Yöntem makalesi

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

DOI:

10.3791/59055

⸱

19 Şubat 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel virülans genler kez transkripsiyon düzeyinde farklı çevresel sinyallere yanıt multipl faktörler tarafından düzenlenmektedir. Bazı faktörler doğrudan virülans genler üzerinde hareket; diğerleri Patogenez aşağı akım düzenleyiciler ifade veya regülatör etkinlik etkileyen sinyalleri birikimi ayarlayarak kontrol. Yönetmelik kapsamlı vitro büyüme sırasında okudu iken, nispeten az nasıl gen ekspresyonu enfeksiyon sırasında ayarlanır bilinir. Belirli gen ürünü terapötik müdahale için bir aday olduğunda böyle önemli bir bilgidir. Transkripsiyon yaklaşımlar gibi nicel, gerçek zamanlı RT-PCR ve RNA-Seq gen ekspresyonu küresel düzeyde incelemek ama bakteriyel RNA ana bilgisayar RNA ve örnek ile karşılaştırıldığında düşük bolluk dahil olmak üzere birçok teknik sorunlar muzdarip için güçlü yolu vardır RNases tarafından bozulması. Floresan gazetecilere kullanarak düzenleme değerlendirmek nispeten kolaydır ve benzersiz spektral özellikleri ile floresan proteinler ile multiplexed. Yöntemi gen ekspresyonu bakteriyel düzenleyici ağları etkileyen karmaşık üç boyutlu mimari ve physiochemical degradeler sergi dokularda tek hücreli, kronolojik zamanmekansal analizine olanak sağlar. Veri toplu Nüfus ortalaması bu tür bilgileri kaybolur. Burada, bakteriyel patojenler içinde in situgen ifadesinde miktarının bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem basit doku işleme ve floresan muhabir proteinler üzerinden doğrudan gözlem dayanır. Biz bu sistem yardımcı programı olan gen ürünü bağışıklık kaçırma ve ex vivo ve içinde vivo tam virülans için gereklidir Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), ifade inceleyerek göstermek. Biz o nük-gfp şiddetle renal apse ifade edilir ve türdeş olmayan gen ekspresyonu nedeniyle kısmen tamamen meşgul bağışıklık yanıtıyla apse nuc organizatörü faaliyete belirgin mekansal düzenleme için ortaya çıkarmak göstermek. Yöntem manipulatable bir genetik sistemi ile herhangi bir bakteri ve preklinik çalışmalar ve ilaç geliştirme için değerli bilgi veren herhangi bir enfeksiyon modeli uygulanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteri differentially adaptasyon ve hayatta kalmak için gerekli genler ifade ederek değişiklik çevreleri beslenme durumu ve fizyolojik şartlarda değişen cevap. Örneğin, fırsatçı patojenler yüzeyler, nispeten düşük yoğunlukları ve çoğu kez zararsız vücut kolonize. Bir kez bakteri fiziksel ve kimyasal bariyerler nüfuz, ancak, bu ana bilgisayar bağışıklık hücre karşı savunma ve sınırlı besin kullanılabilirlik1ile uğraşmak zorundadır. Örnek olarak, Staphylococcus aureus nüfusun yaklaşık üçte biri asymptomatically colonizes ama aynı zamanda yıkıcı deri ve yumuşak doku enfeksiyonları, osteomiyelit, endokardit ve bakteriyemi2nedeni. S. aureus bir patojen olarak başarısı kez metabolik olarak esneklik yanı sıra kan dolaşımına kaçmak ve periferik dokularda çoğaltmak bakteri etkinleştirmek yüzey ilişkili ve salgılanan virülans faktörleri bir cephanelik atfedilir 3,4,5. Stafilokokal hastalığı nedeniyle ana ölüm bir evrimsel çıkmaz ve yeni ev sahibi6sınırları iletim olduğundan, virülans faktörü üretime bağlılık dikkatle denetlenmelidir.

Karmaşık bir düzenleyici ağı kodlamayan RNA'ların yanıt için a değişiklik-in çevre uyaranlara ve proteinler de dahil olmak üzere hücre yoğunluğu, büyüme aşaması, nötrofil ilişkili faktörler ve besin durumu virülans genler, ifade edilir emin olmak için kesin zaman ve yer içinde ana bilgisayar doku7,8,9,10,11,12,13. Örneğin, SaeR/S iki bileşen sistemi (TCS) sensör kinaz (SaeS) ve yanıt regülatörü (SaeR)14üzerinden birkaç virülans faktörleri ifade düzenlemektedir. SaeS autophosphorylated ana bilgisayar sinyalleri (örneğin, insan nötrofil peptidler [HNPs], calprotectin)8,15,16yanıt olarak korunmuş histidin kalıntısı üzerinde olduğunu. Phosphoryl grubu sonra SaeR, harekete geçirmek o DNA'ya bağlanıcı protein üzerinde bir aspartat kalıntı aktarılır (SaeR ~ P)17. SaeR/S TCS fibronektin proteinler (FnBPs), leukocidins ve koagülaz14,18,19,20gibi patogenezinde katkıda 20'den fazla gen düzenlemektedir. Hedefleri SaeR düzeyi olarak indüklenen olasılığı yüksek benzeşme ve düşük-benzeşme gen hedefleri içine gizli ~ P onun ipuçlarını21' e maruz kaldığında yükselir. SaeR/S etkinlik gen ekspresyonu Agr çekirdek algılama sistemi gibi diğer düzenleyiciler, önleyici toksinler protein (Rot) ve alternatif sigma faktörü B (SigB)22,23,24tarafından kontrol edilir.

nuc Staphylococcus aureus bir Sae-bağımlı virülans gen ve thermonuclease (Nuc), neutrophilic extracellular trap (ağlar) kaçan ve dağıtımı sırasında için gerekli olan kodlar Tabii ki enfeksiyon25,26. Nuc ifade tarafından CodY dallı zincirli amino asitler ve GTP27varlığında da şiddetle dolaylı olarak bastırılmış ve doğrudan Stafilokokal aksesuar regülatör protein SarA28,29 tarafından bastırılmış , olan faaliyet oksijen (redoks devlet) ve pH30tarafından etkiledi. SAE ve nuc mutantlar enfeksiyon fare modellerinde zayıflatılmış verilen bu, onların ilgili etkinlikleri26,31inhibe kimyasal müdahaleler gelişmekte olan ilgi olduğunu. Buna rağmen onların düzenleme sırasında enfeksiyon ile ilgili hiçbir bilgi yoktur.

Floresan gazetecilere Gen ifadesinin tek hücre düzeyinde ölçmek ve izlemek için kullanılmaktadır. Burada, biz Smiktarının bir yöntem mevcut. aureus gen ekspresyonu enfeksiyon sırasında ne zaman çifte ile tüp bebek transcriptome Analizi ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve manyetik rezonans spektroskopi (MRS), gibi güçlü görüntüleme teknikleri ortaya nasıl bakteriyel Fizyoloji vivo ve belirli niş içinde besin göreli zenginliği düzenlenmiştir. Yöntem bakteriyel herhangi bir patojen uysal bir genetik sistemi ile uygulanabilir.

Genom bütünleştirici vektör genel bakış.

Genom bütünleştirici vektör pRB4 500 baz çifti her S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene Homolog rekombinasyon kolaylaştırmak için akış yukarı ve aşağı akım bölgelerinden içerir. pRB4 eritromisin direnç kaset (ermC) ve opsonins beta galaktozidaz gen bgaB mavi/beyaz tarama rekombinasyonlar32içeren sıcaklığa duyarlı pMAD vektör omurga türetilir. Mühendislik muhabir yapı da seçimden sonra genom entegrasyon ve plazmid eleme yanı sıra ilgi superfolder yeşil düzenleyici bölgesi sigorta için EcoRI ve SmaI siteleri için kloramfenikol direnç işaretçisi (kedi) içeren Floresan protein (sGFP) (Şekil 1). Seçtiğiniz ribozom bağlama Makinası (KÇY) bir muhabir aktivitesini etkiler ve ampirik optimizasyonu33kez gerektirir bilinir. Böylece, bir KÇY sağlanan. Burada, yerel ribozom bağlama sitesi gen ekspresyonu daha doğal bir desen için sağlamak için kullanılır, ancak diğer sitelerde kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Georgetown Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. nesil floresan muhabir zorlanma

  1. Sırayla EcoRI ve SmaI enzimleri ile genom bütünleştirici pRB4 vektör sindirmek. Üreticinin protokolüne pRB4 1 µg 25 ° C'de kullanarak SmaI ile bir gecede sindirim ayarlayın ve sonra ikinci sindirim 37 ° C'de 1 h için EcoRI reaksiyon karışıma ekleyerek devam. Enzimler için 20 dk 65 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
  2. PCR yükseltmek (içinde thermonuclease [nük] organizatörü bölge içeren bu durumda, bir ~ 350 baz çifti DNA parçası), genomik DNA dan ilgi Düzenleyici bölge 5' EcoRI kısıtlama sitesi ve 3' SmaI kısıtlama sitesi ekleme. Çerçeve SmaI tanıma sıra olmalıdır translasyonel başlama kodonu ile. Bu çalışmada, bir yüksek-sadakat DNA polimeraz üreticinin önerilerini göre ileri astar oRB015 ile kullanarak PCR gerçekleştirildi (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') ve ters astar oRB016 () 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). Tavlama sıcaklığı 53 ° C. yapıldı. Üreticinin yönergelerini izleyerek bir PCR temizlik kiti kullanılarak elde edilen parça arındırmak.
  3. Elde edilen PCR ürün EcoRI ve 1.1 adımda gerçekleştirilen gibi SmaI sindirmek ve sindirilmiş DNA parçası sitelere T4 DNA ligaz üretici tarafından önerilen gibi bütünleştirici yapı oluşturmak için aynı pRB4, ligate. E. coli tüp ligasyonu karışımı tanıtmak ve yapı sırasını doğrulayın.
  4. Electroporate yapı S. aureus zorlanma RN4220 içine daha önce34açıklandığı gibi. Kısacası, plazmid 1 µg elektro-yetkili hücreleri 70 µL ile kullanın (100 Ω, 25 µF ve 2.3 kV) B2 suyu (%1 [w/v] kazein hidrolizat, %2.5 [w/v] maya ekstresi, %2.5 [w/v] NaCl, %0,1 [w/v] K2PO4, %0,5 [w/v] glikoz) içinde. Eritromisin direnç (Emr), eritromisin (5 µg mL-1) ve 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 µg mL-1) ile tryptic soya agar (TSA) üzerinde keyfi sıcaklığında (30 ° C) seçin. Plazmid kodlanmış β-galaktozidaz etkinliği nedeniyle ortaya çıkan transformants mavidir.
    Not: DNA'ın transfer klinik yalıtır içine nedeniyle bir güçlü kısıtlama-değişiklik bariyer35son derece zordur. Böylece, çünkü bu kısıtlama eksik ve son derece transformable S. aureus RN4220 füzyon yapı ara bir alıcı olarak kullanıldı.
  5. Plazmid S. aureus USA300 zorlanma Elektroporasyon ya da iletim faj-aracılı36 keyfi sıcaklığında kullanarak ilgi aktarın. Kısacası, parçacıklar üzerinde 5 mM CaCl2 içeren TSA plakaları kullanarak donör zorlanma 30 ° C'de bir gecede ve bir 0,45 µM selüloz asetat şırınga filtreden filtrasyon tarafından sterilize Φ11 bakteriyofaj yaymak. S. aureus zorlanma LAC Emriçin transduce için Lysates kullanın.
    Not: LAC daha önce Em tarafından seri Emr 37,38confers yerli plazmid pUSA03 suşu tedavi için tekerlekli sandalye basketbolu orta pasajda hassas yapıldı yaygın olarak kullanılan bir klinik izole olduğunu.
  6. Yapı iki, art arda gelen Homolog rekombinasyon olaya32daha önce açıklandığı gibi kromozom entegre. Rekombinasyonlar kloramfenikol, eritromisin duyarlı (Erms) ve hiçbir uzun mavi kloramfenikol dayanıklı (Cmr) 5 μg mL-1 içeren TSA plakaları vardır.
    Not: mümkün olduğunda, tüp bebek zorlanma geçit39 ve sıcaklık vardiya ile ilişkili mutasyonların birikimi önlemek için iletim faj-aracılı ile USA300 içine füzyon işaretli yeniden tanıtmak.

2. hayvan enfeksiyon: Hazırlık Inoculum, sistemik enfeksiyon ve doku işleme

  1. Bakteriyel inoculum hazırlanması
    1. S. aureus suşları yalıtım için ilgi kan agar tabaklarda donmuş gliserol stoktan çizgi. 16-24 h 37 ° C'de hemolitik fenotipleri kırmızı kan hücreleri (RBCs) koşullar onların becerisi ilgili ve formu temizlemek şeffaf bölgeleri onaylamak için kuluçkaya.
    2. Gecede kültürler her baskı 4 ml steril cam tüpler tryptic soya suyu (TSB) tek kolonileri aşı başlatın. 16-24 h yaklaşık 70 ° açı ve [d/d] dakikada 70 dönüşler ayarlamak bir tüp rulo olarak 37 ° C'de tüpler döndürün.
    3. 600 optik yoğunluk ölçmek için bir spektrofotometre kullanın nm (OD600) adım 2.1.2 kültürlerin. Steril Orta (boş) bir optik başvuru olarak kullanın. Bu hücreler olarak 0,05 25 mL ayrı Tryptic soya suyu (TSB) Steril, OD600 sulandırmak, 125 mL şişe (5:1 şişe hacim oranı için) DeLong ve bir su banyosu (için kültürlere uygun ısı transferi), kültürde kuluçkaya 280 RPM'de sallayarak ve 37 ° C'ye ayarla
      Not: İnoculum büyüme çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir; hücreleri üssel faz için büyüyen bir yöntem sunulur. Ne olursa olsun, sürekli olarak hücreleri aşılama için hazırlamak için aynı yöntemi kullanmak önemlidir.
    4. Bir OD600 ~ 1, hücreleri içine taze bir başlangıç OD600 hücreleri üssel faz ulaşmak ve gecede kuluçka sırasında birikir faktörler üssel faz seviyelere düşürülmüştür var emin olmak için 0,05 ortamına yeniden sulandırmak.
    5. Hücreleri üssel faz (OD600 ~0.6–0.8) sırasında 3000 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de centrifuging tarafından hasat.
    6. Granül iki kez steril 1 fosfat tamponlu tuz (PBS; pH 7,4) x eşdeğer hacmi yıkayın.
    7. 1 x 1 x 108 koloni birimleri (CFUs) mL-1 oluşturan bir konsantrasyon (pH 7,4) PBS'ye hücrelerde askıya alma veya istenen uygun olarak deneme.
      Not: hücre boyutu ve şekli zorlanma bağlı değişikliklere ışık saçılma özellikleri etkileyebilir çünkü OD600 ve CFU mL-1 faiz her tür için arasındaki ilişkiyi belirlemek önemlidir ve sonuçta, enfeksiyon doz.
  2. Hayvanlar ve bakteriyel enfeksiyon hazırlanması
    1. Saf diyet AIN-93 7 gün için fareler alışmana. Diyet doku auto-floresan standart fare chow40içinde kullanılan bitkisel kökenli malzemeler tüketimi ile ilişkili azaltırken yeterli beslenme sağlamak için formüle edilmiştir.
      Not: Kadın C57/BL6 fareler (6-8 haftalık) burada kullanılır, ancak fare zorlanma ve seks üzerine çalışma bağlı olacaktır.
    2. Enfeksiyon önce ılık su ile fare kuyruğu damarlar dilate.
    3. Hayvanlar bakteriyel inoculum sistemik enfeksiyon üretmek için kuyruk-damarlar yoluyla enjekte ederek 100 µL tarafından bulaştırmak. Akış Sitometresi gerçekleştirme ilk inoculum bir aliquot kaydedin (bkz. Bölüm 4).
    4. Hayvanlar her gün izlemek ve gözden geçirilmiş ve bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir izleme sistemi kullanarak onların sağlık durumunu değerlendirmek.
    5. İlerleme için enfeksiyon istenen süresi için izin vermek. Burada, deneyler sona erdirilen 3 gün sonrası enfeksiyon vardır.
      Not: Bu koşullar altında fibrin mevduat tarafından alınmış ve bağışıklık hücreleri5,41eşmerkezli katman tarafından çevrili bakteri, Stafilokokal apse topluluğu apseler oluşur.
  3. Organ ve doku işleme hasat
    1. CO2 inhalasyon ve servikal çıkık bir ikincil Yöntem olarak hayvanlara ötenazi ve Nekropsi gerçekleştirin.
    2. Hasat böbrek (sağda) ve diğer hayati organlara (kalp, karaciğer, akciğer, dalak) ve % 10 [v/v] arabelleğe alınmış formalin içeren 15 mL polipropilen tüpler içine aktarın. Bu organların 2.3.4 aşağıdaki adım ile devam edin.
    3. Sol böbrek ~ 500 µL 2 mm silis boncuk ve 1 mL steril 1 x PBS (pH 7,4) içeren steril 2 mL darbeye dayanıklı boru için transfer. Bu organ ile 4.2 adıma geçin.
    4. Organ adım 2.3.2 nazik sallayarak veya dönüş için en az 24 saat ama 48 saatten fazla oda sıcaklığında karanlıkta düzeltmek için izin verir.
    5. Organları orta buz gibi açık dokusunda katıştırmak ve dokulara-80 ° C'de depolayın
    6. Bir cryostat, Bölüm doku 10 µm kalınlığında dilimler halinde kullanarak.
    7. 20 dk için önceden temizlenmiş, şarj edilmiş cam slayt üzerindeki bölümler karanlıkta kuru, sabit montaj orta ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) leke, uygulamak ve coverslip uygulayın. Oda sıcaklığında bağlı slaytlar gecede tedavi ve uzun süreli depolama için 4 ° c aktarın.

3. lazer Confocal mikroskobu tarama ve görüntü işleme

  1. Lezyonlar lazerler kullanılmakta floresan muhabir için uygun kullanarak bulmak için takılı slaytları inceleyin. Bu durumda, yeşil (GFP), kırmızı (tdTomato) ve mavi (DAPI) Floresan içinde sinyalleri kullanılır.
  2. Tek tek hücreleri görüntülenmesi için uygun amaç kullanarak görüntüyü elde etmek (örneğin, genellikle 20 x veya 40 x hedefleri kullanılır).
  3. Floresans yoğunluklarını confocal görüntüleri ölçmek.
    1. Confocal görüntü içinde görüntü J açın ve düzgün görselleştirmek lezyon floresans sinyalinin için Parlaklık/kontrast ayarlamak.
    2. İlgi ve eşik seçeneğini kullanarak bölgesi tanımlamak, floresans alt ve üst sınırları gerektiği gibi ayarlayın.
    3. Centroid seçerek belirleyin alan → ortalama gri değeri → Centroid → sınırlamak için eşik görüntü J. çözümlemek etiket altında
    4. Centroid floresans yoğunluk değeri ayıklamak için veya GFP ve tdTomato için verilen bir lezyon birim alan (ortalama floresans yoğunluğu, MFI) başına ortalama floresans şiddeti ölçmek. Burada, bir µm2 alanlarında kullanıldı.
      Not: Örnek kimliğini bilindiğinde önyargı kör bir ikinci analiz en aza indirir.
    5. Verileri çizmek ve uygun istatistiksel analizler için her karşılaştırma gerçekleştirir.

4. Akış Sitometresi Analizi

  1. (İsteğe bağlı) Enfeksiyon (2.2.3 bölümünden) günü inoculum füzyon etkinliğini belirlemek
    1. 1 x 899 µL için steril PBS (pH 7,4) her inoculum 100 µL ekleyin ve 1 µL membran permeant nükleik asit leke ( Tablo malzemelerigörmek). Bir denetim olarak, nükleik asit leke eksik bir örnek eklediğinizden emin olun.
    2. Akış Sitometresi tüm örnekleri üzerinde gerçekleştirin.
      Not: İlk deneme için bir vektör tek denetimini kullanmak için uygun voltaj belirlemek için faiz füzyon için eklemek yararlıdır. Pozitif ve negatif örnekleri arasında net bir ayrım veri analizi için esastır muhabir gösteren de arka plan sinyaldir.
    3. Bakteriyel nüfusu tanımlamak için nükleik asit leke (y ekseni) kullanarak olayları arsa ve dağılım (x ekseni) iletmek.
    4. Bir içerme kapı her iki nükleik asit leke olumlu olaylar ve bakteri ( S. aureusiçin 0.5-2.0 µm arasında) ileri dağılım göre doğru boyutunu çizin.
      Not: Bu nüfus olayları açıkça bu parametreleri içerecek şekilde kritik olarak tanımlarken titiz olmak. Bu kapının diğer koşullar altında negatif denetimler için tüm olayları hariç emin olun. Bu çalışmada, yaklaşık % 70 hücre nüfus araya geldi bu gereksinimleri analiz.
  2. Kurban sonra doku örnekleri analiz:
    1. Hayvanlara ötenazi, (bkz: adım 2.3) sol böbrek hasat ve transfer boncuk atan içine tüpler içeren 1 mL steril PBS (pH 7,4) x 1 ve 2 mm borosilikat boncuk 250 µL.
    2. Bakteri hücreleri serbest bırakmak için doku bozabilir. Böbrek için hücreleri bozmaya bir homogenizer kullanın. Burada, üç 30 s patlamaları 1dk dönemlere ilişkin döngüleri arasında ıslak buz soğutma ile 6800 rpm Isıtma örnekleri en aza indirmek için kullanılmıştır.
    3. 250 x g masa üstü microcentrifuge 3 dk için de centrifuging tarafından büyük doku enkaz 4 ° C'ye soğutmalı Pelet
      Not: Genellikle, bir hücre Pelet tüp ve yüzen enkaz üst tabakası altındaki olur. Orta sulu tabaka bakteri hücreleri içerir.
    4. PBS 989 µL nükleik asit leke 1 µL içeren bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine sulu katmandan 10 µL transfer (Toplam birim 1 mL).
    5. Aynı veri toplama parametrelerini kullanarak ve ilk inocula gelince çoğunluğuna akış sitometresi gerçekleştirin.
      Not: Örnek esas olarak doku enkaz içerdiğinden bakteriyel hücre sayısı çok düşük olacaktır. Uygulamaya veri yüklendiğinde nükleik asit leke olumlu ve boyutu geçitli hücreler varsa "Canlı kapısı" seçeneği de kullanılabilir. Bu da hedef olayların daha fazla analiz ve dosya boyutunu azaltmak için yardımcı olacaktır. Yaklaşık bir milyon olayları örnek başına sayılır, ama daha fazla olay sayar enfeksiyonun şiddeti ve analiz doku boyutunu bağlı olarak gerekli olabilir.
    6. Veri Analizi: Belirlemek için her fluorophore verilen örnek 4.1.4 bölümünde belirlenen dahil kapıları kullanarak bir floresan yoğunluğu (MFI) demek. Akış Analizi yazılım gerek olay örneklerinde normalleştirmek. 10.000 adet Analize genellikle yeterlidir.
      Not: Bu olay sayısı daha az bu apse oluşumu ve enfeksiyon şiddetine bağlıdır beri içeren örnekler bulmak için nadir değildir. Bu yaklaşım, 500-40,000 kullanarak olayları genellikle enfekte dokusunda bulunur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir muhabir sunabilirsiniz pMAD32 türetilmiş bir plazmid geliştirdiğimiz füzyon yapı tarafından çift crossover Homolog rekombinasyon (Şekil 1) kromozom içine. Kantitatif analiz GFP protein ve arka plan üzerinde floresan sinyal üretimini destekleyen herhangi bir düzenleyici bölgesi için bu yapıyı sağlar. Plazmid ampisilin direnç (Apr) bakım ve E. coli yayılmasında confers ve eritromisin direnç (Emr

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel enfeksiyon hastalıkları antibiyotik direnci belirleyicileri46edinimi nedeniyle Dünya çapında bir artan sağlık sorunu vardır. Ana bilgisayar ortamları uyum gelişim ve hayatta kalma sırasında enfeksiyon için gerekli olduğundan, patojen fitness artırmak gen ifade programları hedefleme stratejileri tedavi amaçlı işe yarayabilir. Böyle bir programı bağışıklık kaçırma47yılında önemli bir rol oynamak için daha önce gösterilen SaeR/S iki bileşen sistemi (TCS), tarafından...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alexander Horswill PsarAP1- tdTomato füzyon ve Karen Creswell hediye Akış Sitometresi Analizi ile ilgili yardım için teşekkür ediyoruz. Biz Ayrıca Alyssa King istatistiksel analiz tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen bir NIH Exploratory/gelişim Araştırma Ödülü (grant AI123708) ve SRB fakülte başlangıç fonlar tarafından finanse edildi. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve yorumu veya iş yayını için göndermek için karar herhangi bir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 5 koyun kanıHardy Teşhis (Santa Maria, CA)A10
5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid (X-Gal)ThermoScientificR0402
AmpisilinFisher ScientificBP1760-25
C57Bl / 6 FarelerCharles NehriNA
KloramfenikolSigma-AldrichC-0378
konfokal lazer tarama mikroskobuZeissNA
kriyostat mikrotomThermo ScientificNA
Kültürü, CapVWR International2005-02512
D + 2: 25NA OligoEntegre DNA Teknolojileri (Coralville, Iowa)NA
DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
EritromisinSigma-AldrichE5389
Akış Analiz CihazıBecton DickinsonNA
cam boncuklarSigmaZ273627
Miniprep, plazmidPromegaA1220
orbital çalkalama su banyosuNew Brunswick InnovaNA
PCR saflaştırmaQIagen28106
Fosfat Tampon Tuzlu Su (PBS)Cellgrow46-013-CM
Plaka okuyucuTecanNA
Precellys 24 homojenizatörBertin LaboratuvarlarıNA
pUC57-KanGenScript (Piscataway, NJ)NA
Q5 Taq DNA PolimerazNew England Biolabs (Ipswich, MA)M0491S
Kısıtlama EnzimleriYeni İngiltere Biolabs (Ipswich, MA)R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Ters transkriptazNew England BioLabsE6300L
Sanger DizilemeGenewiz (Germantown, MD)NA
Sub Xero berrak doku dondurma ortamıMercedes MedicalMER5000
Superfrost Plus mikroskop slaytlarıFisher Scientific12-550-15
süper döngüGE Yaşam Bilimleri 18111382
Şırınga, FiltreVWR International28145-481
Syto 40Thermo Fisher ScientificS11351Membran kalıcı nükleik asit lekesi
TetrasiklinSigma-AldrichT7660
Triptik Soya SuyuVWR90000-376
UV-görünür spektrofotometreBeckman Coulter-DU350NA
Vectashield Antifade DAPIVektör LaboratuvarlarıH-1500
ile montaj ortamı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907(2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818(2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81(2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026(2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714(2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521(2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49(2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146(2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296(2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463(2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370(2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361(2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fluorescent Reporter AssayConfocal MicroscopyFlow CytometryStaphylococcus aureusTissue SectioningFluorescence Intensity MeasurementSpatial Gene ExpressionIn Situ AnalysisGFP Fusion Protein

İlgili makaleler