmek ve göğüs göğüs boşluğu ve kalp erişmesine izin vermek için göğüs kemiği boyunca açın. (Şekil 1A)
    Not: 1) P0 yenidoğan fareler yüksek hücre canlılık elde etmek için kullanmak için önemlidir. 2) bu ötenazi Yöntem ventilasyon NIH ve Amerikalı hayvan hastalıklarıyla ilgili tıbbi kurum yönergeleri 17uyarınca yasaktır.
  7. Kalpler vücuttan bir iyi makas ve transfer hemen HBSS (Ca2 +, Mg2 +) içeren steril hücre kültür çanak içine extract (Şekil 1B).
  8. Kaldır herhangi bir kalıntı akciğer dokusu, daha büyük gemiler, vb (ve istenirse atria,). Kalpler nazik ajitasyon kullanarak HBSS solüsyonu içinde yıkayın.
  9. Her kalp ince bir makasla 8 parçalar halinde kesilmiş ve tüm kalp doku 6-şey hücre kültür plaka HBSS (Şekil 1 c ve 1 D) ile bir kuyuya forseps ile aktarın.
  10. Kalpleri bir Moria kaşık (Şekil 1 d) kullanarak HBSS ile dolu 6-şey plaka iyi iyi kalpleri aktararak yıkayın.
    Not: İyi iyi kalpleri aktarma kan yıkamak için yeterli olacaktır. Kan ile enzimatik sindirim engelleyen beri kalpler HBSS ile yıkama ve kan kaldırmak önemlidir.
  11. Kalpleri Moria kaşıkla tripsin (0,5 mg/mL) 20 mL içeren bir konik tüp içine aktarmak ve 4 h (Şekil 1E) için 4 ° C'de nazik ajitasyon ile kuluçkaya.

3. bir 96-şey kültür plaka (gün 1) hazırlayın

  1. 5 mL kaplama çözeltisi hazırlamak: % 0.5 jelatin (otoklav kullanmadan önce) ve % 1 fibronektin çözüm içeren PBS. (örneğin 5 mL jelatin çözüm artı 50 µL fibronektin çözüm)
  2. 96-şey hücre kültür plaka her kuyuya kaplama çözümün aliquot 50 µL ( Tablo malzemelerigörmek). Kabarcıklar varsa, onları dışarı kabarcıklar emmeye 20 µL pipet kullanarak kaldırın.
    Not: Her şey kaplama solüsyonu ile tüm yüzey alanı kapsayacak şekilde önemlidir.
  3. 37 ° C hücre kültür kuluçka 1 h veya matris kaplama kurutma izin vermek için daha fazla plaka kuluçkaya.
  4. Herhangi bir kalıntı kaplama çözüm cardiomyocytes tohum önce Aspire edin.

4. enzimatik sindirim ve kaplama hücre (1 gün)

  1. Collagenase sindirim çözüm 37 ° C su banyosu içinde önceden ısıtmak.
    Not: Bu verimli enzimatik sindirim elde etmek önemli bir adımdır bu.
  2. Kalpleri ve 4 ° C ön sindirim çözümden bir hücre kültür hood için içeren konik tüp taşıyın. (Şekil 1F)
  3. Kalpleri ve lavabo tüp altına 10 mL serolojik pipet öncesi sindirim çözüm kaldırmak izin (yalıtım orta 1-2 mL tüp kalabilir).
  4. HBSS 10 mL tüp içine ekleyin. Kalpler HBSS ile 2 - 3 kez yeniden askıya bir 10 mL serolojik pipet kullanarak tripsin yıkamak için. HBSS Aspire edin (1-2 mL tüp kalabilir).
  5. Önceden ısıtılmış collagenase sindirim çözüm 10 mL yürekleri tüp içine ekleyin. (Şekil 1G)
  6. Ajitasyon olmadan 10 dk 37 ° C su banyosunda yürekleri tüp kuluçkaya (1 sindirim).
  7. 1 sindirim sonra hücre kültür hood için tüp taşıyın. Yavaşça kalpler yavaşça 10 kat 10 mL serolojik pipet kullanarak tüp içinde kalpleri yeniden askıya tarafından triturate. Bu dağıtmak için kalpleri ve kalp dokudan var olmak serbest bırakmak hücrelere izin verir. (Şekil 1 H)
    Not: Cardiomyocytes kırılgan olduğundan, nazik toz yüksek canlılık elde etmek önemlidir.
  8. Lavabo, sindirilmiş çözüm cardiomyocytes (yaklaşık 9-10 mL) için yeni bir konik tüp içinde zenginleştirilmiş aktarmak ve hemen collagenase sindirim durdurmak için hücre kültür ortamının eşit miktarda ekleyin sindirilmemiş doku izin.
  9. Kalan sindirilmemiş kalp dokusu içeren tüpe 10 mL collagenase sindirim çözeltisi ekleyin.
  10. 10 dk 37 ° C su banyosunda kalp dokusu ile tüp kuluçkaya (2 sindirim).
  11. 4.7 ve 4,8 yordamı yineleyin.
    Not: Hala çok sindirilmemiş doku, sindirim bir kez daha yineleyin. Ancak, çoğu durumda, iki kesimi hücrelerin çoğu kalp dokudan dağıtmak için yeterlidir.
  12. Steril hücre süzgeç (100 µm naylon mesh) yeni bir steril 50 mL konik tüpü yerleştirin. 2-3 mL hücre kültür ortamının ile hücre süzgeç önceden ıslak ve hücre-süzgeç ile hücreleri geçirin. Hücre-süzgeç ile 2-3 mL hücre kültür ortamının durulayın. (Şekil 1I)
  13. Konik tüp cardiomyocytes 180 x g (Şekil 1J), 5 min için içeren santrifüj kapasitesi. Hücre doku artıkları içeren ve hücre Pelet 10 mL hücre kültür medya (Şekil 1 L) yeniden askıya süpernatant (Şekil 1 K), Aspire edin.
  14. Yavaşça hücreleri ve plaka hücreleri üzerine 10 cm hücre kültür çanak (plastik kaplama her türlü olmadan) resuspend ve bir hücre kültür kuluçka (1 ön kaplama) 1 h için kuluçkaya (Şekil 1 M). Bu ön kaplama adım sigara-cardiomyocytes, fibroblastlar ve kaplamasız hücre kültürü yemek için uymaları endotel hücreleri gibi sağlar.
    Not: Bu noktada, cardiomyocytes genellikle yuvarlak bir şekli olan ve mikroskop altında parlak görünür. (Şekil 1N).
  15. 1 h kuluçka sonra yavaşça plaka kışkırtmak, yapışık olmayan hücreleri (cardiomyocytes içinde zenginleştirilmiş) 10 cm kültür bulaşık yıkama ve hücreleri hücre kültür orta 10 mL serolojik pipet kullanarak çanak üzerinde art arda pipetting tarafından yeniden askıya alma. Sonra bir yeni 10 cm hücre kültür çanak (plastik olmadan herhangi bir kaplama) içine yapışık olmayan hücreleri (cardiomyocytes içinde zenginleştirilmiş) aktarmak ve bir hücre kültür kuluçka (2 ön kaplama) ek bir 1 h için kuluçkaya.
    Not: Sigara kaplı plakasına eklemek hücrelerdir baskın sigara cardiomyocytes: fibroblast ve endotel hücreleri, mikroskop (Şekil 1O) altında görüntülenir.
  16. 2 öncesi kaplama sonra yavaşça plaka kışkırtmak, yapışık olmayan hücreleri (cardiomyocytes) 10 cm kültür bulaşık yıkamak, sonra cardiomyocytes bir yeni 50 mL konik tüp içine aktarın.

5. hücre sayımı ve hücreleri bir 96-şey hücre kültür plaka (gün 1) kaplama

  1. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  2. Hücreleri içine bir yoğunluk arasında 10-30 x 103 hücreleri/200 µL (Şekil 1 P) son bir hacim içinde bir çok kanallı pipet kullanarak iyi bir hücre dışı matriks kaplı 96-şey hücre kültür plaka plaka. Kuyu A1, A12, H1 ve H12 arka planı olarak kullanabilir: 200 µL kültür ortamının diğer kuyu bu Wells (hücreler) olarak ekleyin. 37 ° C hücre kültür kuluçka plaka kuluçkaya.
    Not: Bu çalışmada, oksijen tüketimi farklı hücre yoğunlukları 10 x 103, 20 x 103veya 30 x 103 hücreleri/iyi gibi kullanarak test edildi. (Şekil 2A). Ayrıca, yukarıdaki gibi cardiomyocytes hemen sonra yalıtım genellikle yuvarlak bir şekli olan ve mikroskop altında parlak görünür. Hücrelerin içinde 16-24 h kültürünün dümdüz.

6. oksijen tüketimi tahlil bir 96-iyi format hücre dışı akı Analyzer'ı (2 gün)

Not: Oksijen tüketimi tahlil hücreleri kaplama sonra bir gün dışarı taşınan veya daha sonra. Bu iletişim kuralı 7 gün yaşayabilir yenidoğan cardiomyocytes kültürlü kullanarak yalıtım sonrası.

  1. Akı analyzer sensör kartuş hidrat ( Tablo malzemelerigörmek) en az 3 saat ama ideal olarak tahlil önce tam bir gün için. Calibrant çözümün 200 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) yardımcı programı plaka her kuyuya, sensör kartuşu yardımcı programı tabağa koy ve 37 ° C kuluçka CO2 veya O2 takviyesi olmadan kuluçkaya.
  2. Hücre kültür medya bir saat önce tahlil mitokondri stres testi orta olarak değiştirin. Cardiomyocytes kırılgandır. Bu nedenle, yavaşça bir çok kanallı pipet kullanarak hücre kültür ortamını çıkarın ve önceden ısıtılmış mitokondrial stres testi medya 200 µL hücrelerle iki kez yıkayın. İkinci yıkama sonra önceden ısıtılmış mitokondri stres testi medya 175 µL ekleyin ve 37° C kuluçka CO2 veya O2 takviyesi olmadan hücreler kültür.
  3. Konsantre test bileşikler hazırlayın. Mitokondri stres testi için 3,0 mL her 16 µM oligomycin, 9 µM FCCP ve 20 µM Rotenon ve 20 µM antimycin A, tüm mitokondrial stres testi ortamda karışımı hazırlayın.
    Not: Her kampta açıklanan konsantrasyon test edilmiştir. Ancak, kişinin kendi laboratuvarında her bileşik toplama titrating gereklidir.
  4. Her bileşik 25 µL sensör kartuş çok kanallı pipet (Şekil 1Ç) kullanarak enjektör bağlantı noktalarına yükleyin. Birim ve nihai toplama Tablo 2' de açıklanmıştır.
  5. Hücre dışı akı tahlil Protokolü ayarlayın. Program açıklandığı Tablo 3.
  6. Programı başlatın. İlk olarak, sensör kartuş kalibrasyon (Şekil 1R) için makine içine koymak. Kalibrasyon adım işlem tamamlandıktan sonra tahlil plaka için calibrant değiştirin.
    Not: Üreticisi tarafından sağlanan yazılımı kullanmanız, kuyu ve her bileşik grupları ve bağlantı noktası anlamına gelir.
  7. İstenirse, tahlil sonra dikkatli bir şekilde bir çok kanallı pipet kullanarak tüm tahlil orta atmak ve hücre kültür Mikroplaka protein tahlil kullanarak gelecekteki hücre normalleştirme için-20 ° C'de depolayın.
  8. Protein içeriği ölçmek. Standart RIPA hücre lizis çözüm 50 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Plaka tam hücreleri parçalayıcı için 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Tüm malzeme için yeni bir açık düz dipli 96 iyi tahlil plaka aktarın.
  9. BCA tahlil üreticisinin protokolüne göre tarafından protein konsantrasyonu ölçmek.
    Not: Hücre dışı matriks ile iyi kaplama yüksek protein konsantrasyonu her iyi sonuçlanır. Bu nedenle, gerçek hücre protein konsantrasyonu almak için arka plan well(s) (hücre) tutarını çıkarmak. Hücrelerinden elde edilen protein konsantrasyonu bir 96-şey kültür tabağına düşüktür. Buna ek olarak, protein konsantrasyonu iyi iyi hücre dışı matriks kaplama nedeniyle farklı. Bu nedenle, OCR normalleştirmek için cep telefonu numarasını kullanarak önerilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, kalpleri gün 0 yenidoğan pups izole edildi. 5 x 105 hücreleri/yavru elde ve cardiomyocytes, yoğunlukları 10 x 103, 20 x 103veya 30 x 103 hücreleri/iyi, 96 iyi tabak (Şekil 2A) numaralı seribaşı. Gecede kültür sonra cardiomyocytes bulundu iyi kaplı plastik yüzey için ekli vardı (ekli olmayan hücreleri hala görünür gibi yuvarlak ve parlak, dağılın olan sağlıklı, ekli hücreleri i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, yalıtma ve fare yenidoğan cardiomyocytes kültür için basit bir protokol kurduk. Bu cardiomyocytes kullanarak, biz de bir hücre dışı akı analiz sistemi kullanılarak oksijen tüketim oranını ölçmek için koşulları optimize. Protokol bir fare yenidoğan cardiomyocytes nasıl çeşitli faktörlere ne olduğu gibi organ ölçülen akin to Heart, asıl çalışma hücrelerdeki oksijen tüketimi değiştirebilirsiniz incelemek için bir model sistemi olarak kullanmak izin verir. Bizim daha önce yayımlanmış protokolleri

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Tüm Ross laboratuvar ve Murphy laboratuvar üye teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Y.C. NIH (HL115933, HL127806) ve R.S.R. için VA hak (BX003260) Amerikan Kalp Derneği (14SDG17790005) tarafından desteklenmektedir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antimisin ASIGMAA8674mu'nun kompleks III'ünü inhibe eder
; m gözeneklerFALCON352360Sindirilmemiş dokuyu yakalamak için
Kollajenaz tip IIWorthingtonLS004176Kollajenaz sindirim çözeltisi yapmak için
D-GlukozSIGMA75351Mitokodansyal stres testi ortamı yapmak için
DMEM yüksek glikozYaşam teknolojileri11965-092Hücre kültürü ortamı yapmak
NaHCO3, Glukoz, piruvat, glumanin ve Heps içermeyen DMEMSIGMAD5030-10X1LMitokodniyal stres testi ortamı yapmak için
FCCP (Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon)SIGMAC2920Mitokondriyal solunumu ayırır
Fetal sığır serumu (FBS)Yaşam teknolojileri26140-079Hücre kültürü ortamı
yapmak için Fibronektin sığır plazmasıSIGMAF1141-5MGDoku kültürü plakaları için kaplama çözeltisi yapmak için
İnce makasGüzel Bilimler Araçları14060-10Kalplerin diseksiyonu için
Domuz derisinden jelatinSIGMAG-1890Doku kültürü plakaları için kaplama çözeltisi yapmak için
HBSS (Hank'in dengeli tuz çözeltisi, Ca2 + < / sup>, Mg2 + < / sup>)Cellgro21-022-CVKalpleri yıkamak ve ön sindirim ve kollagnaz sindirim solüsyonu yapmak için
HEPES (1 M)Fisher scientific15630080Mitokodnriyal stres testi ortamı yapmak At
serumuYaşam teknolojileri26050-088Hücre kültürü ortamı yapmak için
L-GlutaminSIGMAG-3126Mitokodniyal stres testi ortamı yapmak için
M-199Cellgro10-060-CVHücre kültürü ortamı yapmak için
Moria kaşığıFisher bilimselNC9190356Kalpleri yıkamak için 
OligomisinSIGMA75351-5MGMitokondriyal ATP sentazı inhibe eder
RIPA tamponuFisher scientific89900Protein tahlili için hücreleri parçalamak için
RotenoneSIGMAR8875Mitokondrinin kompleks I'ini inhibe eder
Denizatı XFe96 Hücre Dışı Akı
Analizörü		AgilentOksijen tüketim oranını
Denizatı XFe96 FluxPakAgilent102601-100Akı analizörü kültür plakaları, sensör kartuşları ve kalibant
paketi Sodyum piruvatSIGMAP2256Mitokodneryal stres testi ortamı yapmak için
Düz makasGüzel Bilimler Araçları91401-12Kalplerin diseksiyonu için
Şırınga filtresi 0.2 & mu; m boyutuSindirim ortamının steril filtrasyonu için
TrypsinUSB Corporation22715 25GMÖn sindirim çözeltisi yapmak için
Mitokondri Hücre süzgeci 100 & analiz etmek için kullanılan cihaz

Kaynaklar

  1. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
  2. Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
  3. Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
  4. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
  5. Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116(2015).
  6. Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
  7. Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).
  8. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
  9. Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
  10. Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
  11. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
  12. Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
  13. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).
  14. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
  15. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
  16. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
  17. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  18. Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
  19. Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
  20. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  21. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  22. Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
  23. Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
  24. Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
  25. Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
  26. Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
  27. Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
  28. Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
  29. Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
  30. Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
  31. Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
  32. Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mitokondriyal SolunumH cre zolasyonu96 Kuyucuklu PlakaKollajenaz SindirimiHemositometre Say mMitokondriyal Stres TestiFCCP Dekupl r

İlgili makaleler