Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Summary

Bu iletişim kuralı genom genelindeki değişiklikleri Histon translasyonel modifikasyonlar ALS ve Parkinson hastalığı ile ilişkili proteinlerin overexpression ile bağlantılı olarak meydana gelen (PTM) düzeyde karakterize etmek için deneysel prosedürler özetliyor Saccharomyces cerevisiae modelleri. SDS-sayfa ayrılıktan sonra bireysel Histon PTM düzeyleri batı kurutma yoluyla değişiklik özel antikorlar ile tespit edilir.

Abstract

Nörodejeneratif hastalıklar, amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Parkinson hastalığı (PD), gibi yüz binlerce her yıl hayatını kaybına neden olur. Etkili tedavi seçenekleri hastalığın ilerlemesini durdurmak için eksik vardır. Büyük hasta nüfus kapsamlı sıralama çabalarına rağmen ALS ve PD vakaların çoğunluğu tarafından Genetik mutasyonlar yalnız açıklanamayan kalır. Histon proteinleri translasyonel modifikasyon gibi epigenetik mekanizmalar nörodejeneratif hastalık etyoloji ve ilerleme içinde tutulabilir ve ilaç müdahale için yeni hedefler için yol. ALS ve PD memeli içinde vivo ve tüp bebek modelleri pahalı ve genellikle uzun ve zahmetli deneysel protokol gerektirir. Burada, genom genelindeki değişiklikler Histon değişiklik düzeylerinde Saccharomyces cerevisiae bir model sistem kullanarak belirlemek için pratik, hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşım anahat. Bu iletişim kuralı epigenetik değişiklikleri ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde genişletilirken farklı model sistemlerinde önceki bulguları teyit nörodejeneratif proteinopathies bağlı kapsamlı soruşturma için izin verir nörodejeneratif hastalık epigenome.

Introduction

Nörodejeneratif hastalıklar yıkıcı hastalıklar için tedavi seçenekleri yoktur çok az vardır. Bunlar arasında amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Parkinson hastalığı (PD) özellikle korkunç. ALS ve PD olguların yaklaşık % 90 iken kalan servis taleplerini ailelerde çalıştırmak ve genellikle için belirli bir gen mutasyon^1,2bağlı olan hastalığı aile öyküsü meydana gelen sporadik olarak kabul edilir. İlginçtir, bu hastalıkların her ikisi de protein mislocalization ve toplama^3,4,5,6ile iliş....

Protocol

1. dönüştürme S. cerevisiae nörodejeneratif proteinopathy ilişkili protein yapıları ile

1. Vahşi türü (WT) 303 Maya Maya özü pepton dekstroz (YPD) suyu (200 devir/dakika) 30 ° C'de sallayarak ile bir gecede büyümek
2. Maya 600 optik bir yoğunluk için büyüme s 12−16 sonra seyreltik nm (OD₆₀₀) 0,25 YPD ile. Maya sıvı kültürünün 10 mL her dönüşüm için gerekli olacak gibi beş dönüşümleri FUS, TDP-43, a-synuclein ve vektör tek (ccdB) yapıları, hem hem için negatif kontrol dönüşümü karşılık gelen 50 mL sıvı Maya kültür hazırlamak DNA.
3. 0,60 ve 0.80 arasında bir OD₆₀₀ ulaşılana kadar Maya ajitasyon 30 ° c ile büyümek. Bu ....

Results

Bu yöntem göstermek için biz kısa bir süre önce sonuçları³⁰yararlanabilecek. WT α-synuclein için 8 h overexpressed iken WT insan FUS ve TDP-43 5 h için overexpressed. Bir ccdB yapı bir vektör negatif kontrol kullanıldı. Şekil 2 katı ve sıvı kültürlerde büyüme bastırma gösterir. Maya açıklandığı gibi hasat ve Western Blot değişiklik özel antikorlar ile gerçekleştirildi. Anti-toplam H3 yükleme denetimi olarak kullanıldı. H3S10ph ve H3K14.......

Discussion

Burada açıklanan protokol genom çapında Histon PTM değişiklikleri nörodejeneratif proteinopathies ile ilişkili kategorilere, basit, uygun ve uygun maliyetli bir yolu sağlar. ALS ve PD diğer modelleri olmakla birlikte, vitro gibi insan hücre satırları ve fare modelleri³², S. cerevisiae kalır kullanım kolaylığı nedeniyle çekici. Örneğin, Maya modelleri steril bir başlık kullanılması gerekli değil, ne de onlar eğitim yoğun hücre kültür çalışmalar ile birlikte gider gerekli. Ayrıca, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
-His DO Supplement	Clontech	630415
10x Running Buffer			Mix: 141.65 g glisin (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma bazı (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodyum dodesil sülfat (Sigma-Aldrich L3771) ve 1 L deiyonize su, pH 8.8.
%12 Poliakrilamid Jeller	BIO-RAD	456-1041
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Anti-asetil-Histon H3 (Lys14) Primer Antikor	MilliporeSigma	07-353 (Lot No. 2762291)	Seyreltme: 1/1000
Anti-asetil-Histon H4 (Lys 16) Primer Antikor	Abcam	ab109463 (Lot No. GR187780)	Seyreltme: 1/2000
Anti-asetil-Histon H4 (Lys12) Primer	Antikor Abcam	ab46983 (Lot No. GR71882)	Seyreltme: 1/5000
Anti-dimetil-Histon H3 (Lys36) Primer	Antikor Abcam	ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)	Seyreltme: 1/1000
Anti-Histon H3 Primer Antikor	Abcam	ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)	Nükleer Yükleme Kontrolü; Seyreltme: 1/2000
Anti-fosfo-Histon H2B (Thr129) Primer Antikor	Abcam	ab188292 (Lot No. GR211874)	Seyreltme: 1/1000
Anti-fosfo-histon H3 (Ser10) Primer Antikor	Abcam	ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)	Seyreltme: 1/1000
Biyofotometre D30	Eppendorf	6133000010
Hücre Kültürü Kabı (100 x 20 mm)	Eppendorf	30702118
Hücre Kültürü Plakası, 96 kuyulu	Eppendorf	30730011
Santrifüj 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
Eşek Anti-Fare IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (Parti No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Seyreltme: 1/5000
Eşek Anti-Tavşan IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	Seyreltme: 1/2500
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Ekstra kalın leke kağıdı (filtre kağıdı)	BIO-RAD	1703968
Galaktoz	Sigma-Aldrich	G0750	%20 w/v stok çözeltisi hazırlayın.
Glikoz	Sigma-Aldrich	G8270	%20 w/v stok çözeltisi hazırlayın.
Gliserol	Sigma-Aldrich	G5516	%50 w/v çözelti hazırlayın.
Immobilon-FL Transfer Membranları	MilliporeSigma	IPFL00010
Lityum asetat dihidrat (LiAc)	Sigma-Aldrich	L4158	1 M'lik bir çözelti hazırlayın.
Yükleme Boya			Karışımı: 1.2 g sodyum dodesil sülfat, 6 mg bromofenol mavisi (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL gliserol, 1.2 mL 0.5M Trizma baz pH 6.8, 0.93 g DL-Ditiyotreitol (Sigma-Aldrich D0632) ve 2.1 mL deiyonize su.
Metanol	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Dikey Elektroforez Hücresi	BIO-RAD	1658004
Çok Kanallı Pipet	Eppendorf	2231300045
NEB Kısıtlama Enzim Tamponu 2.1, 10x	New England Bio Labs	102855-152
Nhe I Kısıtlama Enzimi	New England Bio Labs	101228-710
Nükleaz İçermeyen Su	Qiagen	129114
Odyssey Fc Görüntüleme Sistemi	LI-COR Biosciences	2800-03
OmniTray Hücre Kültürü İşlenmiş, Kapaklı Steril, PS (86 x 128 mm)	ThermoFisher	165218
pAG303GAL-a-sinüklein-GFP	A. Gitler'den
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	A. Gitler'den
Poly (etilen glikol) (PEG)	Sigma-Aldrich	P4338	% 50 w / v çözeltisi hazırlayın.
Ponceau S Stain	Sigma-Aldrich	P3504	Karışımı: 0,5 g %0,1 w/w Ponceau S boyası, 5 mL %1 v/v asetik asit (Sigma-Aldrich 320099) ve 500 mL deiyonize su.
PowerPac Temel Güç Kaynağı	BIO-RAD	164-5050
Rafinoz pentahidrat	Sigma-Aldrich	R7630	%10 w/v stok çözeltisi hazırlayın.
Somon Sperm DNA'sı	Agilent Tech	201190
SD-His plakaları			Karışımı: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO takviyesi, 6.7 g maya Azot Bazı, amino asitler olmadan (ThermoFisher 291920) ve 900 mL deiyonize su.
SGal-His plates			Karışımı: 20 g Agar, 0.77 g -His DO takviyesi, 6.7 g maya Azot Bazı, amino asitler olmadan, 100 mL galaktoz çözeltisi ve 900 mL deiyonize su.
Sodyum dodesil sülfat Yükleme Tamponu			-20 oC'de saklayın. 6X, Karışım: 1.2 g sodyum dodesil sülfat, 6 mg bromofenol mavisi, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deiyonize su, 4.7 mL gliserol ve 1.2 mL 0.5 M Trizma bazı, pH 6.8.
Sodyum hidroksit	Sigma-Aldrich	221465	0.2 M çözelti hazırlayın.
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097	%20 w/v stok çözeltisi hazırlayın.
TBS +% 0.1 Tween 20 (TBST)			Karışım: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) ve 900 mL deiyonize su.
TBS Engelleme Tamponu	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD Yarı Kuru Elektroforetik Transfer Hücresi	BIO-RAD	170-3940
Transfer Tamponu			Karışımı: 22,5 g glisin, 4,84 g Tizma bazı, 400 mL metanol, 1 g sodyum dodesil sülfat ve 1,6 L deiyonize su.
Tris-Tamponlu Tuzlu Su (TBS)			10X, 7.6 pH, Çözelti: 24 g Trizma bazı ve 88 g sodyum klorür (Sigma-Aldrich S7653) karıştırın. Deiyonize su ile 1 L'ye kadar doldurun.
WT 303 S. cerevisiae maya	J. Shorter
Maya Özü Pepton Dekstroz (YPD)	Sigma-Aldrich	Y1375'ten