Yöntem makalesi

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

DOI:

10.3791/59086

⸱

11 Nisan 2019

 ,  ,  , 
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) sistem doğal olarak bakteriyel edinilmiş bağışıklık fonksiyonları ama başarılı bir şekilde pek çok farklı canlıların genom mühendisliği için repurposed. En sık wildtype CRISPR 9 (Cas9) ilişkili veya Cas12a endonükleaz sonra homolog olmayan sonunda (NHEJ) yol veya onarım homoloji-yönetmen (katılma yolu ile DNA çift iplikçikli sonu onarılana genom, belirli sitelerde ayırmak için kullanılır Bir donör şablon olmasına bağlı olarak HDR) yolu yok veya sırasıyla mevcut. Bugüne kadar farklı bakteri türleri sistemlerden CRISPR genom memeli hücrelerinde düzenleme gerçekleştirme yeteneğine sahip olması gösterilmiştir. Ancak, teknoloji belirgin basitliğine rağmen birden çok tasarım parametrelerinin değerlendirilmesi, hakkında en iyi deneyler düzenleme onların genom taşımak için çapraşık kullanıcılar sık sık terk gerekir. Burada, tam bir iş akışı deneysel tasarım başarılı memeli hücre hatları deneylerde düzenleme genom yürütülmesini kolaylaştırmak amacı ile istenilen DNA değişiklikleri taşıyan Hücre klonlar tanımlaması için açıklamak. Biz kullanıcıların, dikkat çekmek kritik noktalar CRISPR sistem, rondela uzunluğu ve tek iplikçikli oligodeoxynucleotide (ssODN) donör şablonunun tasarımını seçimi de dahil olmak üzere vurgulayın. Biz bu iş akışı için gen nakavt çalışmaları, çabaları, modelleme hastalığı faydalı olacaktır veya satırları üretimi muhabiri hücre öngörülüyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hastalığa neden olan düzeltilmesi gibi birçok Biyomedikal ve Biyoteknolojik uygulamaları herhangi bir canlı organizma genom mühendis yeteneğine sahiptir mutasyonlar, hastalık çalışmalar için doğru hücresel modelleri inşaatı veya, tarımsal üretimi arzu edilen özellikleri ile bitkileri. Yüzyılın beri genom Mühendisliği dahil meganucleases1,2,3memeli hücrelerinde için çeşitli teknolojiler geliştirilmiştir, parmak nükleaz4,5, çinko veya Transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs)6

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. tasarım sgRNAs

  1. Uygun bir CRISPR-Cas sistemi seçin.
    1. İlk olarak, hedef bölge içinde memeli hücreleri16,21-32işlevsel olması için gösterilen tüm Cas9 ve Cas12a enzimler PAM dizisi için kontrol edin. Beş sık kullanılan enzimler Tablo 1 onların anılan sıraya göre PAMs birlikte verilmiştir.
      Not: yanında endonucleases Tablo 1' de listelenen, Streptococcus thermophilus (St1Cas9) üzerinden Cas9 nükleaz gibi memeli hücrelerinde de, başarılı bir şekilde dağıtılan daha az kullanılan diğer CA'lar enzimler vardır bu PAM NNAGAAW tanır. İstenen hedef site bilinen PAM içermiyorsa, o zaman bir genom mühendisl....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deney, ilgi odağı klonlanmış gerekiyor hedefleme bir sgRNA ifade CRISPR plazmid düzenleme genom gerçekleştirmek için. İlk olarak, plazmid bir kısıtlama bu linearize için enzim ile (genellikle bir türü IIS enzim) sindirilir. Bu % 1'özel jel ile birlikte komple ve Parsiyel sindirim arasında ayırt etmek için sindirilmemiş bir plazmid sindirilir ürünü gidermek için tavsiye edilir. Sindirilmemiş plazmid supercoiled olduğu gibi onlar doğrusallaştırılmış karşılıkları (bkz: Şekil 7bir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR-Cas sistemi genleri ve transcriptomes bitki ve hayvan Mühendisi için güçlü, devrimci bir teknolojidir. Çok sayıda bakteri türlerinin potansiyel olarak genom ve transcriptome amacıyla44mühendislik için adapte olabilir CRISPR-Cas sistemleri içeren tespit edilmiştir. Cas9 endonükleaz Streptococcus pyogenes (SpCas9) üzerinden diğer bakteriyel gelen enzimler insan hücreleri21,22,23,<.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet var mı mali çıkarlarının.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.H.T. bir ajans için bilim teknoloji ve araştırma'nın ortak Konseyi Office grant (1431AFG103) tarafından desteklenmektedir, Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi grant (OFIRG/0017/2016), Ulusal Araştırma Vakfı Hibe (NRF2013-THE001-046 ve NRF2013-THE001-093), bir Bakanlığı Eğitim Tier 1 verme (RG50/17 (S)), bir başlangıç Nanyang Teknoloji Üniversitesi ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi Uluslararası genetik mühendislik makine (IGEM) rekabet için para verin.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
T4 Polinükleotid Kinaz (PNK)NEBM0201
Karides Alkalin Fosfataz (rSAP)NEBM0371
Tris-Asetat-EDTA (TAE) Tamponu, 50X1. BazBUF-3000-50X4LKullanmadan önce 1X'e seyreltin. 1X çözeltisi 40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA içerir.
Tris-EDTA (TE) Tamponu, 10X1. BazBUF-3020-10X4LKullanmadan önce 1X'e seyreltin. 1X çözeltisi 10 mM Tris (pH 8.0) ve 1 mM EDTA içerir.
BbsINEBR0539
BsmBINEBR0580
T4 DNA LigazNEBM0202400.000 birim/ml
Hızlı Ligasyon KitiNEBM2200T4 DNA Ligaz'a bir alternatif.
Hızlı DNA Ligasyon KitiThermo ScientificK1423T4 DNA Ligaz'a bir alternatif.
Sıfır Künt TOPO PCR Klonlama KitiThermo Scientific451245Tuz çözeltisi, kit içerisinde TOPO vektörü ile birlikte gelir.
Gibson montajı içinNEBuilder HiFi DNA Montaj Master KarışımıNEBE2621L
Tek Atış Stbl3 Kimyasal Olarak Yetkin E.ColiTermo BilimselC737303
LB Suyu (Lennox), tozSigma AldrichL3022ddH20'da sulandırın ve kullanmadan önce otoklav
yapın LB Suyu ile Agar (Lennox), tozSigma AldrichL2897ddH20'da sulandırın ve SOC ortamını kullanmadan önce otoklavlayın
--2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 L LB Et Suyu
Ampisilin (Sodyum)Altın BiyoteknolojiA-301
REDiant 2X PCR Mastermix1. BazBIO-5185
Agaroz1. BazBIO-1000
T7 Endonükleaz INEBM0302
Plazmid DNA Ekstraksiyonu Miniprep KitiFavorgenFAPDE 300
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), Yüksek GlikozHiklonuSH30081.014.5 g / L Glikoz, L-glutamin yok, HEPES ve Sodyum Pirüvat
L-Glutamin, 200mMGibco25030
Penisilin-Streptomisin, 10, 000U / mLGibco15140
0.25 Tripsin-EDTA, 1XGibco25200
Fetal Sığır SerumHiklonSV30160FBS, kullanımdan önce 30 dakika boyunca 56 oC'de ısıyla inaktive edilir
. Fosfat Tamponlu Salin, 1XGibco20012
jetPRIME transfeksiyon reaktifiPolyplus Transfection114-75
QuickExtract DNA Ekstraksiyon Solüsyonu, 1.0EpicentreLUCG-QE09050
İzolat II Genomik DNA KitiBiolineBIO-52067QuickExtract
Q5 Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz'aNEBM0491
Deoksinükleotid (dNTP) Çözelti KarışımıNEBN0447
6X DNA YüklemeBoyası Thermo ScientificR061110 mM Tris-HCl (pH 7.6) %0.03 bromofenol mavisi, %0.03 ksilen siyanol FF, %60 gliserol, 60 mM EDTA
Proteaz İnhibitörü Kokteyli, Set3Merck
Nitroselüloz membran, 0.2 ve mikro; mBio-Rad1620112
Tris-glisin-SDS tamponu, 10XBio-Rad1610772Kullanmadan önce 1X'e seyreltin. 1x çözelti 25 mM Tris, 192 mM glisin ve% 0.1 SDS içerir.
Tris-glisin tamponu, 10X1. bazBUF-2020Kullanmadan önce 1X'e seyreltin. 1x çözeltisi 25 mM Tris ve 192 mM glisin içerir.
Ponceau S çözeltisiSigma AldrichP7170
TBS, 20X1. bazBUF-3030Kullanmadan önce 1X'e seyreltin. 1x çözelti 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 150 mM NaCl içerir.
Tween 20Sigma AldrichP9416
İmmünoassay için Yağsız SütNacalai Tesque31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRPAdvanstaK12043
β-aktin (C4) için antikor,Santa Cruz Biyoteknolojisc-47778Lot numarası: C0916
MiSeq sistemiIlluminaSY-410-1003
NanoDrop spektrofotometreThermo ScientificND-2000
Qubit florometreThermo ScientificQ33226
EVOS FL Hücre Görüntüleme SistemiThermo ScientificAMF4300
CRISPR plazmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138Tek vektör sistemi: gRNA aynı plazmitten eksprese edilir.
CRISPR plazmidi: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpAAddgene61591Tek vektör sistemi: gRNA aynı plazmitten ifade edilir.
CRISPR plazmidi: xCas9 3.7Addgene108379Çift vektör sistemi: gRNA, farklı bir plazmitten eksprese edilir.
CRISPR plazmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9Addgene42230Tek vektör sistemi: gRNA aynı plazmitten eksprese edilir.
CRISPR plazmidi: hCas9Addgene41815Çift vektör sistemi: gRNA, farklı bir plazmitten eksprese edilir.
CRISPR plazmidi: eSpCas9(1.1)Addgene71814Tek vektör sistemi: gRNA aynı plazmitten eksprese edilir.
CRISPR plazmidi: VP12 (SpCas9-HF1)Addgene72247Çift vektör sistemi: gRNA, farklı bir plazmitten eksprese edilir.
Kiti. içinde 20 mM glikoz, USP Sınıfı % bir alternatif 539134

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
  2. Arnould, S., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CRISPR Cas9Memeli H crelerH cre TransfeksiyonuAk SitometrisiT7 Endon kleaz AnaliziKoloni PCRWestern BlotDNA EkstraksiyonuH cre Klonlama

İlgili makaleler