Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Ranjan K. Behera; Kevin D. Mlynek; Matthew S. Linz; Shaun R. Brinsmade

doi:10.3791/59055

Yöntem makalesi

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

DOI:

10.3791/59055

⸱

19 Şubat 2019

Ranjan K. Behera¹ , Kevin D. Mlynek¹ , Matthew S. Linz¹ , Shaun R. Brinsmade¹

¹Department of Biology, Georgetown University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel virülans genler kez transkripsiyon düzeyinde farklı çevresel sinyallere yanıt multipl faktörler tarafından düzenlenmektedir. Bazı faktörler doğrudan virülans genler üzerinde hareket; diğerleri Patogenez aşağı akım düzenleyiciler ifade veya regülatör etkinlik etkileyen sinyalleri birikimi ayarlayarak kontrol. Yönetmelik kapsamlı vitro büyüme sırasında okudu iken, nispeten az nasıl gen ekspresyonu enfeksiyon sırasında ayarlanır bilinir. Belirli gen ürünü terapötik müdahale için bir aday olduğunda böyle önemli bir bilgidir. Transkripsiyon yaklaşımlar gibi nicel, gerçek zamanlı RT-PCR ve RNA-Seq gen ekspresyonu küresel düzeyde incelemek ama bakteriyel RNA ana bilgisayar RNA ve örnek ile karşılaştırıldığında düşük bolluk dahil olmak üzere birçok teknik sorunlar muzdarip için güçlü yolu vardır RNases tarafından bozulması. Floresan gazetecilere kullanarak düzenleme değerlendirmek nispeten kolaydır ve benzersiz spektral özellikleri ile floresan proteinler ile multiplexed. Yöntemi gen ekspresyonu bakteriyel düzenleyici ağları etkileyen karmaşık üç boyutlu mimari ve physiochemical degradeler sergi dokularda tek hücreli, kronolojik zamanmekansal analizine olanak sağlar. Veri toplu Nüfus ortalaması bu tür bilgileri kaybolur. Burada, bakteriyel patojenler içinde in situgen ifadesinde miktarının bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem basit doku işleme ve floresan muhabir proteinler üzerinden doğrudan gözlem dayanır. Biz bu sistem yardımcı programı olan gen ürünü bağışıklık kaçırma ve ex vivo ve içinde vivo tam virülans için gereklidir Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), ifade inceleyerek göstermek. Biz o nük-gfp şiddetle renal apse ifade edilir ve türdeş olmayan gen ekspresyonu nedeniyle kısmen tamamen meşgul bağışıklık yanıtıyla apse nuc organizatörü faaliyete belirgin mekansal düzenleme için ortaya çıkarmak göstermek. Yöntem manipulatable bir genetik sistemi ile herhangi bir bakteri ve preklinik çalışmalar ve ilaç geliştirme için değerli bilgi veren herhangi bir enfeksiyon modeli uygulanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteri differentially adaptasyon ve hayatta kalmak için gerekli genler ifade ederek değişiklik çevreleri beslenme durumu ve fizyolojik şartlarda değişen cevap. Örneğin, fırsatçı patojenler yüzeyler, nispeten düşük yoğunlukları ve çoğu kez zararsız vücut kolonize. Bir kez bakteri fiziksel ve kimyasal bariyerler nüfuz, ancak, bu ana bilgisayar bağışıklık hücre karşı savunma ve sınırlı besin kullanılabilirlik¹ile uğraşmak zorundadır. Örnek olarak, Staphylococcus aureus nüfusun yaklaşık üçte biri asymptomatically colonizes ama aynı zamanda yıkıcı deri ve yumuşak doku enfeksiyonları, osteomiyelit, endokardit ve bakteriyemi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Georgetown Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. nesil floresan muhabir zorlanma

Sırayla EcoRI ve SmaI enzimleri ile genom bütünleştirici pRB4 vektör sindirmek. Üreticinin protokolüne pRB4 1 µg 25 ° C'de kullanarak SmaI ile bir gecede sindirim ayarlayın ve sonra ikinci sindirim 37 ° C'de 1 h için EcoRI reaksiyon karışıma ekleyerek devam. Enzimler için 20 dk 65 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
PCR yükseltmek (içinde thermonuclease [nük] organizatörü bölge içeren bu durumda, bir ~ 350 baz çifti DNA parçası), g....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir muhabir sunabilirsiniz pMAD³² türetilmiş bir plazmid geliştirdiğimiz füzyon yapı tarafından çift crossover Homolog rekombinasyon (Şekil 1) kromozom içine. Kantitatif analiz GFP protein ve arka plan üzerinde floresan sinyal üretimini destekleyen herhangi bir düzenleyici bölgesi için bu yapıyı sağlar. Plazmid ampisilin direnç (Ap^r) bakım ve E. coli yayılmasında confers ve eritromisin direnç (Em^r

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel enfeksiyon hastalıkları antibiyotik direnci belirleyicileri⁴⁶edinimi nedeniyle Dünya çapında bir artan sağlık sorunu vardır. Ana bilgisayar ortamları uyum gelişim ve hayatta kalma sırasında enfeksiyon için gerekli olduğundan, patojen fitness artırmak gen ifade programları hedefleme stratejileri tedavi amaçlı işe yarayabilir. Böyle bir programı bağışıklık kaçırma⁴⁷yılında önemli bir rol oynamak için daha önce gösterilen SaeR/S iki bileşen sistemi (TCS), tarafından.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alexander Horswill P_sarAP1- tdTomato füzyon ve Karen Creswell hediye Akış Sitometresi Analizi ile ilgili yardım için teşekkür ediyoruz. Biz Ayrıca Alyssa King istatistiksel analiz tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen bir NIH Exploratory/gelişim Araştırma Ödülü (grant AI123708) ve SRB fakülte başlangıç fonlar tarafından finanse edildi. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve yorumu veya iş yayını için göndermek için karar herhangi bir rolü yoktu.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 5 koyun kanı	Hardy Teşhis (Santa Maria, CA)	A10
5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid (X-Gal)	ThermoScientific	R0402
Ampisilin	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl / 6 Fareler	Charles Nehri	NA
Kloramfenikol	Sigma-Aldrich	C-0378
konfokal lazer tarama mikroskobu	Zeiss	NA
kriyostat mikrotom	Thermo Scientific	NA
Kültürü, Cap	VWR International	2005-02512
D + 2: 25NA Oligo	Entegre DNA Teknolojileri (Coralville, Iowa)	NA
DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Eritromisin	Sigma-Aldrich	E5389
Akış Analiz Cihazı	Becton Dickinson	NA
cam boncuklar	Sigma	Z273627
Miniprep, plazmid	Promega	A1220
orbital çalkalama su banyosu	New Brunswick Innova	NA
PCR saflaştırma	QIagen	28106
Fosfat Tampon Tuzlu Su (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Plaka okuyucu	Tecan	NA
Precellys 24 homojenizatör	Bertin Laboratuvarları	NA
pUC57-Kan	GenScript (Piscataway, NJ)	NA
Q5 Taq DNA Polimeraz	New England Biolabs (Ipswich, MA)	M0491S
Kısıtlama Enzimleri	Yeni İngiltere Biolabs (Ipswich, MA)	R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Ters transkriptaz	New England BioLabs	E6300L
Sanger Dizileme	Genewiz (Germantown, MD)	NA
Sub Xero berrak doku dondurma ortamı	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus mikroskop slaytları	Fisher Scientific	12-550-15
süper döngü	GE Yaşam Bilimleri 18111382
Şırınga, Filtre	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	Membran kalıcı nükleik asit lekesi
Tetrasiklin	Sigma-Aldrich	T7660
Triptik Soya Suyu	VWR	90000-376
UV-görünür spektrofotometre	Beckman Coulter-DU350	NA
Vectashield Antifade DAPI	Vektör Laboratuvarları	H-1500

ile montaj ortamı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-5....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bacterial Gene Regulation Fluorescent Reporter Assay Confocal Microscopy Flow Cytometry Staphylococcus aureus Tissue Sectioning Fluorescence Intensity Measurement Spatial Gene Expression In Situ Analysis GFP Fusion Protein

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler