Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

9.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59079

⸱

23 Mart 2020

 ,  , 
1Proteomics Center, Erasmus University Medical Center

Bu makalede

Özet

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Özet

Proteinlerin küçük protein ubiquitin tarafından posttranslational modifikasyonu birçok hücresel olaylarda yer almaktadır. Her yerde bulunan proteinlerin triptik sindiriminden sonra, lisin epsilon amino grubuna konjuge bir diglycine kalıntısı olan peptidler ('K-ε-diglycine' veya sadece 'diGly') orijinal modifikasyon bölgesini izlemek için kullanılabilir. Kitle spektrometresi ile hassas algılama ile birlikte diGly peptidlerin etkin immünpurifikasyonu, bugüne kadar tanımlanan ubikitinasyon bölgelerinin sayısında büyük bir artışa yol açmıştır. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Ayrıca, antikor boncukları korumak için filtre tabanlı bir fiş kullanarak numunenin daha verimli temizlenmesi, diGly peptidler için daha fazla özgüllük sağlar. Bu gelişmeler, hücrede proteozom inhibisyonu üzerine insan servikal kanser hücrelerinden 23.000'den fazla diGly peptidin rutin tespiti ile sonuçlanır (HeLa) hücre lisatları. Bu stratejinin etkinliğini, birkaç farklı hücre tipinin ve beyin dokusu gibi in vivo örneklerinin ubiquitinome profillerinin derinlemesine analizi için gösteriyoruz. Bu çalışma derin hücresel ubiquitinome ortaya çıkarmak için protein ubiquitination analizi için araç kutusuna orijinal bir ek sunuyor.

Giriş

Proteinlere ubiquitin konjugasyonu proteozom tarafından bozulması için onları işaretler ve proteostaz önemli bir süreçtir. Ubikitin C-terminal karboksil grubu hedef protein1,,2lizin ε-amino grubu ile bir izopeptid bağ oluşturur. Buna ek olarak, ubikitin diğer ubikitin modülleri eklenebilir, homojen oluşumu ile sonuçlanan (yani, K48 veya K11) veya dallı (yani, heterojen veya karışık) poliubiquitin yapılar1,3. Ubiquitin en iyi bilinen fonksiyonu proteazomal bozulma rolüdür, K48 bağlı poliubiquitin aracılık. Ancak, hem mono-hem de poliubiquitination da proteozom tarafından bozulmabağımsız birçok süreçte rol oynadığı açık hale gelmiştir. Örneğin, K63 bağlı zincirleri hücre içi ticareti, lizomal bozulma, kinaz sinyalizasyonu ve DNA hasar yanıtı4,,5nondegradative rolleri var. Diğer altı bağlantı türleri daha az bol ve rolleri hala büyük ölçüde esrarengiz, hücredeki işlevleri hakkında ilk göstergeler ortaya çıkıyor olsa da, büyük ölçüde bağlantı-özel algılama sağlamak için yeni araçların geliştirilmesi nedeniyle6,7.

Kütle spektrometresi proteom analizleri için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir ve günümüzde hemen hemen her biyolojik kaynaktan binlerce farklı protein tek bir deneyde tespit edilebilir. Protein aktivitesini modüle edebilen proteinlerin (örn. fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon ve her yerde) posttranslational modifikasyonları (PtM'ler) ile ek bir karmaşıklık tabakası sunulur. PTM taşıyan proteinlerin büyük ölçekli tanımlanması da kütle spektrometresi alanındaki gelişmelerle mümkün olmuştur. PBM'leri taşıyan peptidlerin, değiştirilmemiş muadillerine göre nispeten düşük stoiyometrisi teknik bir zorluk teşkil eder ve kütle spektrometresi analizi öncesinde biyokimyasal zenginleştirme adımları genellikle gereklidir. Son yirmi yılda, PTM'lerin analizi için birkaç farklı özel zenginleştirme yöntemi geliştirilmiştir.

Hücrede protein ubiquitination çok yönlü rolleri nedeniyle, proteinler üzerinde ubikitinasyon sitelerinin tespiti için analitik yöntemlerin geliştirilmesi için büyük bir talep var8. Kütle spektrometrik yöntemlerin uygulanması meyve sinek, fare, insan ve maya proteinleri9,10,,11,12,13,14tanımlanan ubiquitination sitelerin in sayısının bir patlamaya yol açmıştır . K-ε-GG kalıntısı motifine (ayrıca 'diglycine' veya 'diGly' olarak da adlandırılır) karşı yönlendirilmiş antikorlar kullanılarak peptid düzeyinde immünopreprezet bazlı zenginleştirme stratejilerinin geliştirilmesi ile önemli bir adım sunulmuştur. Bu diGly peptidler proteazolaraktripsin kullanarak her yerde proteinlerin sindirim üzerine üretilir15 ,16.

Burada, orbitrap kütle spektrometresi tarafından immünpurifikasyon ve sonraki tespiti kullanarak diGly peptidler için zenginleştirmek için optimize edilmiş bir iş akışı saiyoruz. Özellikle numune hazırlama ve kütle spektrometresi aşamalarında mevcut iş akışlarının çeşitli değişikliklerinin bir kombinasyonunu kullanarak, proteozom ile tedavi edilen Tek Bir HeLa hücresi örneğinden rutin olarak 23.000'den fazla diGly peptid tespit edebiliriz. inhibitörü ve tedavi edilmeyen HeLa hücrelerinden ~ 10.000. Bu protokolü, hücre kültüründe (SILAC) etiketli amino asitlerle etiketsiz ve kararlı izotop etiketlemeden gelen lysatlara ve beyin dokusu gibi endojen örneklere uyguladık.

Bu iş akışı, derin ubiquitinome ortaya çıkarmak için her yerde analiz için araçların repertuar değerli bir ek sunuyor. Aşağıdaki protokol, iş akışının tüm adımlarını ayrıntılı olarak açıklar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Erasmus MC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (EDC) tarafından onaylanmıştır.

1. Örnek hazırlama

  1. Kültürlü hücreler
    1. İlgi çekici bir hücre hattı (örneğin, HeLa veya osteosarkom [U2OS] hücreleri) seçin ve Dulbecco'nun Minimal Eagle Medium (DMEM) hücreleri% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) ve 100 adet/ mL penisilin / streptomisin ile takviye hücreleri büyümek.
    2. Kantitatif proteomik deneyler için, DMEM kültür hücreleri arginin ve lizin yoksun. Ortam %10 diyalizfetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 100 ünite/mL penisilin/streptomisin ve alanin-glutamin ile desteklenmelidir. Konvansiyonel lizin ve arginin ('Işık' Orta) veya lizin-8(13C6; 15N2) ve arginin-10 (13C6; 15N4) ('Ağır' Orta), sırasıyla.
    3. Heavy Medium kültüründeki tüm proteinlerin ağır kararlı izotop içeren olarak etiketlenmelerini sağlamak için genişleme ve tedaviden önce en az altı katlama için Light Medium (yani etiketlenmemiş) ve Heavy Medium (yani etiketlenmemiş) ve Heavy Medium'daki hücrelerin kültür toplu lukları amino asitler.
    4. Hücreleri 8 saat boyunca 10 μM proteozomib veya eşdeğer bir DMSO hacmi ile sahte bir tedavi olarak tedavi edin. Hücreleri PBS ile yıkayın, %1 tripsin/EDTA kullanarak ayırın ve hücreleri peletleyin.
    5. Hücre peletini bir 150 cm2 kültür plakasından 2 mL buz gibi 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) ve %0,5 sodyum deoksikoilat (DOC) test edin. Lysat'ı 95 °C'de 5 dakika kaynatın ve 10 dakika sonicate (Malzeme Tablosundalistelenen sonicator için "H" ayarı) 4 °C'de kaynatın. N-etilmaleimid (NEM) gibi deubiquitinaz inhibitörlerinin kullanılmasını önermiyoruz, çünkü bu peptit tanımlamasını zorlaştırabilecek istenmeyen protein modifikasyonlarına neden olabilir.
  2. In vivo fare beyin dokusu
    1. In vivo doku kullanırken, 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 12 mM sodyum DOC ve 12 mM sodyum N-lauroylsarcosinate17içeren buz gibi bir tampon doku lyse . 4 °C'de 10 dakika (Malzeme Tablosundalistelenen sonicator için "H" ayarı) için lysate'yi sonicate edin ve 95 °C'de 5 dakika kaynatın.
  3. Kolorimetrik absorbe BCA protein teşp kiti kullanarak toplam protein miktarını hesaplatın. Başarılı bir diGly peptid immünopresipitendivarı (IP) için toplam protein miktarı en az birkaç miligram olmalıdır. SILAC deneyleri için, hafif ve ağır etiketli proteinler toplam protein miktarına göre 1:1 oranında karıştırılır.
  4. 5m 1,4-dithiothreitol kullanarak tüm proteinleri 50 °C'de 30 dakika boyunca azaltın ve daha sonra karanlıkta 15 dakika boyunca 10 mM iyodoacetamid ile alkilleyin. Protein sindirimini Lys-C (1:200 enzim-substrat oranı) ile 4 saat boyunca, ardından 30 °C'de veya oda sıcaklığında (RT) tripsin (1:50 enzim-substrat oranı) ile gece sindirimini gerçekleştirin.
  5. Sindirilmiş numuneye trifloroasetik asit (TFA) ekleyin ve tüm deterjanları çökeltmek ve çıkarmak için numuneyi 10.000 x g'de 10.000 x g olarak santrifüj edin. Sonraki fraksiyonu için peptidler içeren supernatant toplamak.

2. Çevrimdışı peptid fraksiyonu

  1. Triptik peptidleri fraksiyonetmek için boş bir sütun kartuşuna yüklenen polimerik sabit faz malzemesiyle (300 Å, 50 μM; bkz. Malzeme Tablosu)yüklü yüksek pH ters faz (RP) C18 kromatografisi kullanın. Sabit faz yatak boyutu kesirli olması için protein sindirimi miktarına ayarlanmalıdır. ~10 mg protein sindirimi için 0,5 g sabit faz malzemesi ile doldurulmuş boş bir 6 mL sütun kartuşu hazırlayın (Bkz. Malzeme Tablosu). Protein sindirimi nin sabit faz oranı yaklaşık 1:50 (w/w) olmalıdır.
  2. Peptitleri hazırlanan kolona yükleyin ve kolon %0,1 TFA'nın yaklaşık 10 sütun hacmi yle yıkayın ve ardından yaklaşık 10 sütun hacmi H2O'yu takip edin.
  3. Peptitleri sırasıyla %7, %13,5 ve %50 asetonitril (AcN) ile 10 mM amonyum formatı çözeltisi (pH = 10) olmak üzere 10 sütun hacmine sahip üç fraksiyona ayırın. Tamlığa tüm kesirleri lyophilize.
  4. DiGly peptidlerin immünzenginleştirilmesi için protein a agarose boncuklar konjuge ubiquitin kalıntı motifi (K-ε-GG) antikorları kullanın. Boncuk toplu başına antikor tam miktarı tescilli bilgi ve üretici tarafından açıklanmadığından, karışıklık önlemek için üretici yaptığı gibi boncuk bir toplu için aynı tanımı kullanılması tavsiye edilir. Bu boncuklardan bir parti 2x PBS ile yıkayın ve boncuk bulamacını altı eşit kesire bölün. Ayrıntılı bir deneysel şema için Şekil 1'e bakın.
  5. Adım 2.3'te toplanan üç peptit fraksiyonunu 50 mM MOPS, 10 mM sodyum fosfat ve 50 mM NaCl (pH = 7,2) oluşan bir tamponun 1,4 mL'sinde çözün ve enkazı aşağı doğru döndürün.
  6. Kesirlerin süpernatantlarını diGly antikor boncuklarına ekleyin ve bir rotator ünitesinde 4 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın. Boncukları aşağı çevirin ve süpernatant'ı yeni bir antikor boncuk partisine aktarın ve 4 °C'de 2 saat boyunca tekrar kuluçkaya yatırın.
  7. Sonraki küresel proteom (GP) analizi için süpernatantları saklayın.
  8. Boncukları korumak için boncukları her fraksiyondan GF/F filtre fişi ile donatılmış 200 μL'lik pipet ucuna aktarın. Boncuklu pipet ucunu santrifüj ucu adaptörü ile donatılmış 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe koyun. Boncukları 3x 200 μL buz gibi IAP tamponu yla yıkayın ve daha sonra 3x 200 μL buz gibi miliQ H2O. Her yıkama adımından önce 2 00 x g'de 2 dk'da kolona doğru çevirin, ancak sütunun kurumasına izin vermemeye dikkat edin. %0,15 TFA'nın 50 μL'lik 2 döngüsü kullanılarak peptidleri eute.
  9. C18 kademeli uç (aslında iki C18 diskli 200 μL pipet ucu) kullanarak peptidleri tuzlayın ve vakum santrifüjü kullanarak tamlığa kadar kurulayın.

3. Nanoflow LC-MS/MS

  1. Nanoflow LC sistemine bağlı hassas bir kütle spektrometresi üzerinde LC-MS/MS deneyleri yapın.
  2. CSH130 reçine (3,5 μm, 130 Å) ile paketlenmiş 75 μm iç çapı ile bir şirket içi paketlenmiş 50 cm ters faz lı kolon kullanın ve 300 nL/dk'da 120 dk'nın üzerinde %2−28 (AcN, %0,1 FA) bir degrade ile peptidleri yakınlaştırın, alternatif olarak benzer özelliklere sahip ticari olarak mevcut LC sütunları kullanın. Sütunu bir sütun fırını kullanarak 50 °C'de tutun (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Kütle spektrometresi analizini yapın.
    1. Kütle spektrometresi veriye bağlı kazanım (DDA) modunda çalıştırılmalıdır. MS1 kütle spektrumları yüksek çözünürlükte (örn. 120.000), otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedef ayarı 4E5 ve Orbitrap kütle spektrometresi durumunda maksimum 50 ms enjeksiyon süresi ile toplanmalıdır.
    2. Önce "Önce En Yüksek Yoğunluk" modunda kütle spektrometresi analizini yapın. Bu şekilde, en yoğun iyon parçalanma için ilk seçilir, daha sonra ikinci en yüksek, ve benzeri, 3 s toplam çevrim süresi ile en yüksek hız yöntemi kullanılarak. Daha sonra, "Önce En Düşük Yoğunluklu" modunda ikinci bir DDA MS analizi turu gerçekleştirin, böylece en az yoğun iyon önce, sonra ikinci en düşük ve benzeri seçilir. Bu strateji, çok düşük bolluk peptidlerin en iyi şekilde algılanmasını sağlar.
    3. Öncül iyonları şarj durumlarına (2-7 şarj) ve monoizotopik atamaya göre filtreleyin. Daha önce sorgulanmış öncülleri 60 s. Dörtkutuplu kütle filtresi 1,6 Th genişliğe ayarlanmış peptid öncülerini izole edin.
    4. Maksimum enjeksiyon süresi 50 ms ve HCD çarpışma enerjisi %30 olan 7E3 AGC'de iyon kapanında MS2 spektrumlarını toplayın.

4. Veri analizi

  1. Andromeda arama motoru18,dayalı serbestçe kullanılabilir MaxQuant yazılım paketi gibi uygun bir arama motoru kullanarak kütle spektrometresi ham dosyaları analiz ,19. MaxQuant'ta, aşağıda belirtilen birkaç uyarlamaiçeren varsayılan ayarları seçin. Enzim özgüllüğünü tripsin olarak ayarlayın ve en fazla kaçırılan dekolte sayısı üçe yükseltilir. DiGly kalıntısı (+114.04 Da) ile lizin ayarlayın, metiyonin ve N-terminal asetilasyonunun oksidasyonu değişken modifikasyonlar olarak ve sistein karbamidometilasyonunu sabit bir modifikasyon olarak ayarlayın.
  2. Veritabanı aramalarını, örneğin, Tek prot deposu(https://www.uniprot.org/downloads)ile birlikte indirilen protein dizilerini içeren bir FASTA dosyasına karşı gerçekleştirin ve otomatik olarak MaxQuant tarafından sağlanan standart bir ortak kirletici veritabanıile birlikte yapın. Yanlış bulma oranını (FDR) %1'e ayarlayın ve değiştirilmiş (diGly) peptidler için minimum puanı 40 (varsayılan değer) olarak ayarlayın. C-terminal diGly modifiye lisin kalıntısı ile tanımlanan peptidleri daha ileri analizlerden dışlayın.
  3. SILAC deneme dosyalarının nicel analizi için, çokluğu "2" olarak ayarlayın ve 4.2 adımını yineleyin.
  4. MaxQuant yazılım paketinin Perseus modülü20 ile tüm downstream analizlerini (örn. istatistikler, gen ontoloji analizleri) gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ubikitinated proteinler, proteinler tripsin ile sindirildiğinde hedef lizin kalıntısında 114.04 Da diglycine kalıntısı bırakırlar. Bu motifin neden olduğu kütle farkı, bir kütle spektrometresi deneyinde her yerde bulunan yeri kesin olarak tanımak için kullanılmıştır. Burada tanımladığımız strateji, nanoflow LC-MS/MS(Şekil 1A)ile diGly peptidlerin zenginleşmesi ve sonraki tanımlaması için son teknoloji ürünü bir yöntemdir. Bu çalışmada, hem kü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, kültür hücreleri ve in vivo doku gibi çeşitli biyolojik kaynaklardan alınan örneklere uygulanmıştır. Her durumda, toplam protein giriş miktarının en az 1 mg olması koşuluyla binlerce diGly peptid tespit ettik. Spesifik antikorlar kullanılarak zenginleştirme, ubikitinated proteinler veya diGly peptidler için hiçbir zenginleştirme prosedürleri uygulanmış ise sadece en fazla 100-150 çok düşük bol diGly peptidler tüm hücre lysates tespit edildiği göz önüne alındığında, son derece etkilidir. Açıkças...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) tarafından Ulusal Yol Haritası Büyük Ölçekli Araştırma Tesisleri (proje numarası 184.032.201) kapsamında finanse edilen Hollanda Proteomik Merkezi'nin bir programı olan "Proteins at Work" projesinin bir parçasıdır. ).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,4-DitioeritritolSigma-AldrichD8255
3M Empore C18 Oktadesil disklerSupelco66883-Uürünü Supelco'da durduruldu; CDS Analitik, yeni üretici (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Amonyum formatSigma-Aldrich70221
BortezomibUBPbio
CSH130 reçinesi, 3.5 & m, 130 & Aring;Sular
Dimetilsülfoksit (DMSO)Sigma-Aldrich34869
DMEMThermoFisher
EASY-nanoLC 1200ThermoFisher
FBSGibco
GF / F filtre tapasıWhatman1825-021
İyodoasetamidSigma-AldrichI6125
Lizin, ArgininSigma-Aldrich
Lizin-8 (13< / sup>C6< / sub>; 15< / sup>N2< / sub>), Arginin-10 (13< sup>C6< / sub>; 15< / sup>N4< / sub>)Cambridge İzotop Laboratuvarları
Lizil Endopeptidaz (LysC)Wako Saf Kimyasallar129-02541
NanoLC fırınMPI tasarımı, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodyum tuzuSigma-AldrichL-5125
Orbitrap Fusion Lumos kütle spektrometresiThermoFisher
Pierce BCA Protein Test KitiThermoFisher / Pierce23225
PLRP-S (300 å, 50 &mikro; m) polimerik ters faz parçacıklarıAgilent TechnologiesPL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Kalıntı Motifi (K-ε-GG) KitiHücre Sinyalizasyon Teknolojileri5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac KartuşluSularWAT036790ile doldurmadan önce tC18 malzemesini kartuştan çıkarın
Tris-baseSigma-AldrichT6066
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Tripsin, TPCK TedaviEdilmiş ThermoFisher20233
Kartuşu PLRP-S Sodyum deoksikolat Sigma-Aldrich 30970

Kaynaklar

  1. Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
  2. Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
  3. Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
  4. Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
  5. Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
  6. Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
  7. Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
  8. Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
  9. Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
  10. Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
  11. Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
  12. Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284(2011).
  13. Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
  14. Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
  15. Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
  16. Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
  17. Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
  18. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  19. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  20. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
  21. Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
  22. Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
  23. Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
  24. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

DiGly Peptit TespitiY ksek pH FraksiyonlamaLC MS MS Analizimm nopurifikasyonOrbitrap AyarlarHeLa H cre LizatlarBeyin Dokusu rnekleri
Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.